杜曉宣，陳燕，趙志靜，李亞璇，孫永東

預(yù)防腎缺血再灌注損傷及對(duì)器官的影響一直是臨床亟待解決的問題，但目前腎缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制尚未明確[1-3]。白介素-17A(IL-17A)是一種促炎性因子，已被證實(shí)腎缺血再灌注后期IL-17A升高，引起中性粒細(xì)胞靶向器官浸潤(rùn)，是導(dǎo)致術(shù)后多器官功能障礙的關(guān)鍵[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定可降低小鼠腎缺血后IL-17A水平、減少靶器官炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、上調(diào)抗凋亡蛋白表達(dá)[6]。目前國(guó)外針對(duì)IL-17A及右美托咪定的研究逐漸增多，然而針對(duì)右美托咪定與IL-17A之間聯(lián)系的研究報(bào)道較少。現(xiàn)分析右美托咪定在腎缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用及其作用機(jī)制與IL-17A的關(guān)系，分析右美托咪定所產(chǎn)生的內(nèi)源性腎保護(hù)作用機(jī)制，以期為腎臟保護(hù)提供新的方向，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 (1)動(dòng)物：清潔級(jí)Wistar大鼠(45只購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，雄性，6～8周齡，動(dòng)物合格證號(hào)65000700001017)，體質(zhì)量(220±10)g，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)、腎缺血再灌注組(IRI組)、右美托咪定干預(yù)組(IRI+DEX組)，每組15只。(2)材料與試劑:TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(MK1020)購自武漢博士德生物工程有限公司；大鼠IL-17A和腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA檢測(cè)試劑盒均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；BUN試劑盒(C013-2)和CRE試劑盒(C011-2)均購自南京建成生物科技有限公司；瓊脂糖(A811BA0014)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；蘇木素染液和DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；中性樹膠和伊紅染液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。(3)儀器設(shè)備： 凝膠成像系統(tǒng)(上海天能2500，上海天能科技有限公司)、 Real Time PCR instrument(美國(guó)ABI QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR Syste)、PCR儀(美國(guó)Bio-Rad MyCycler Thermal Cycler)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad xMarkTM)、顯微鏡(日本尼康E200，上海土森視覺科技有限公司)。

1.2 造模方法 Sham組：僅切除大鼠右腎并分離左側(cè)腎蒂，不進(jìn)行鉗夾處理。IRI組：2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，待翻正反射消失后，氣管插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)，俯臥位于24～29 ℃的體溫毯上，沿腹正中線1.5～2.0 cm切口逐層分離皮膚至腹腔，沿腸道找到腎蒂并分離，游離輸尿管，切除右側(cè)腎臟，左側(cè)腎蒂使用無損傷血管夾夾閉30 min。根據(jù)左腎顏色判斷缺血情況，確認(rèn)其由鮮紅轉(zhuǎn)為整體腎臟暗紅色時(shí)即可。30 min后松開血管夾進(jìn)行再灌注，待腎臟由暗紅色轉(zhuǎn)為鮮紅色，恢復(fù)血液供應(yīng)后再將其還納入腹腔并縫合傷口。IRI+DEX組：于缺血前30 min腹腔注射右美托咪定100 μg/kg干預(yù)，其余處理與IRI組相同。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 樣本收集：各組分別在術(shù)后8 h處死大鼠。從其腹正中線切開皮膚進(jìn)入腹腔，使腹主動(dòng)脈清楚暴露并采集血液，離心，將血清凍存于-80℃冰箱；迅速剝離大鼠腎臟，記錄雙腎肉眼外觀，然后用剪刀將腎臟組織剪成小塊(約1 cm3)，每側(cè)腎各取1塊組織置于10%中性甲醛中4℃固定過夜，用于HE染色及TUNEL實(shí)驗(yàn)，其余組織立刻存入液氮中，再于-80℃保存。

