黃娜娜，顧康生，張逸寅,戴映，張騰騰

異常糖鏈糖蛋白(TAP)是蛋白質(zhì)糖基化異常，糖基化修飾不完全或新的糖基轉(zhuǎn)移酶被激活產(chǎn)生新的糖基化而形成的。細(xì)胞癌變時(shí)發(fā)生特異性糖鏈變化，促使多種異常糖鏈糖蛋白形成，臨床可以使用特殊技術(shù)檢測這些異常蛋白來區(qū)分疾病良惡性，使腫瘤早期檢測成為可能[1]。

近年來，有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌、鼻咽癌、乳腺癌等多種原發(fā)性惡性腫瘤中可檢測到異常糖鏈糖蛋白的表達(dá)，為異常糖鏈糖蛋白輔助惡性腫瘤診斷提供依據(jù)。TAP對于多種惡性腫瘤的早期診斷具有較高的敏感度與特異度，具有較高的診斷價(jià)值[2-5]。 但目前TAP在膽道惡性腫瘤(biliary tract cancer,BTC)方面的研究較少，臨床證據(jù)并不完善，本研究旨在觀察異常糖鏈糖蛋白在膽道惡性腫瘤中的表達(dá)，分析其對膽道惡性腫瘤的診斷價(jià)值及臨床意義，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性收集 2019年 1月—2020年 4月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科收治經(jīng)病理證實(shí)為膽道惡性腫瘤(BTC組)患者70例的臨床資料，其中男36例，女34例，年齡31～87(59.91±10.73)歲；病程0.2～6.0(1.75±1.60)年;腫瘤類別：膽囊癌24例，膽管癌46例；既往史：膽道手術(shù)史20例，無手術(shù)史50例；70例患者均無家族遺傳性病史。另按照隨機(jī)對照原則抽取同期醫(yī)院治療的膽道良性疾病患者100例為對照組，其中男55例，女45例，年齡 19～83 ( 52.32± 15.02)歲；病程0.3～5.0(2.21±1.65)年;患者均無家族遺傳病史。2組患者性別、年齡和平均病程比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn): ①所有患者病理已確診為 BTC；②年齡>18歲。(2)排除標(biāo)準(zhǔn): ①年齡<18歲; ②合并其他腫瘤者；③未行放化療；④合并嚴(yán)重感染及心、肝、腦等臟器嚴(yán)重器質(zhì)性病變者；⑤妊娠期及哺乳期婦女。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 臨床資料收集：收集BTC患者性別，年齡，功能狀態(tài)評分(PS)，腫瘤部位，臨床分期，病理分型及分化程度，肝轉(zhuǎn)移情況及腫瘤切除病史等。

1.3.2 TAP和CEA檢測：采集2組患者清晨空腹靜脈血10 ml，離心后留取血漿備用。TAP使用浙江瑞生醫(yī)療儀器廠提供的診斷儀和TAP檢測促凝劑、配套試劑盒，并嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。電化學(xué)發(fā)光法檢測CEA， 試劑盒購自羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司,所有操作按照相關(guān) SOP文件規(guī)范操作。

1.4 TAP及CEA陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)[5]TAP截?cái)嘀捣秶簣F(tuán)聚物面積<121 μm2為 TAP 正常/無明顯團(tuán)聚物(陰性)，面積121～225 μm2為異常/團(tuán)聚物較小(陽性)，面積>225 μm2為異常/團(tuán)聚物較大(陽性)。CEA正常參考范圍：0～5.00 U/ml，>5 U/ml為陽性，≤5 U/ml為陰性。

2 結(jié) 果

2.1 TAP結(jié)果判讀 TAP團(tuán)聚物為近似圓形，立體感較強(qiáng)，顆粒中間微發(fā)亮。通過測量團(tuán)聚物的面積，得出具體數(shù)值，見圖1。

2.2 2組TAP和CEA表達(dá)水平及陽性率比較 BTC組患者外周血TAP和CEA的表達(dá)水平及陽性率均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

注：A.陰性 (<121 μm2)；B.陽性 (121～225 μm2)；C.陽性 (>225 μm2)

2.3 BTC患者不同臨床特征中TAP和CEA表達(dá)比較 TAP在不同性別、年齡、PS評分、腫瘤部位、病理分型、神經(jīng)及脈管侵犯和腫瘤切除史中比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在膽道惡性腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、發(fā)生肝轉(zhuǎn)移者外周血TAP表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ期及無肝轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 CEA在不同臨床特征中表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，見表2。

2.4 外周血TAP和CEA診斷BTC的ROC曲線分析 ROC曲線分析顯示，TAP、CEA及聯(lián)合檢測診斷BTC的AUC分別為0.913、0.817、0.953，此時(shí)TAP截?cái)嘀禐?24.500 μm2，CEA的截?cái)嘀禐?.590 U/ml，敏感度分別為83.7%、70.0%、84.3%，特異度分別為97.0%、83.0%、97.0%；約登指數(shù)分別為0.807、0.530、0.813； 單項(xiàng)檢測中TAP的敏感度及特異度均高于CEA，聯(lián)合檢測的敏感度高于單獨(dú)檢測，TAP和聯(lián)合檢測的特異度均高于CEA，見表3、圖2。

圖2 TAP和CEA診斷BTC的ROC曲線

表1 2組患者TAP和CEA表達(dá)水平及陽性率比較

表2 BTC患者外周血TAP和CEA陽性率在不同臨床特征中比較 [例(%)]

