柏效治 原翔 劉怡文 孔金玉 孫蔚 李燕樂 謝小娟

1河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（河南洛陽471003）；2 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院新正醫(yī)院麻醉科；3 河南科技大學(xué)腫瘤研究所，河南省腫瘤表現(xiàn)遺傳重點實驗室（河南洛陽471003）

卵巢癌是僅次于子宮內(nèi)膜癌的第二大婦科腫瘤，病死率位居婦科惡性腫瘤首位[1]。早期不易診斷且易發(fā)生擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移是造成卵巢癌高病死率的主要原因[2]。目前，由于缺乏更為理想的治療方法，使得卵巢癌治療預(yù)后較差，5年生存率低[3]。靶向治療是近年來腫瘤治療研究的熱點，尋找新的抗腫瘤靶點，是卵巢癌治療的重要研究方向[4]。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白賴氨酸去甲基化酶4C（recombinant lysine specific demethylase 4C，KDM4C）與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-6]。有文獻(xiàn)[7-11]報道，KDM4C在食管癌、乳腺癌、肺癌、皮膚癌及前列腺癌等多種腫瘤中均有異常高表達(dá)，并且與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，但其在卵巢癌中未見有相關(guān)報道。本研究建立KDM4C 下調(diào)的穩(wěn)定卵巢癌SKOV3細(xì)胞系；采用細(xì)胞功能實驗及裸鼠皮下荷瘤實驗檢測KDM4C對卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外及體內(nèi)惡性生物學(xué)行為的影響，為卵巢癌的靶向治療提供新的靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器卵巢癌細(xì)胞系SKOV3（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；DMEM 培養(yǎng)基（美國，Gibco公司）；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青鏈霉素（美國，Gibco公司）；慢病毒包裝試劑盒（GeneCopeia公司）；CCK8 試劑盒（美國GLPBIO）；Transwell 小室（康寧）；光學(xué)顯微鏡（尼康）；BCA蛋白定量試劑盒（康為），BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（康為）；KDM4C 兔單克隆抗體（Abcam），內(nèi)參GAPDH 抗體（康為），山羊抗兔多克隆抗體（康為）；Matrigel 膠（BD，USA）；eECL 發(fā)光顯影試劑盒（美國Invitrogen公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）。

1.2 細(xì)胞系的培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)：用含有10%FBS，1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞，將細(xì)胞放置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中；每1～3 d細(xì)胞換液，待細(xì)胞生長至80%～90%時傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞做下一步實驗。

1.3 慢病毒載體包裝培養(yǎng)包裝細(xì)胞：用含10%熱滅活胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞，細(xì)胞至細(xì)胞密度60%～70%時，開始轉(zhuǎn)染。配制DNA-EndoFectin 混合物，室溫放置30 min。將混合物加入293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染操作后的12 h 去除含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的舊培養(yǎng)液，以新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。向培養(yǎng)基中加入1/500 體積的“Titer Boost”。48 h后收獲病毒，將細(xì)胞上清至0.45 μm 濾器去除細(xì)胞碎片，取上清進(jìn)行感染。將SKOV3細(xì)胞鋪板，待密度長至50%～60%時，加入含病毒的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染病毒后，需在熒光顯微鏡下觀察信號。待視野中大部分細(xì)胞都帶有熒光時，用嘌呤霉素篩選培養(yǎng)2周。提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，通過Western Blot 方法檢測KDM4C蛋白敲降效率。

