翁國(guó)武周真真

海南省第三人民醫(yī)院（三亞中心醫(yī)院）消化科（海南三亞572000）

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年升高且發(fā)病人群呈年輕化趨勢(shì)[1-2]。由于早期胃癌的癥狀隱匿、診斷難度大，多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已經(jīng)為中晚期，治療效果及預(yù)后情況均較差。盡管近年來(lái)外科手術(shù)技術(shù)不斷進(jìn)步、新的化療藥物及靶向藥物也陸續(xù)問(wèn)世和應(yīng)用，但胃癌患者的治療效果仍不理想，治療過(guò)程中腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移會(huì)直接影響預(yù)后。因此，越來(lái)越多的學(xué)者致力于探究胃癌發(fā)病的分子機(jī)制并尋找靶向治療胃癌的新手段。

微小RNA（microRNA，miR）是一種在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)的非編碼小分子RNA，多種miR 被證實(shí)在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中存在低表達(dá)或高表達(dá)[3-5]。在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，也有多種miR的表達(dá)發(fā)生改變[6-8]；其中miR-19a在胃癌病灶及胃癌患者外周血中均呈高表達(dá)的趨勢(shì)[9-11]且抑癌基因自殺相關(guān)因子（factor associated suicide，F(xiàn)as）的mRNA 序列中存在miR-19a的結(jié)合位點(diǎn)，從生物信息學(xué)角度推測(cè)miR-19a 能夠靶向抑制Fas的表達(dá)并起到促癌活性，但miR-19a在胃癌中的具體生物學(xué)作用仍未見(jiàn)明確報(bào)道。因此，為了闡明miR-19a在胃癌發(fā)生發(fā)展所發(fā)揮的作用及發(fā)揮作用的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)具體分析了miR-19a通過(guò)Fas 基因調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖水平的作用，進(jìn)而能夠?yàn)樯钊胝J(rèn)識(shí)胃癌發(fā)病機(jī)制、探尋胃癌新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料胃癌SGC-7901細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞資源中心。雄性BALB/c 小鼠購(gòu)自菲諾克生物科技（上海）有限公司，體質(zhì)量20～25 g、4～6周齡，許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0005。

miR-19a 模擬物、陰性對(duì)照（NC）模擬物、Fas的siRNA、NC的siRNA 購(gòu)自上海吉瑪公司，儲(chǔ)存液濃度為20 mmol/L；過(guò)表達(dá)Fas 基因的pcDNA3.1 質(zhì)粒購(gòu)自上海生工公司，儲(chǔ)存液濃度為2.5 mg/mL；雙熒光素酶報(bào)告基因購(gòu)自Promega公司；細(xì)胞增殖活力的MTS細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司，細(xì)胞凋亡的TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，miRNA 提取試劑盒、miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRNA 熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司，F(xiàn)as 單克隆一抗購(gòu)自Abcam公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱、高速離心機(jī)購(gòu)自Thermo公司，熒光定量PCR 儀購(gòu)自ABI公司，正置顯微鏡購(gòu)自Nikon公司，化學(xué)顯影儀購(gòu)自Bio-rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及干預(yù)SGC-7901細(xì)胞株用含有10%胎牛血清的DMEM 貼壁培養(yǎng)，鋪滿(mǎn)培養(yǎng)板底面90%后用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，傳代后的細(xì)胞接種在培養(yǎng)板內(nèi)并分組干預(yù)。NC組用不含藥物的DMEM 處理，NC 模擬物組轉(zhuǎn)染NC 模 擬 物，miR-19a 組 轉(zhuǎn) 染miR-19a的模 擬 物，siRNA-NC 組轉(zhuǎn)染NC的siRNA，siRNA-Fas 組轉(zhuǎn)染Fas的siRNA，NC 質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染空白的pcDNA3.1 質(zhì)粒，NC 質(zhì) 粒+miR-19a 模 擬 物 空 白的pcDNA3.1 質(zhì)粒及miR-19a的模擬物，F(xiàn)as 質(zhì)粒+miR-19a 模擬物組轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)Fas 基因的pcDNA3.1 質(zhì)粒及miR-19a的模擬物，連續(xù)干預(yù)24 h。

