張晨紅 章禮久 宋莎莎

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（合肥230601）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第二大常見原因[1]，在我國(guó)位居惡性腫瘤病死率第5位[2]，近年來其發(fā)病率及病死率均呈上升趨勢(shì)，其發(fā)病機(jī)制尚未明了。近年來許多研究提示細(xì)胞自噬與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]，已成為腫瘤防治領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)。細(xì)胞自噬受多種自噬相關(guān)基因的調(diào)控，這些自噬相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展階段起著重要的作用。其中Beclin1、p62是近幾年研究較多的與自噬有關(guān)的蛋白。Beclin 1 基因?qū)儆谧允上嚓P(guān)基因，由其編碼的Beclin1蛋白，是調(diào)節(jié)自噬的蛋白，通過與Class ⅢPI3K 相結(jié)合來介導(dǎo)自噬體的形成[4]。研究顯示Beclin1表達(dá)異常與胃癌、肺癌、宮頸癌的發(fā)生有關(guān)[5-9]。p62是一種重要的自噬底物蛋白，主要功能是參與蛋白泛素化及衰老、受損細(xì)胞器的循環(huán)周轉(zhuǎn)，p62 異常累積提示細(xì)胞受損[10]，很多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與p62的表達(dá)異常關(guān)系密切[11]。本次研究通過檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1和p62在結(jié)直腸癌和癌旁黏膜組織中的表達(dá)，判斷自噬活性在腫瘤中的高低，并結(jié)合相關(guān)臨床及病理資料進(jìn)行分析，探討自噬與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的早期診斷、惡性程度判定、預(yù)后評(píng)估等提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集78例2018年1月至2019年2月于安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科行手術(shù)切除治療的結(jié)直腸癌患者的組織標(biāo)本，并獲取癌旁黏膜組織標(biāo)本（距結(jié)直腸癌病灶位置＞5 cm）作為對(duì)照組。其中男47例，女31例；年齡45～80歲，平均年齡（61.2±4.2）歲。所有病例術(shù)前均未行任何放、化療，并且無合并其他部位惡性腫瘤。組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定保存。

1.2 主要試劑Beclin1 兔多克隆抗體、p62 鼠單克隆抗體，購(gòu)于美國(guó)AB-CAM公司。三步法免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB 顯色試劑盒，均購(gòu)于北京中杉公司。

1.3 免疫組化染色采用免疫化學(xué)組織SP 法。組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定后行組織切片。二甲苯脫蠟至水：依次80%，90%，100%二甲苯及乙醇各7 min，然后水洗。將切片置于3%H2O2、室溫10 min 以滅活內(nèi)源性酶后蒸餾水洗3次。將切片浸入PBS（pH7.2-7.6），枸櫞酸或EDTA（PH8.0），微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔10 min后，反復(fù)2次，自然冷卻至室溫。滴加5%BSA 封閉液，37℃孵育30 min后甩去多余液體，不洗。滴加稀釋的一抗（PBS 或?qū)ｉT的一抗稀釋液），37℃孵育2 h后PBS（pH7.2～7.6）洗5 min×3次。滴加相應(yīng)的二抗，37℃孵育30 min后PBS（pH7.2～7.6）洗5 min× 3次。滴 加SABC，37℃孵 育30 min后PBS（pH7.2～7.6）洗5 min × 4次。DAB 顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在15 min 以內(nèi)，后蒸餾水洗滌。蘇木素輕度復(fù)染1 min，返藍(lán)，烘干后中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。

