王路廣 戴琳玉 閆宇 肖永紅

1華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（河北唐山063210）；2 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院（天津300211）

多種因素引發(fā)肝臟慢性損傷后產(chǎn)生的代償性修復(fù)反應(yīng)稱為肝纖維化[1]。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化在肝纖維化的進(jìn)展中起重要作用，導(dǎo)致膠原生成、沉積形成肝纖維化，進(jìn)一步發(fā)展到肝硬化。因此，延遲活化的HSC的增殖和誘導(dǎo)其凋亡是阻斷、抑制或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的治療策略[2]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是刺激HSC 活化、增殖的促纖維化細(xì)胞因子之一，可以促進(jìn)鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（calmodulin kinase Ⅱ，CaMK Ⅱ）mRNA 以及磷酸化的CaMKII表達(dá)，增加細(xì)胞外基質(zhì)及膠原蛋白合成[3-4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）為各類器官纖維化發(fā)病機(jī)制中的信號(hào)串聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其介導(dǎo)的凋亡途徑是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新的凋亡途徑[5]。CaMKⅡ是一種功能多樣的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過(guò)調(diào)節(jié)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員，充當(dāng)ERS和相關(guān)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)，在體內(nèi)廣泛參與細(xì)胞生理功能調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、凋亡等[6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)CaMKⅡ的激活有效改善了心肌、肺、腎臟以及口腔黏膜等纖維化的發(fā)生發(fā)展[7-10]，對(duì)肝纖維化的進(jìn)展亦有阻逆作用[11]，然而具體作用機(jī)制復(fù)雜，是否引發(fā)了ERS 凋亡途徑從而影響HSC的增殖和激活，目前尚不清楚。故本研究應(yīng)用CaMKⅡ抑制劑KN62 作用TGF-β1刺激的HSC，探討其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響及可能的機(jī)制，以尋找防治肝纖維化新的途徑。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑LX2 人肝星形細(xì)胞（LX2-HSC）（上海美軒生物科技有限公司）；KN62 粉末購(gòu)自美國(guó)Apexbio公司，胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)BI公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、TGF-β1（批號(hào)：PHG 9204）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，青霉素、鏈霉素混合液（雙抗）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（CCK-8）、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒均購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司，一步TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司，蛋白酶抑制劑、RIPA 裂解液購(gòu)自武漢貝博生物公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物公司，兔抗CaMKII多克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗Bax 單克隆抗體、兔抗caspase-12多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Arigo公司，兔抗β-actin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)ABclonal公司，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗兔IgG（H+L）購(gòu)自美國(guó)KPL公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將存放于液氮中的LX2-HSC細(xì)胞復(fù)蘇、傳代，于含有各100 U/mL 青霉素、鏈霉素、10%血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)，隔天換液。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，胰蛋白酶進(jìn)行傳代并進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞的增殖選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX2細(xì)胞，0.25%胰酶消化離心，以1×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔100 μL，細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)24 h，更換無(wú)血清培養(yǎng)液過(guò)夜，分別加入1、5、10、20 μmol/L KN62，各培養(yǎng)1、3、6、12、24 h后，每孔加入10 μL CCK8 溶液培養(yǎng)3 h，于450 nm 下測(cè)定各孔吸光值（OD），重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)增殖率（relative growth rate，RGR）。RGR=藥物組OD值/對(duì)照組OD值×100%

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為5 組：空白對(duì)照組、TGF-β1組、低、中、高濃度KN62+ TGF-β1組?？瞻讓?duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，TGF-β1組加入5 ng/mL TGF-β1作用24 h，低、中、高濃度KN62+TGF-β1組分別用1、5、10 μmol/L KN62 作用6 h，再加入5 ng/mL TGF-β1作用細(xì)胞24 h，用上述方法檢測(cè)不同處理組細(xì)胞增殖情況。