1.3 移植瘤小鼠模型建立及干預(yù)取消化后的SGC-7901細(xì)胞，調(diào)整至細(xì)胞密度為5 × 107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，取200 μL細(xì)胞懸液接種至小鼠右側(cè)腋下的皮下，1周后腫瘤生長(zhǎng)至0.5 cm3后認(rèn)為胃癌移植瘤小鼠造模成功，共15只小鼠、造模成功率100%。造模成功后，小鼠隨機(jī)分為NC 組、NC 模擬物組、miR-19a 模擬物組，每組各5只，從造模成功當(dāng)天開(kāi)始干預(yù)，3 組小鼠分別沿著腫瘤周?chē)煌课蛔⑸?00 μL的生理鹽水、NC 模擬物、miR-19a 模擬物，每3 天注射1次、共注射7次，末次注射后3 d處死小鼠，解剖得到移植瘤并稱(chēng)重，而后將移植瘤放置在液氮中保存。

1.4 miR-19a表達(dá)量檢測(cè)取分組干預(yù)24 h后的SGC-7901細(xì)胞，用miRNA 提取試劑盒分離細(xì)胞中的miRNA，用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒將miRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用miRNA 熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)cDNA 中的miR-19a及U6進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性3 min后95℃5 s、60℃15 s 重復(fù)40個(gè)循環(huán)，自動(dòng)生成循環(huán)曲線及閾值后、以U6為內(nèi)參、計(jì)算miR-19a的表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞增殖活力檢測(cè)取分組干預(yù)24 h后的SGC-7901細(xì)胞，將MTS 試劑盒中的檢測(cè)液20 μL加入培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出培養(yǎng)板，放置在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光值、為OD490值。

1.6 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)取分組干預(yù)24 h后的SGC-7901細(xì)胞，4%多聚甲醛固定0.5 h后立即用TUNEL 試劑盒（綠色熒光法）進(jìn)行染色并在顯微鏡下觀察TUNEL 陽(yáng)性染色及DAPI 陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.7 Fas蛋白表達(dá)量檢測(cè)取分組干預(yù)24 h后的SGC-7901細(xì)胞及液氮冷凍的移植瘤，用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞、提取蛋白，用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白含量后取30 μg蛋白進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。將蛋白樣本加入SDS-PAGE 中，電泳、電轉(zhuǎn)膜后將NC 膜放入5%脫脂牛奶中、室溫孵育1 h，而后將NC 膜放入1∶1 000 稀釋的Fas 一抗或1∶5 000 稀釋的β-actin一抗中、4℃孵育過(guò)夜；次日，將NC 膜放入1∶2 000稀釋的二抗中、室溫孵育1 h，最后加入ECL 顯影液、在化學(xué)顯影儀中曝光得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值、以β-actin為內(nèi)參計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)構(gòu)建包含F(xiàn)AS 基因mRNA 3′UTR的雙熒光素酶報(bào)告基因，將雙熒光素酶報(bào)告基因與NC 模擬物或miR-33b 模擬物共同轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，24 h后用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并離心，得到細(xì)胞沉淀后采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定螢火蟲(chóng)熒光值和海腎熒光值，以螢火蟲(chóng)熒光值/海腎熒光值計(jì)算熒光素酶報(bào)告基因的熒光活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0軟件錄入數(shù)據(jù)，3 組間計(jì)量資料的比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-19a對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)節(jié)作用與NC 組、NC 模擬物組比較，miR-19a 模擬物組細(xì)胞中miR-19a的表達(dá)量、細(xì)胞增殖活力OD490值均明顯增加，細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染miR-19a 模擬物后的miR-19a表達(dá)量、增殖活力及凋亡率Fig.1 miR-19a expression，proliferation viability and apoptosis rate after the transfection of miR-19a mimic