1.3.2 腎臟組織病理變化：上述腎臟組織固定脫水包埋制片，而后置于65℃恒溫箱中烘烤1.5～2.0 h，二甲苯脫蠟，酒精水化，蘇木素染色，鹽酸酒精分化，伊紅復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.3 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡：腎臟組織固定脫水包埋制片，烤片，二甲苯脫蠟，酒精水化，0.01 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH 6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，洗滌3次，加Proteinase K消化,加入TdT 和 DIG-d-UTP 各 1μl，加標(biāo)記液20 μl/片，標(biāo)記2 h。洗滌3 次，加封閉液 50 μl /片，室溫 30 min，甩掉封閉液，不洗。加入1︰100稀釋生物素化抗地高辛抗體50 μl /片，反應(yīng) 30 min，洗滌3 次，加入1︰100稀釋 SABC 50 μl/片，37℃反應(yīng) 30 min。洗滌4 次，DAB顯色3～10 min，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，反藍(lán)，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。鏡下判斷和計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)以評(píng)估細(xì)胞凋亡程度，細(xì)胞凋亡指數(shù)計(jì)算：在高倍視野中計(jì)數(shù)細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒者，計(jì)算其所占細(xì)胞百分比。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)血清IL-17A、TNF-α及腎組織勻漿中Cre、BUN表達(dá)：上述血清樣本按照IL-17A、TNF-α試劑盒說明書具體實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，以ELISA法檢測(cè)。將收集好的腎臟組織樣本在液氮包圍的情況下，研磨成粉，按照Cre、BUN試劑盒說明書進(jìn)行勻漿處理，而后再按照試劑盒說明書具體實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，以ELISA法檢測(cè)。

1.3.5 qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-17A、mTOR、NF-κB、AMPK表達(dá)： 將上述腎組織研磨成粉，取25～50 mg加入有TRLZOL 1 ml的離心管中，混勻，加入氯仿200 μl，混勻后離心吸取上清，加入等體積的異丙醇混勻，再離心棄除上清液，加入75%乙醇，使沉淀漂浮起來洗滌。4℃離心15 min，倒掉上清液?？展茈x心，吸盡液體，晾干，用無RNA、DNA酶的水溶解沉淀。進(jìn)行濃度測(cè)定和凝膠成像儀觀察結(jié)果，剩余RNA進(jìn)行第一鏈cDNA合成：按照反應(yīng)體系配制，25℃反應(yīng)10 min，42℃反應(yīng)30 min，85℃ 反應(yīng)5 s。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA使用RNase-free Water按照1︰1的比例稀釋進(jìn)行反應(yīng)，然后進(jìn)行熒光定量實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 3組腎臟病理組織學(xué)變化比較 Sham組：鏡下腎臟結(jié)構(gòu)大體正常，腎小球結(jié)構(gòu)規(guī)則，腎小管結(jié)構(gòu)完整，腎間質(zhì)有極少量的空泡變性。IRI組：鏡下部分腎間質(zhì)空泡變性、水腫伴充血、出血，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、脫落，近端小管刷狀緣消失，部分腎小管壞死明顯，管腔內(nèi)可見脫落的細(xì)胞碎片及管型形成，少部分腎小球輕度萎縮。IRI+DEX組：鏡下少部分腎間質(zhì)空泡變性，水腫，部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹、脫落，局灶腎小管壞死，管腔內(nèi)可見少量的脫落細(xì)胞碎片和管型形成，腎小球未見明確改變，見圖1。

2.2 3組大鼠腎小管細(xì)胞凋亡情況比較 Sham組鏡下觀察發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞少，凋亡指數(shù)為(6.296±0.852)%；IRI組凋亡細(xì)胞明顯增多， 凋亡指數(shù)為(25.927±1.597)%，較 Sham 組腎小管細(xì)胞凋亡明顯增多(q=47.536,P=0.000)；IRI+DEX組凋亡指數(shù)為(7.158±0.749)%，較IRI組凋亡細(xì)胞明顯減少，凋亡指數(shù)降低(q=45.448，P=0.000)，見圖2。

2.3 3組大鼠腎臟組織勻漿中BUN、Cre水平比較 與Sham組比較，IRI組大鼠腎臟組織勻漿中BUN、Cre水平升高(q/P=12.514/0.000、3.259/0.007)；與IRI組比較，IRI+DEX組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q/P=11.458/0.000，2.638/0.035)，見表1。

表1 3組大鼠腎組織勻漿中BUN、Cre水平比較

2.4 3組大鼠血清炎性因子比較 與Sham組比較，IRI組大鼠血清IL-17A 、TNF-α水平升高(q/P=12.623/0.000、13.037/0.000)；與IRI組比較，IRI+DEX組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q/P=10.388/0.000、10.460/0.000)，見表2。

表2 大鼠血清IL-17A、TNF-α水平比較

2.5 3組大鼠腎組織各基因mRNA水平比較 與Sham組比較，IRI組IL-17A、NF-κB、AMPK顯著升高，mTOR顯著降低(q/P=10.441/0.000、6.722/0.000、2.649/0.034、10.110/0.000)；與IRI組比較，IRI+DEX組IL-17A、NF-κB顯著降低，mTOR顯著升高(q/P=6.262/0.000、3.608/0.002、6.010/0.000)，見表3。