1.4 TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX2細(xì)胞以2.5×105/mL 接種于24孔板中，每孔500 μL，進(jìn)行不同分組方法處理后，用4%多聚甲醛常溫下固定細(xì)胞30 min，用PBS 洗滌1次。在樣本上滴加適量Proteinase K（20 μg/mL），室溫孵育5 min。嚴(yán)格按照TUNEL 凋亡試劑盒的具體要求操作，于熒光顯微鏡下觀察、拍照，計(jì)算出各組凋亡陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)及凋亡細(xì)胞率，紅色為已凋亡細(xì)胞之細(xì)胞核，藍(lán)色則為尚未凋亡細(xì)胞之細(xì)胞核，然后計(jì)算出各組細(xì)胞的凋亡率。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 Western Blot 法檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況細(xì)胞經(jīng)分組及處理后，預(yù)冷的PBS清洗3遍，加入細(xì)胞裂解液（蛋白酶抑制劑：RIPA 裂解液=1∶250）200 μL，冰上裂解細(xì)胞30 min后提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，100℃干式恒溫器中加熱10 min，置于-20℃?zhèn)溆?。配?2% SDSPAGE 凝膠，蛋白上樣量統(tǒng)一為20 μg，進(jìn)行電泳。濕轉(zhuǎn)1 h，封閉完成后，一抗稀釋液4℃震蕩過(guò)夜，TBST 溶液清洗3次，二抗HRP 標(biāo)記抗兔IgG（H+L）稀釋液37℃孵育1 h，TBST 溶液清洗3次。ECL 發(fā)光劑A、B 等量混合，每個(gè)條帶100 μL檢測(cè)條帶，凝膠成像儀觀察蛋白的表達(dá)。采用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，計(jì)算各組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，多組均數(shù)比較用F分析，兩兩均數(shù)比較用LST檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度KN62 作用不同時(shí)間LX2-HSC細(xì)胞增殖情況作用1 h，各處理組細(xì)胞OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.778，P＞0.05），作用3 h，不同濃度組OD值差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），作用6 h后各時(shí)間點(diǎn)，不同濃度KN62 處理組OD值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），但10 μmol/L 與20 μmol/L KN62 組OD值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；10 μmol/L KN62 作用12、24 h后，細(xì)胞OD值與6 h比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 不同濃度KN62 作用不同時(shí)間對(duì)人HSC 增殖的影響Fig.1 Effect of different concentration KN62 on the proliferation of human hepatic stellate cells at different time

2.2 不同處理組LX2-HSC細(xì)胞增殖情況不同處理組LX2 增殖率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=80.070，P＜0.001）。與空白對(duì)照組相比，TGF-β1組LX2增殖率明顯升高（P＜0.001），不同濃度KN62 處理組與TGF-β1組比較，增殖率降低，且隨著KN62濃度增加，增殖率下降（P＜0.05，表1）。

表1 不同處理組人HSC細(xì)胞增殖情況Tab.1 The proliferation of hepatic stellate cell in different treatment groups±s

表1 不同處理組人HSC細(xì)胞增殖情況Tab.1 The proliferation of hepatic stellate cell in different treatment groups±s

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與TGF-β1組比較，#P ＜0.05；與KN62 低濃度+TGF-β1組比較，□P ＜0.05；與KN62 中濃度+TGF-β1組比較，△P ＜0.05

組別空白對(duì)照組TGF-β1組KN62 低濃度+TGF-β1組KN62 中濃度+TGF-β1組KN62 高濃度+TGF-β1組例數(shù)3 3 3 3 3 OD 值0.822±0.053 0.972±0.047* 0.674±0.063*# 0.552±0.038*#□ 0.409±0.035*#□△ RGR（%）100.0 119.0 82.3 67.4 50.1 F 值80.070 P 值＜0.001

2.3 不同處理組LX2-HSC 凋亡情況不同處理組LX2 凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=73.199，P＜0.001）。TGF-β1組與空白對(duì)照組比較，LX2細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；低、中、高濃度KN62 處理組細(xì)胞凋亡率較TGF-β1組顯著升高（P＜0.05），隨KN62 濃度的增加，LX2的細(xì)胞凋亡率增高（P＜0.001，圖2、表2）。