1.4 免疫組化染色結(jié)果判定根據(jù)染色陽性細(xì)胞百分比和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度兩項(xiàng)評(píng)分綜合判斷結(jié)果。陽性細(xì)胞百分比：無陽性為0 分，0%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，≥76%為4 分。染色強(qiáng)度按顏色深淺計(jì)分：無著色為0分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。兩項(xiàng)相加為綜合評(píng)分：0 分為陰性，1～2 分為弱陽性（+），3～4 分為中度陽性（++），5～6 分為強(qiáng)陽性（+++）。將上述兩者得分相乘≤2為陰性，＞2為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以α =0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Beclin1、p62在結(jié)直腸癌和癌旁組織中的表達(dá)Beclin1在結(jié)直腸癌和癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為29.5%（23/78）、71.8%（56/78），p62的陽性表達(dá)率分別為52.6%（41/78）、23.1%（18/78）。Beclin1在結(jié)直腸癌中的陽性表達(dá)率顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。p62在結(jié)直腸癌中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

2.2 Beclin1、p62的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系由表2可知，Beclin1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與患者的性別、年齡、組織學(xué)分型、分化程度無關(guān)（P＞0.05），而與結(jié)直腸癌的腸壁浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。在腸壁浸潤(rùn)深度T1～T2 期中Beclin1的陽性表達(dá)率為39.1%（18/46），T3～T4 期中Beclin1的陽性表達(dá)率為14.3%（5/32），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.015，P=0.025）；在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中Beclin1的陽性表達(dá)率為40.4%（21/52），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中Beclin1的陽性表達(dá)率為7.7%（2/26），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.910，P=0.003），提示Beclin1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與腸壁浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈負(fù)相關(guān)。p62在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與性別、年齡、組織學(xué)分型、分化程度、腸壁浸潤(rùn)深度無關(guān)，而與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中p62的陽性表達(dá)率為34.6%（18/52），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中p62的陽性表達(dá)率達(dá)88.5%（23/26），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.156，P= 0.000），提示p62在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)。

圖1 免疫組織化學(xué)結(jié)果（SP 400×）Fig.1 Immunohistochemistry staining

表2 Beclin1、p62的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系Tab.2 Relationship between expression of Beclin1 and p62 and clinicopathological parameters of colorectal cancer例（%）

3 討論

自噬是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因（autophagy related gene，ATG）的調(diào)控下利用溶酶體對(duì)自身“異常結(jié)構(gòu)”（如衰老的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及異常蛋白質(zhì)等）進(jìn)行消化降解的過程，為細(xì)胞代謝循環(huán)及細(xì)胞器更新提供原料和能量，它是細(xì)胞適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境所需的基本調(diào)節(jié)方式，在維護(hù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要的作用，自噬水平的異?？赡軙?huì)打破細(xì)胞原有的平衡狀態(tài)，從而引發(fā)腫瘤等疾病。自噬在腫瘤的研究中引起關(guān)注最早是1998年研究發(fā)現(xiàn)Beclin1 基因在腫瘤組織中表達(dá)的缺失。Beclin1 基因是一種自噬相關(guān)基因，定位于人染色體17q21上，分子量為150 kb[12]。自噬相關(guān)蛋白Beclin1是腫瘤細(xì)胞凋亡、分化和自噬間銜接的重要分子，主要作用于自噬活性激活的細(xì)胞程序性死亡的過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[13]。有研究指出Beclin1是局部晚期結(jié)腸癌預(yù)后的重要分子標(biāo)記物[14]。p62是C-myc基因的外顯子2和3共同編碼的由439個(gè)氨基酸組成的一個(gè)分子量為62 kD的磷酸化蛋白[15]，也是哺乳動(dòng)物選擇性自噬過程中的特異性底物及調(diào)節(jié)蛋白[16]，在胃腸道腫瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌和子宮頸癌等腫瘤中都檢測(cè)到了p62的異常累集。細(xì)胞內(nèi)p62 異常累集可以激活癌基因信號(hào)，起到促癌作用，還可以激活核因子相關(guān)因子-2（Nfr2）和核因子-кB（NF-кB）這兩個(gè)活性氧清除系統(tǒng)，使得癌細(xì)胞生存能力變強(qiáng)[17]。