1.4 Western Blot 方法檢測KDM4C蛋白敲降效率取對數(shù)生長期的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞增殖至培養(yǎng)瓶80%～90%時，棄去培養(yǎng)皿中舊培養(yǎng)液，用PBS 清洗細(xì)胞，除去死細(xì)胞、細(xì)胞代謝產(chǎn)物及雜質(zhì)；加入配置好的蛋白裂解液（RIPA：PMSF：蛋白酶抑制劑=5 000∶50∶1），刮匙刮下蛋白，冰上裂解1～2 h，期間間斷吹打震蕩。4℃，12 000 r/min 離心10～30 min。抽取上清，用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白加入10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，上層濃縮膠恒壓90 V/30 min 電泳，下層分離膠膠恒壓120 V/60 min 電泳，電泳后，在恒壓80 V/150 min轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉封閉PVDF 膜1 h，TBST 洗膜3次，8次/min，加入KDM4C 兔一抗（1∶1 000）和內(nèi)參GAPDH（1∶2 000）放于搖床60 r/min，4℃過夜，TBST 清洗3次，8次/min，加入兔二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，再用TBST洗膜3次，8次/min，采用ECL檢測目的蛋白條帶，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并進(jìn)行定量分析。實驗重復(fù)3次，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5 細(xì)胞功能學(xué)實驗

1.5.1 CCK8實驗取對數(shù)生長期細(xì)胞，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量。在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100 μL/孔，1 000/2 000 兩個濃度梯度）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一段時間（37℃，5%CO2）。待細(xì)胞貼壁后，每隔12 h 向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。酶標(biāo)儀測定吸光度。實驗設(shè)計3個復(fù)孔取平均值，并重復(fù)3次。

1.5.2 平板克隆形成實驗取對數(shù)生長期細(xì)胞，分別于6孔板中鋪入500個細(xì)胞和1 000個細(xì)胞。當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基。洗滌、固定、結(jié)晶紫染色計數(shù)肉眼可見的克隆數(shù)，依照克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%計算，拍照留存。重復(fù)實驗3次。

1.5.3 劃痕實驗用marker 筆在6孔板底部背面均勻劃3條記號線，取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至70%～80%，用200 μL 無菌中號槍頭比著直尺用力劃線，使劃痕與記號線垂直。用無菌PBS 輕輕洗滌細(xì)胞3次，洗去劃下的細(xì)胞。向6孔板中加入無血清培養(yǎng)基，于5%CO2，37℃恒溫箱中常規(guī)培養(yǎng)。每隔3 h對同一位置細(xì)胞拍照。應(yīng)用Image J軟件測量不同時間點劃痕內(nèi)空白面積的大小，并用計算遷移面積，比較兩組細(xì)胞不同時間點遷移面積的大小。重復(fù)實驗3次。

1.5.4 Transwell實驗用50 mg/L Matrigel 膠稀釋液包被Transwell 小室基底膜。取對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)消化饑餓12～24 h，取含1×106個/mL的細(xì)胞懸液（無血清）100 μL，吹打均勻，加入Transwell 小室然后，向下室加含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)550 μL。分別于16 h和24 h，擦去小室基底膜上層細(xì)胞，甲醛固定1～2 h，4 g/L 結(jié)晶紫染液，均選10個視野，于倒置相差顯微鏡下觀察、計數(shù)并照相。實驗重復(fù)3次，每次設(shè)置3個復(fù)孔取平均值。

1.6 裸鼠皮下荷瘤實驗將12只5～6周齡健康雄性裸鼠（體質(zhì)量約20 g）隨機(jī)分為兩組：實驗分為SKOV3-GFP（對照組）組與SKOV3-K（KDM4C 敲降組）組，每組6只。每組6只，于超凈工作臺中飼養(yǎng)。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，胰酶消化細(xì)胞并計數(shù)，使用PBS 重懸細(xì)胞，配置成5 × 107/mL細(xì)胞懸液，于小鼠右側(cè)腋下為進(jìn)針點，酒精棉球擦拭，進(jìn)針在至皮下，緩慢推注，一般體積為100 μL細(xì)胞懸液，注射完后拔出針頭，注射位置能看到明顯的鼓包，接種腫瘤細(xì)胞后，每天觀察裸鼠生存狀況及成瘤情況；腫瘤形成后，每天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積；待腫瘤長至直徑為1.5～2.0 cm 時，頸椎脫臼處死裸鼠，取出腫瘤，拍照。重復(fù)實驗3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法運用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。Western Blot 方法檢測KDM4C蛋白敲降效率、CCK8、平板克隆、劃痕實驗、Transwell及裸鼠皮下荷瘤實驗結(jié)果均采用t檢驗，所有計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立KDM4C 下調(diào)的穩(wěn)定細(xì)胞系實驗分為SKOV3-GFP（對照組）與SKOV3-K（KDM4C 敲降組），應(yīng)用慢病毒包裝試劑盒建立KDM4C蛋白敲降細(xì)胞系和GFP 熒光對照細(xì)胞系，并使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞系，共聚焦顯微鏡觀察熒光效果（圖1）。