2.2 miR-19a對(duì)胃癌細(xì)胞中Fas 基因的靶向調(diào)節(jié)作用經(jīng)TargetScan進(jìn)行生物信息學(xué)分析，F(xiàn)as 基因mRNA的3′UTR 上含有miR-19a的結(jié)合位點(diǎn)。與NC 模擬物組、NC 組比較，miR-19a 模擬物組細(xì)胞中Fas的蛋白表達(dá)量、熒光素酶報(bào)告基因的熒光值均均明顯減少（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 沉默F(xiàn)as 基因?qū)ξ赴┘?xì)胞增殖及凋亡的調(diào)節(jié)作用與siRNA-NC 組、NC 組比較，siRNA-Fas 組細(xì)胞中Fas的蛋白表達(dá)量、細(xì)胞增殖活力OD490值均明顯增加，細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 過(guò)表達(dá)Fas 基因?qū)iR-19a 調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響與NC 質(zhì)粒組比較，NC 質(zhì)粒+miR-19a 模擬物組的細(xì)胞增殖活力OD490值均明顯增加，F(xiàn)as的蛋白表達(dá)量、細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）；與NC質(zhì)粒+miR-19a模擬物組比較，F(xiàn)as質(zhì)粒組+miR-19a 模擬物的細(xì)胞增殖活力OD490值均明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

2.5 miR-19a對(duì)胃癌移植瘤生長(zhǎng)及Fas 基因表達(dá)的影響與NC 模擬物組、NC 組比較，miR-19a 模擬物組的移植瘤質(zhì)量明顯增加，移植瘤中Fas的蛋白表達(dá)量均明顯減少（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

3 討論

癌細(xì)胞過(guò)度增殖是與胃癌發(fā)生及治療過(guò)程中復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的生物學(xué)環(huán)節(jié)，分析胃癌細(xì)胞增殖的調(diào)控方式有助于闡明胃癌發(fā)生的機(jī)制、也能夠?yàn)樘綄ば碌陌邢蛑委熓侄翁峁┮罁?jù)。近年來(lái)，多種miR在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用均受到關(guān)注，miR-19a是一種具有促癌作用的miR，在肝癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、結(jié)腸癌、腎癌、骨肉瘤等多種惡性腫瘤中均被證實(shí)能促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[12-18]。胃癌相關(guān)的臨床研究證實(shí)，胃癌病灶及胃癌患者外周血中miR-19a 均呈顯著高表達(dá)的趨勢(shì)[6-8]，提示miR-19a可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。基于此，本實(shí)驗(yàn)以胃癌SGC-7901細(xì)胞為對(duì)象、通過(guò)分析miR-19a對(duì)癌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用及機(jī)制來(lái)闡明miR-19a在胃癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-19a 模擬物后Fas 基因的表達(dá)量Fig.2 Fas gene expression after the transfection of miR-19a mimic

圖3 轉(zhuǎn)染Fas siRNA后的Fas表達(dá)量、增殖活力及凋亡率Fig.3 Fas gene expression，proliferation viability and apoptosis rate after the transfection of Fas siRNA

圖4 轉(zhuǎn)染Fas 質(zhì)粒后miR-19a對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響Fig.4 Effect of miR-19a on proliferation viability and apoptosis rate after the transfection of Fas plasmid

圖5 miR-19a對(duì)胃癌移植瘤生長(zhǎng)及Fas 基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of miR-19a on gastric cancer transplanted tumors growth and Fas gene expression