3 討 論

腎缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制涉及多種細(xì)胞因子水平的升高及炎性反應(yīng)的增強(qiáng)等，其作用機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。探討腎缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)條件是建立合格有效的動(dòng)物模型。本研究參照國(guó)內(nèi)余曉東等[7]提出的造模方法建立腎缺血再灌注損傷大鼠模型，該模型的優(yōu)勢(shì)在于造模成功率高和實(shí)用性強(qiáng)，通過切除右腎、夾閉左腎動(dòng)脈，模擬出接近臨床上常見的由于單純?nèi)毖鸬脑俟嘧p傷，這是目前最常用于研究腎缺血再灌注損傷相關(guān)發(fā)病機(jī)制的理想模型。本研究大鼠造模后腎臟病理形態(tài)學(xué)、腎小管細(xì)胞凋亡及腎功能變化的結(jié)果，均證明了腎缺血再灌注損傷造模成功。

右美托咪定是臨床中常用的鎮(zhèn)靜藥物，具有抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮及抗交感作用，同時(shí)具有較好的圍術(shù)期器官保護(hù)作用，目前實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，右美托咪啶術(shù)中用藥，能有效改善腦、心、腎、肺等重要器官的缺血/再灌注損傷[8]，但具體作用機(jī)制尚未進(jìn)一步闡明。本研究在大鼠腎缺血再灌注模型中采用右美托咪定預(yù)處理，腎臟組織病理形態(tài)學(xué)、腎小管細(xì)胞凋亡及腎功能變化的結(jié)果顯示，右美托咪定預(yù)處理組中腎小管細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯下降，腎臟損傷明顯減少，提示右美托咪定可減輕大鼠腎缺血再灌注損傷。

目前對(duì)右美托咪定在腎臟缺血再灌注中保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不明確，本研究提出“右美托咪定預(yù)處理可抑制IL-17A分泌，減輕缺血再灌注損傷亞急性期炎性細(xì)胞向靶器官浸潤(rùn)及可能存在的過度自身免疫反應(yīng)”新假說。IL-17A 主要由一類特殊的 CD4+T細(xì)胞亞群分泌，能夠刺激成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞釋放大量的炎性因子，包括IL-6、IL-8、TNF-α 和 IL-1β等，參與機(jī)體自身免疫性疾病和多種炎性疾病，尤其在器官缺血再灌注損傷中的作用越來越受到關(guān)注[9-10]。TNF-α 是單核—巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的重要炎性因子，參與調(diào)控單核細(xì)胞在組織上的黏附功能，同時(shí)可以刺激 Th1 細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)，產(chǎn)生炎性反應(yīng)。IL-17A、TNF-α均是缺血再灌注損傷中典型的炎性因子，其表達(dá)水平反映了缺血再灌注損傷的炎性反應(yīng)水平[11-13]。本結(jié)果顯示，腎臟缺血再灌注損傷可顯著增加 TNF-α 和IL-17A 的表達(dá)，而右美托咪定預(yù)處理能有效調(diào)控炎性反應(yīng)，推測(cè)右美托咪定對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與其降低促炎介質(zhì)TNF-α 和IL-17A有關(guān)。

圖1 3組大鼠腎臟病理組織學(xué)變化比較(HE染色，×400)

圖2 3組大鼠腎小管細(xì)胞凋亡比較(TUNEL法，×400)

表3 3組大鼠腎臟組織中各基因mRNA水平比較

本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腎臟缺血再灌注造模后大鼠腎臟組織中IL-17A、NF-κB、AMPK表達(dá)水平均明顯升高，而mTOR表達(dá)明顯降低，提示IL-17A具有調(diào)控炎性因子的作用，NF-κB、AMPK及mTOR信號(hào)通路均可能在腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生過程中發(fā)揮作用。經(jīng)過右美托咪定預(yù)處理，腎臟缺血再灌注造模后大鼠腎臟組織中IL-17A、NF-κB顯著降低，mTOR顯著升高，提示右美托咪定保護(hù)缺血再灌注后腎臟損傷的作用機(jī)制可能與降低 IL-17A 的表達(dá)，抑制NF-κB 通路的活化和激活mTOR信號(hào)通路存在一定關(guān)系[14-16]。

綜上所述，IL-17A與大鼠腎缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，右美托咪定可能通過降低IL-17A表達(dá)，抑制NF-κB 通路的活化和激活mTOR信號(hào)通路，改善炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)腎缺血再灌注損傷。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

杜曉宣：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；陳燕：實(shí)施研究過程，數(shù)據(jù)收集，分析整理，論文修改;趙志靜、李亞璇、孫永東：實(shí)施研究過程，資料搜集整理