圖1 建立SKOV3-GFP（對照組）與SKOV3-K（KDM4C 敲降組）細(xì)胞系Fig.1 Skov3-gfp（control group）and Skov3-k（KDM4C knockdown group）cell lines were established

2.2 Western Blot 方法檢測KDM4C蛋白敲降效率采用Western Blot 方法檢測KDM4C蛋白敲降效率，結(jié)果顯示，SKOV3-K（KDM4C 敲降組）組中KDM4C表達(dá)量（0.202 ± 0.058）顯著低于SKOV3-GFP[對照組，（1.669±0.089），t=13.905，P＜0.001，表1、圖2]，成功建立KDM4C下調(diào)的穩(wěn)定細(xì)胞系。

圖2 Western Blot 方法檢測KDM4C蛋白敲降效率Fig.2 Western Blot method was used to detect the knockdown efficiency of KDM4C protein

表1 Western Blot 方法檢測KDM4C蛋白敲降效率Tab.1 Western Blot examined the effect of KDM4C on the invasion ability of ovarian cancer cell lines±s

表1 Western Blot 方法檢測KDM4C蛋白敲降效率Tab.1 Western Blot examined the effect of KDM4C on the invasion ability of ovarian cancer cell lines±s

注：*P ＜0.05

組別SKOV3-GFP SKOV3-K t 值P 值KDM4C表達(dá)量1.669±0.089 0.202±0.058* 13.905＜0.001

2.3 CCK8檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系增殖能力的影響采用CCK8檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系增殖能力的影響，實驗分為SKOV3-GFP（對照組）與SKOV3-K（KDM4C 敲降組），設(shè)定1 000個/孔和1 500個/孔兩個濃度梯度。待細(xì)胞貼壁后，每隔12 h測定吸光度。測定加樣量為1 000個細(xì)胞每孔的吸光度（t= 3.693，P= 0.014，圖3A）和1 500個細(xì)胞每孔的吸光度（t= 2.781，P= 0.039，圖3B），發(fā)現(xiàn)SKOV3-K（KDM4C 敲降組）細(xì)胞的增殖能力明顯減弱。

2.4 平板克隆檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系增殖及成瘤的影響采用平板克隆實驗檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系體外增殖和成瘤能力的影響，實驗分為SKOV3-GFP（對照組）與SKOV3-K（KDM4C 敲降組）。設(shè)置兩個細(xì)胞鋪板密度，分別于6孔板中鋪入1 000個細(xì)胞/孔和500個細(xì)胞/孔。當(dāng)鋪板密度為1 000個/孔時，與對照組（126.000±7.382）相比，KDM4C 敲降組（94.500 ± 6.850）細(xì)胞增殖及成瘤能力明顯減弱（t=3.128，P=0.020，圖4、表2）；當(dāng)鋪板密度為500個/孔時，與對照組（72.000 ± 5.541）相比，KDM4C 敲降組（53.000 ± 3.479）細(xì)胞增殖及成瘤能力明顯減弱（t= 2.904，P= 0.019，圖4、表2）。

圖3 CCK8檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系增殖能力的影響Fig.3 CCK8 assay was used to determine the effect ofKDM4C on the proliferation ability of ovarian cancer cell lines