表2 不同處理組人HSC 凋亡情況Tab.2 The apoptosis changes of human hepatic stellate cell in different treatment groups ±s

表2 不同處理組人HSC 凋亡情況Tab.2 The apoptosis changes of human hepatic stellate cell in different treatment groups ±s

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與TGF-β1組比較，#P ＜0.05；與KN62 低濃度+TGF-β1組比，□P ＜0.05；與KN62 中濃度+TGF-β1組比較，△P ＜0.05

組別空白對(duì)照組TGF-β1組KN62 低濃度+TGF-β1組KN62 中濃度+TGF-β1組KN62 高濃度+TGF-β1組例數(shù)3 3 3 3 3凋亡率（%）13.6±2.6 13.5±2.3 30.8±6.1*# 54.5±4.5*#□ 75.7±5.6*#□△ F 值73.199 P 值＜0.001

2.4 不同處理組LX2-HSC內(nèi)CaMKⅡ蛋白的表達(dá)不同處理組細(xì)胞中CaMKⅡ的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=84.355，P＜0.001）。與空白對(duì)照組比較，TGF-β1組CaMKⅡ蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與TGF-β1組比較，不同濃度KN62 處理組細(xì)胞中CaMKⅡ蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05），且隨濃度增加，CaMKⅡ蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖3）。

2.5 不同處理組LX2-HSC內(nèi)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)不同處理組細(xì)胞中Bcl-2及Bax的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=110.896，P＜0.001；F=156.086，P＜0.001）。與空白對(duì)照組和TGF-β1組相比，不同濃度KN62 處理組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)明顯均減少（P＜0.001），Bax蛋白表達(dá)均明顯增加，且Bcl-2/Bax的比值顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，圖4）。

2.6 不同處理組LX2-HSC內(nèi)caspase-12蛋白的表達(dá)不同處理組細(xì)胞中procaspase-12和cleaved caspase-12的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=115.654，P＜0.001；F=217.927，P＜0.001）。不同濃度KN62 處理組與TGF-β1組比較，procaspase-12和cleaved caspase-12蛋白表達(dá)增高（P＜0.001），且隨KN62 濃度的增加，LX2的細(xì)胞中procaspase-12和cleaved caspase-12蛋白表達(dá)升高（P＜0.001，圖5）。

3 討論

圖2 不同處理組人HSC 凋亡情況Fig.2 The apoptosis changes of human hepatic stellate cell in different treatment groups

目前認(rèn)為，TGF-β1為肝臟中最強(qiáng)的促纖維化因子[12]。研究[13]表明，抑制TGF-β1及阻止CaMKⅡ的激活后消除了TGF-β刺激的膠原蛋白、纖連蛋白和α平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。CaMKⅡ的表達(dá)及其活性在介導(dǎo)ERS凋亡途徑中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，且參與多種器官纖維化的發(fā)生發(fā)展[14-15]。BIAN 等[16]發(fā)現(xiàn)，由四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中，ERS 調(diào)控細(xì)胞凋亡時(shí)，通過(guò)ERS 相關(guān)蛋白及肝纖維化因子表達(dá)等影響肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程。為此，本研究應(yīng)用CaMKⅡ抑制劑KN62 作用于TGF-β1刺激的LX2，探討CaMKⅡ在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中能否介導(dǎo)ERS 凋亡途徑進(jìn)而影響HSC 增殖及凋亡過(guò)程。

ZHAO 等[17]發(fā)現(xiàn)，CaMKⅡ在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中具有重要的生理調(diào)節(jié)功能，抑制其活性后，顯著降低了內(nèi)皮細(xì)胞增殖。LUO 等[18]報(bào)道，在CaMKⅡ抑制劑KN62的作用下減弱了去甲腎上腺素誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。本研究顯示，1、5、10 μmol/L KN62均能抑制細(xì)胞增殖，隨KN62濃度的增加增殖率降低。表明KN62能夠抑制TGF-β1刺激的LX2細(xì)胞增殖，提示CaMK II參與HSC的增殖調(diào)控過(guò)程，其特異性抑制劑KN62可以阻抑LX2細(xì)胞增殖。