本研究顯示Beclin1在結(jié)直腸癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，說明在腫瘤細(xì)胞中自噬活性降低。自噬活性降低可以引起自噬底物p62的大量聚集，從則導(dǎo)致p62在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，而本次研究中檢測(cè)到結(jié)直腸癌組織中p62 亦呈高表達(dá)狀態(tài)。國(guó)內(nèi)外有類似本研究結(jié)果的報(bào)道，趙堅(jiān)培[18]等采用免疫組織化學(xué)法對(duì)42例患者的結(jié)腸癌組織以及正常結(jié)腸黏膜組織中Beclin1 以及p62的陽性表達(dá)率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示Beclin1在正常結(jié)腸黏膜中陽性表達(dá)率高于癌組織，而p62蛋白則相反。一項(xiàng)研究[19]發(fā)現(xiàn)胃癌、結(jié)直腸癌組織相對(duì)于癌旁組織Beclin1 mRNA和Beclin1蛋白表達(dá)水平均下降。以上研究均顯示在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中自噬活性是降低的，但目前還有一些不同研究結(jié)果提示結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中自噬活性是增強(qiáng)的，馬煜等[20]對(duì)85例結(jié)腸癌組織及其相應(yīng)距腫瘤組織6 cm 以上的癌旁組織中Beclin1和p62表達(dá)的研究顯示，在結(jié)直腸癌中Beclin1表達(dá)增高而p62表達(dá)降低。WU 等[21]的研究表明結(jié)腸癌組織Beclin1的表達(dá)顯著高于鄰近正常組織。以上所有研究均提示自噬與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，但造成這些研究結(jié)果的不同，可能與研究樣本量偏少、實(shí)驗(yàn)方法或?qū)嶒?yàn)結(jié)果評(píng)分系統(tǒng)等差異有關(guān)，也可能與腫瘤發(fā)生的不同階段自噬對(duì)細(xì)胞起到了抑制和促進(jìn)雙重作用有關(guān)。即在腫瘤發(fā)生的早期，細(xì)胞自噬功能的缺失可促進(jìn)腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)；而在腫瘤晚期，自噬可保護(hù)腫瘤細(xì)胞在缺血、缺氧等惡劣條件下生存[22]。

本研究還顯示Beclin1的表達(dá)與結(jié)直腸癌的腸壁浸潤(rùn)深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Beclin1蛋白在T1-T2 期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的陽性率表達(dá)高于T3-T4和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。p62的陽性率表達(dá)與結(jié)直腸癌的有無淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者p62表達(dá)的陽性率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。目前研究認(rèn)為決定結(jié)直腸癌預(yù)后的最關(guān)鍵的因素是臨床病理分期，包含腫瘤浸潤(rùn)深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的綜合指標(biāo)。對(duì)腫瘤浸潤(rùn)深度分期越晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，往往提示患者預(yù)后不佳。在臨床上將Beclin1、p62 二者聯(lián)合檢測(cè)可作為結(jié)直腸癌病情嚴(yán)重程度及預(yù)后評(píng)估的輔助指標(biāo)，對(duì)于Beclin1 低表達(dá)、p62 高表達(dá)患者可能呈現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率增高，病情晚，預(yù)后差。

綜上所述，結(jié)直腸癌中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、p62表達(dá)異常，可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬活性來影響腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展，將來有望成為結(jié)直腸癌早期診斷、惡性程度判定和預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物。目前自噬在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚無定論、機(jī)制仍未完全闡明，而現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外有關(guān)Beclin1、p62的表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后關(guān)系報(bào)道少見，后者也是本研究的不足之處，故后期我們將繼續(xù)開展更多樣本的重復(fù)實(shí)驗(yàn)和深入研究，并對(duì)現(xiàn)有病人的預(yù)后、存活時(shí)間繼續(xù)隨訪。相信隨著研究的深入，細(xì)胞自噬在結(jié)直腸癌中所起到的作用會(huì)越來越明了，對(duì)評(píng)估結(jié)直腸癌預(yù)后及在結(jié)直腸癌的治療中具有十分重要的意義，這也為結(jié)直腸癌的治療提供了一個(gè)新方向。