圖4 平板克隆檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系增殖能力的影響Fig.4 Effect of KDM4C on proliferation of ovarian cancer cell lines by plate cloning

2.5 劃痕實驗檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系遷移能力的影響采用劃痕實驗檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系遷移能力的影響，發(fā)現(xiàn)與SKOV3-GFP（對照組，10.720±2.549）相比，SKOV3-K（KDM4C敲降組，4.617 ± 0.939）細(xì)胞遷移能力明顯減弱（t= 2.248，P=0.039，圖5）。

表2 平板克隆檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系增殖能力的影響Tab.2 Effect of KDM4C on proliferation of ovarian cancer cell lines by plate cloning±s

表2 平板克隆檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系增殖能力的影響Tab.2 Effect of KDM4C on proliferation of ovarian cancer cell lines by plate cloning±s

注：*P ＜0.05

組別SKOV3-GFP SKOV3-K t 值P 值鋪板1 000個細(xì)胞/孔的成瘤數(shù)126.000±7.382 94.500±6.850* 3.128 0.020鋪板500個細(xì)胞/孔的成瘤數(shù)72.000±5.541 53.000±3.479* 2.904 0.019

圖5 劃痕實驗檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系遷移能力的影響Fig.5 Effect of KDM4C on migration ability of ovarian cancer cell lines was detected by Wound-healing

2.6 Transwell檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系侵襲能力的影響采用Transwell實驗檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系侵襲能力的影響，實驗分為SKOV3-GFP（對照組）與SKOV3-K（KDM4C敲降組），在16 h拍照，與對照組（58.750 ± 2.394）相比，KDM4C 敲降組（44.250 ± 1.436）細(xì)胞侵襲能力明顯減弱（t=5.195，P=0.002，圖6、表3）；在24 h 拍照，與對照組（101.500 ± 4.839）相比，KDM4C 敲降組（67.250 ±3.172）細(xì)胞侵襲能力明顯減弱（t= 5.919，P=0.001，圖6、表3）。

圖6 Transwell檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系侵襲能力的影響Fig.6 Transwell assay examined the effect of KDM4C on the invasion ability of ovarian cancer cell lines

表3 Transwell檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系侵襲能力的影響Tab.3 Transwell assay examined the effect of KDM4C on the invasion ability ofovarian cancer cell lines±s

表3 Transwell檢測KDM4C對卵巢癌細(xì)胞系侵襲能力的影響Tab.3 Transwell assay examined the effect of KDM4C on the invasion ability ofovarian cancer cell lines±s

組別SKOV3-GFP SKOV3-K t值P值穿過基底膜細(xì)胞數(shù)（16 h）58.750±2.394 44.250±1.436 5.195 0.002穿過基底膜細(xì)胞數(shù)（24 h）101.500±4.839 67.250±3.172 5.919 0.001

2.7 KDM4C對裸鼠皮下成瘤能力的影響采用裸鼠皮下成瘤實驗檢測KDM4C對卵巢癌SKOV3細(xì)胞成瘤能力的影響，將12只5～6周齡的健康雄鼠隨機(jī)分為SKOV3-GFP（對照組）組與SKOV3-K（KDM4C 敲降組）組，每組6只。通過定期對腫瘤體積的測量，觀察到SKOV3-K（KDM4C 敲降組）組裸鼠腫瘤生長明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 3.734，P= 0.007，圖7A）。裸鼠處死取出腋下腫瘤后稱重，KDM4C 敲降組腫瘤質(zhì)量顯著小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 2.388，P= 0.038，圖7B、表4）。

圖7 KDM4C對卵巢癌SKOV3細(xì)胞系體內(nèi)增殖和成瘤能力的影響Fig.7 effect of KDM4C on SKOV3 cell line proliferation and tumorigenic ability of ovarian cancer

表4 KDM4C對卵巢癌SKOV3細(xì)胞系體內(nèi)成瘤能力的影響Tab.4 effect of KDM4C on SKOV3 cell line tumorigenic ability of ovarian cancer±s