Bcl-2是重要的抑制凋亡蛋白，Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要分子，Bcl-2和Bax 兩種凋亡調(diào)控蛋

圖3 不同處理組人HSC 中CaMKII蛋白的表達(dá)Fig.3 The expressions of CaMKII in human hepatic stellate cell different groups

圖4 不同處理組人HSC 中Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)Fig.4 The expressions of Bcl-2 and Bax in human hepatic stellate cell different groups

圖5 不同處理組人HSC 中caspase-12蛋白的表達(dá)Fig.5 The expressions of caspase-12 in human hepatic stellate cell different groups

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與TGF-β1組比較，#P＜0.05；與KN62 低濃度+TGF-β1組比較，□P＜0.05；與KN62 中濃度+TGF-β1組比較，△P＜0.05白保持平衡狀態(tài)，是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵[19]。有報(bào)道[20-21]，HSC 中Bcl-2和Bax在肝纖維化和慢性肝病的發(fā)展進(jìn)程中都發(fā)揮了重要作用，但具體作用機(jī)制尚不明確。而MIN 等[22]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制CaMKⅡ的磷酸化來(lái)抑制新生兒缺氧缺血性神經(jīng)元損傷中的促凋亡信號(hào)通路，可增加Bcl-2/Bax蛋白比值。本研究結(jié)果顯示，不同KN62藥物濃度處理組CaMKⅡ的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組和TGF-β1組，Bax蛋白表達(dá)均顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)則明顯降低，且隨藥物濃度增加Bcl-2/Bax的比值隨之減少，提示誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。從本研究細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)也可看出不同KN62 藥物濃度處理組均明顯促進(jìn)了LX2細(xì)胞凋亡，且隨KN62 濃度的增加，LX2的細(xì)胞凋亡率增高，說(shuō)明抑制CaMKⅡ表達(dá)后可以促進(jìn)TGF-β1刺激的LX2細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而延緩肝纖維化的發(fā)展。

本課題組之前通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)ERS可以促進(jìn)HSC細(xì)胞凋亡，改善肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程[23]。Caspase-12是caspase 家族中僅在ERS 通路中被活化的促凋亡蛋白，ERS 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，caspase-12表達(dá)上調(diào)，激活促細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，啟動(dòng)凋亡反應(yīng)[24]。Caspase-12 本身以無(wú)活性的酶原形式procaspase-12存在，激活后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腸leaved caspase-12。ERS 早期通過(guò)誘導(dǎo)未折疊蛋白應(yīng)答恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起保護(hù)作用，procaspase-12蛋白表達(dá)增加；隨著ERS 時(shí)間延長(zhǎng)，cleaved caspase-12蛋白表達(dá)增加，從而誘導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡。本研究中，隨著CaMKⅡ抑制劑KN62 濃度的增加，procaspase-12及cleaved caspase-12蛋白表達(dá)增加，且明顯高于空白對(duì)照組和TGF-β1組，表明KN62 增加了促凋亡蛋白caspase-12的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ抑制劑KN62 能夠抑制LX2 增殖并誘導(dǎo)其凋亡，可能與caspase-12 依賴性ERS 途徑有關(guān)，提示抑制CaMKⅡ其表達(dá)可能參與介導(dǎo)ERS 而使HSC 進(jìn)入凋亡程序，以有效改善肝纖維化，可為臨床肝纖維化治療提供新的作用靶點(diǎn)。但本實(shí)驗(yàn)僅探討了CaMKⅡ在抗纖維化的可能作用機(jī)制，有關(guān)抑制CaMKⅡ介導(dǎo)ERS 何種途徑促進(jìn)HSC 凋亡，以及CaMKⅡ抑制劑對(duì)ERS 凋亡途徑的確切作用機(jī)制接下來(lái)將做進(jìn)一步研究。