在本實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR-19a的模擬物后，SGC-7901細(xì)胞中miR-19a的表達(dá)明顯增加；在增加miR-19a的表達(dá)后，分別通過(guò)MTS 法和TUNEL 法測(cè)定了細(xì)胞的增殖和凋亡，SGC-7901細(xì)胞的增殖活力明顯增強(qiáng)、而凋亡明顯受到抑制，說(shuō)明miR-19a 能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖且抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能是其發(fā)揮促增殖作用的機(jī)制之一。MiR 具體的生物學(xué)作用是與靶基因mRNA的3′UTR 結(jié)合并抑制靶基因的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)targetscan進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，促凋亡基因Fas的3′UTR 上含有miR-19a的結(jié)合靶點(diǎn)；在轉(zhuǎn)染miR-19a的模擬物、增加miR-19a的表達(dá)后，細(xì)胞中Fas 基因的蛋白表達(dá)明顯減少、含有Fas 基因3′UTR的雙熒光素酶報(bào)告基因的熒光值明顯下降。以上結(jié)果說(shuō)明miR-19a能夠在SGC-7901細(xì)胞中靶向結(jié)合Fas 基因mRNA的3′UTR、抑制Fas 基因的表達(dá)，這也可能是miR-19a 促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、抑制胃癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

Fas 基因的編碼產(chǎn)物是FasL的受體，能夠在細(xì)胞內(nèi)招募FADD 并介導(dǎo)死亡受體途徑的細(xì)胞凋亡[19-22]。有臨床研究報(bào)道，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中，F(xiàn)as 基因的表達(dá)明顯下調(diào)[23]；也有基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究表明，抑制Fas的表達(dá)能夠阻礙胃癌細(xì)胞的凋亡[24-25]。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)miR-19a 能夠靶向抑制Fas 基因的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上通過(guò)轉(zhuǎn)染Fas 基因的siRNA 來(lái)抑制Fas 基因表達(dá)、驗(yàn)證胃癌細(xì)胞中Fas 基因表達(dá)下調(diào)后的生物學(xué)效應(yīng)。在轉(zhuǎn)染Fas的siRNA后，細(xì)胞中Fas的表達(dá)明顯減少、細(xì)胞凋亡率明顯下降，而細(xì)胞的增殖活力明顯增強(qiáng)，與既往其他研究[24-25]關(guān)于Fas 調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡及增殖的結(jié)果吻合，說(shuō)明Fas 基因參與胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控，miR-19a通過(guò)抑制Fas 基因的表達(dá)能夠削弱Fas 介導(dǎo)的促凋亡效應(yīng)、進(jìn)而發(fā)揮抑制凋亡及促進(jìn)增殖的作用。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)還轉(zhuǎn)染了過(guò)表達(dá)Fas 基因的質(zhì)粒來(lái)驗(yàn)證Fas 低表達(dá)在miR-19a 發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)中的作用，增加Fas 基因的表達(dá)后、miR-19a 增加增殖活力及降低凋亡率的效應(yīng)均明顯被削弱，由此進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-19a 能夠通過(guò)抑制Fas 基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、抑制胃癌細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)在上述細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，還通過(guò)移植瘤小鼠來(lái)驗(yàn)證miR-19a的促癌作用。經(jīng)皮下注射SGC-7901細(xì)胞的方式建立了胃癌移植瘤小鼠模型，在瘤周注射miR-19a的模擬物后觀察腫瘤生長(zhǎng)及靶基因Fas的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：miR-19a的模擬物能夠使移植瘤的質(zhì)量增加、同時(shí)也使移植瘤中Fas基因的表達(dá)減少，這一結(jié)果與miR-19a在離體SGC-7901細(xì)胞中促進(jìn)增殖、抑制凋亡、減少Fas 基因表達(dá)的作用吻合，說(shuō)明miR-19a 能夠促進(jìn)胃癌的生長(zhǎng)。

綜上所述，本研究首次闡明了miR-19a對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，靶向抑制Fas 基因介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是miR-19a 發(fā)揮促增殖作用的分子機(jī)制之一，這也是本研究的創(chuàng)新之處，基于此，未來(lái)miR-19a可能可以作為治療胃癌的靶點(diǎn)。本研究的局限及不足之處是未能對(duì)胃癌中miR-19a表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探究，在未來(lái)的研究中，可以進(jìn)一步通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀的方式來(lái)篩選與miR-19a 基因轉(zhuǎn)錄本上游結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而研究不同轉(zhuǎn)錄因子對(duì)胃癌中miR-19a表達(dá)的調(diào)控作用。