表4 KDM4C對卵巢癌SKOV3細(xì)胞系體內(nèi)成瘤能力的影響Tab.4 effect of KDM4C on SKOV3 cell line tumorigenic ability of ovarian cancer±s

組別SKOV3-GFP SKOV3-K t 值P 值腫瘤質(zhì)量（g）1.023±0.202 0.508±0.077 2.388 0.038

3 討論

卵巢癌是臨床常見的一種婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率連年增長[12]。雖然目前對于卵巢癌治療有手術(shù)、化療、放療等手段，因其易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，但治療效果仍然欠佳[13]。因此，尋找與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子靶點，以預(yù)測腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后情況，為靶向治療提供可能的新靶點，具有極其重要的意義。

越來越多的證據(jù)表明基因組DNA和染色質(zhì)組蛋白組分的共價修飾可能引起染色質(zhì)構(gòu)象的改變，這與癌癥的發(fā)生和/或發(fā)展密切相關(guān)[14-16]。編碼組蛋白修飾酶的各種基因發(fā)生了突變，在各種人類癌癥中都能檢測到異常的組蛋白修飾，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[17-18]。在這些修飾中，組蛋白甲基化在腫瘤發(fā)生調(diào)控中的功能重要性已被廣泛研究[19-20]。KDM4C能夠編碼一種組蛋白去甲基化酶，對于維持胚胎干細(xì)胞的自我更新和分化潛能有至關(guān)重要的作用，在基因表達(dá)調(diào)控和異染色質(zhì)形成中發(fā)揮重要作用[21-22]。甲基化沉默基因通過抑制DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的重新表達(dá)已成為一種有效的抗癌策略。

李娜等[8]證實，抑制KDM4C蛋白的表達(dá)能抑制食管癌致瘤性、干細(xì)胞性，促進(jìn)化療的敏感性。UIMONEN 等[9]認(rèn)為在鱗狀細(xì)胞肺癌中，KDM4C的高表達(dá)能夠預(yù)測腫瘤患者的預(yù)后較差。研究表明，KDM4C蛋白高表達(dá)可誘導(dǎo)正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A 惡性轉(zhuǎn)化和增殖，下調(diào)KDM4C的表達(dá)可抑制乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移[10]。BERRY 等在乳腺癌中證實KDM4C 高表達(dá)有助于乳腺癌細(xì)胞形成腫瘤，降低KDM4C表達(dá)可抑制KDM4C的成瘤能力。上述研究均指出KDM4C在多種腫瘤中均發(fā)揮著重要作用，但對其高表達(dá)與卵巢癌相關(guān)性的研究卻鮮有報道。因此，本研究旨在探討KDM4C表達(dá)量的變化對卵巢癌SKOV3 惡行生物學(xué)行為的影響。通過CCK8、平板克隆實驗結(jié)果顯示，KDM4C 下調(diào)后SKOV3細(xì)胞的增殖能力顯著下降，表明抑制KDM4C表達(dá)可減弱卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外增殖能力；劃痕實驗及Transwell 侵襲實驗顯示KDM4C下調(diào)后SKOV3細(xì)胞的遷移及侵襲能力顯著下降，表明KDM4C 低表達(dá)可減弱SKOV3細(xì)胞體外遷移及侵襲能力能力。小鼠皮下成瘤實驗結(jié)果表明KDM4C表達(dá)下調(diào)，可顯著抑制SKOV3細(xì)胞在體內(nèi)的增殖和成瘤能力，表明KDM4C對SKOV3細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力具有至關(guān)重要的作用。

綜上所述，KDM4C表達(dá)與卵巢癌SKOV3細(xì)胞惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。當(dāng)抑制KDM4C表達(dá)時，卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及成瘤方面惡性生物學(xué)行為顯著減弱。因此抑制KDM4C可能成為卵巢癌靶向治療潛在的一種新方法。