表3 TAP、CEA和聯(lián)合檢測診斷BTC的ROC曲線分析

3 討 論

膽道惡性腫瘤(BTC)是由肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞、肝外膽管上皮細(xì)胞、膽囊上皮細(xì)胞和壺腹上皮細(xì)胞引起的一類異質(zhì)性腫瘤[6]。膽道惡性腫瘤相對罕見，占成人所有惡性腫瘤的0.7%，占消化道惡性腫瘤的4%[7]，但其發(fā)病率最近在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。到目前為止，膽道惡性腫瘤的唯一治療方法是手術(shù)切除；然而大多數(shù)膽道惡性腫瘤(>65%)在最初診斷時(shí)被認(rèn)為是不可治愈的[8-10]。此外，大多數(shù)膽道惡性腫瘤即使在根治手術(shù)后也常復(fù)發(fā)。晚期膽道惡性腫瘤的預(yù)后，包括不能切除的局部晚期或轉(zhuǎn)移性疾病患者，其5年總生存率(OS)小于10%[11-13]。因此如何提高膽道惡性腫瘤的早期檢測率是目前臨床重要的關(guān)注點(diǎn)之一，針對膽道惡性腫瘤特異性的生物標(biāo)志物研究較少，因此，尋找能夠輔助診斷膽道惡性腫瘤的生物標(biāo)志物意義重大。

研究表明，蛋白質(zhì)糖基化異常是導(dǎo)致正常細(xì)胞癌變的重要原因之一，同時(shí)也是誘導(dǎo)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵事件[14]。蛋白質(zhì)糖基化異常可促使異常糖鏈糖蛋白的表達(dá)，當(dāng)表達(dá)量達(dá)到一定程度后，可以在外周血中檢測到[15-16]。目前，異常糖鏈糖蛋白主要用于腫瘤的術(shù)前分期、術(shù)后療效監(jiān)測和復(fù)發(fā)的早期診斷[17-19]。許多腫瘤標(biāo)志物在目前的臨床檢測中是無法檢測到的，但TAP 檢測是一種特殊的識(shí)別技術(shù)，TAP檢測試劑盒中含有促凝劑，該檢測試劑盒輔助促進(jìn)了多種異常糖鏈的相互聚集形成晶體團(tuán)聚體，而沒有 TAP 物質(zhì)存在的血液無法形成團(tuán)聚體。TAP檢測系統(tǒng)中，使用圖像分析儀或生物顯微鏡可以觀察到與未使用TAP的凝固血液圖像的差異。TAP檢測可以將二十多種與腫瘤相關(guān)的異常糖鏈進(jìn)行一次組合檢測，聚集多種腫瘤信號，大大提高了腫瘤檢測的敏感度和特異度。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[20-21]，在肺癌外周血中異常糖鏈糖蛋白的表達(dá)明顯升高，可輔助肺癌的早期診斷，對于肺癌及其癌前病變的鑒別及篩查有重要的診斷價(jià)值，徐陽[22]發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌患者 TAP的表達(dá)明顯高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)患者，可作為甲狀腺良惡性腫瘤鑒別診斷的指標(biāo)，診斷效能良好。本結(jié)果顯示，在膽道惡性腫瘤組TAP檢測陽性率為87.1%,明顯高于膽道良性病變組，TAP和CEA聯(lián)合檢測可提高診斷效能，特異度達(dá)97.0%，與上述的各項(xiàng)研究結(jié)果相似。Neela等[23]研究已發(fā)現(xiàn)，Ras-Raf-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活增強(qiáng)N-乙酰葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V(GnT-V)活性，從而使E-鈣黏附素的β-1，6-N-乙酰葡萄糖表達(dá)增多，降低腫瘤細(xì)胞間黏附性，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落而轉(zhuǎn)移，腫瘤細(xì)胞膜上的β-1，6-N-乙酰葡萄糖胺分支結(jié)構(gòu)表達(dá)增加形成的異常糖鏈糖蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在本研究中，肝轉(zhuǎn)移的患者TAP表達(dá)水平明顯升高，證實(shí)了異常糖鏈糖蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，與Neela等[23]研究結(jié)果一致。中晚期膽道惡性腫瘤患者的TAP表達(dá)水平明顯升高，可能由于腫瘤負(fù)荷重，腫瘤細(xì)胞表面和最終釋放進(jìn)入體液的異常糖鏈糖蛋白多，血清TAP陽性檢出率更高。另外本研究發(fā)現(xiàn)，如以TAP團(tuán)聚物面積>225 μm2為截?cái)嘀翟\斷，膽道惡性腫瘤的特異度和陽性率為100%,但其較低的敏感度將限制其廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐。本研究受臨床病例數(shù)限制存在一定的局限性，可能存在臨床選擇性偏倚。

綜上所述，異常糖鏈糖蛋白可以作為鑒別診斷膽道良惡性腫瘤的生物標(biāo)志物，并具有較好的診斷效能，與CEA聯(lián)合檢測可提高診斷的敏感度。對于異常糖鏈糖蛋白在膽道惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的分子作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

黃娜娜：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，資料收集，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，論文撰寫; 顧康生:提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;張逸寅：實(shí)施研究過程；戴映、張騰騰：實(shí)施研究過程、資料搜集整理