郭浩男，張莉力，馮琳琳，王天琪，王 成，趙昕琪，許云賀

（錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121001）

腸道微生物作為人體微生物群中種類最豐富的生態(tài)系統(tǒng)之一，微生物群高度多樣，在這個復雜的系統(tǒng)中，乳酸菌屬既是非消化性碳水化合物發(fā)酵的貢獻者，也是乳酸、醋酸等有機酸的生產者，產生的有機酸及短鏈脂肪酸具有調節(jié)腸道pH值、抑制腸道有害菌生長的功能[1]。 因此，為了促進胃腸道健康，人們食用發(fā)酵制品或含有乳酸菌等益生菌的制品作為營養(yǎng)補充劑，但考慮到腸道菌群對外來菌的定植抗性等因素，同時服用被這些益生菌選擇性代謝的益生元更是尤為重要[2]。低聚果糖、低聚麥芽糖等是眾所周知的益生元，在益生性食品加工中應用廣泛[3-6]。Makras等[7]發(fā)現(xiàn)，有些乳酸桿菌通過分泌β-果糖苷酶水解利用菊粉型低聚果糖，且利用不同長度及聚合度的低聚果糖，其代謝產物也不同。Zhang Yi等[8]研究表明，蓮子III型抗性淀粉對雙歧桿菌具有比葡萄糖等單糖更好的增殖作用。然而，由于烹飪條件及飲食習慣等原因，人結腸中存在大量未被人體消化代謝的碳水化合物，如未經糊化的生淀粉、老化淀粉等不同類型的抗性淀粉，這些淀粉作為潛在益生元存在于結腸中[9]。因此，尋找1 株可代謝這種“天然益生元”的益生菌意義重大，但目前對這類具有代謝生淀粉能力的益生性乳酸菌研究較少。

課題組前期在酸漿法沉降加工淀粉的研究中發(fā)現(xiàn)，從自然發(fā)酵酸漿中分離的乳酸菌能夠與淀粉特異性結合，將眾多的淀粉顆粒凝集成大的絮凝體，達到沉降效果[10-13]，并對其益生性進行了評價[14]。淀粉經過具有淀粉結合活性乳酸菌發(fā)酵后，可以顯著改變淀粉的化學成分、直鏈淀粉含量、淀粉老化速率、黏度及其溶解度和膨潤力[15]。Crittenden等[16]研究表明，一些雙歧桿菌的菌株能夠結合到淀粉顆粒表面，而這些能結合到淀粉顆粒上的菌均具有分泌淀粉酶并代謝淀粉的能力。Ze等[17]研究發(fā)現(xiàn)，結腸內的布氏瘤胃球菌屬利用淀粉時，淀粉水解蛋白與淀粉黏連蛋白結合在一起，構成了一個對生淀粉顆粒水解作用的“淀粉小體”結構。菌體表面具有淀粉結合結構域的酶與淀粉或低聚糖水解能力的糖苷水解酶GH13家族的酶相互錨定[18-19]。由此推測，微生物對基質的黏附為其代謝該基質提供了有利條件。生淀粉酶是指對不經過蒸煮糊化的生淀粉顆粒能表現(xiàn)出水解活性的一類酶[20]。通過實驗，初步證明了具有特異性結合淀粉活性的副干酪乳桿菌L1有代謝生淀粉的能力，推測L1具有分泌生淀粉酶的能力。

因此，選用1 株具有特異性結合淀粉活性的副干酪乳桿菌L1為研究對象，通過在生淀粉基質中培養(yǎng)，分析其產酶性質，純化后確定蛋白分子質量，觀察L1在不同來源生淀粉基質中的產酶情況，對產酶條件進行優(yōu)化，并對水解淀粉過程中的代謝產物進行研究，對乳酸菌在淀粉類基質中的應用有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

副干酪乳桿菌L1由錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院微生物實驗室保存，該菌株已保藏到中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC4163）。

1.1.2 試劑

甘薯、綠豆淀粉、玉米淀粉、甘薯淀粉均為市購；可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖標準品 美國Sigma公司；甲醇、乙腈、磷酸均為 色譜純；其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

甘薯汁培養(yǎng)基：甘薯200 g，無水乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，牛肉膏5 g，酵母浸粉10 g，葡萄糖22 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌15 min（前期優(yōu)化的L1最優(yōu)培養(yǎng)基）。

MRS肉湯培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g,牛肉膏5 g，酵母浸粉4 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.2 g，檸檬酸三銨2 g，硫酸錳0.05 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 000 mL。

tMRS培養(yǎng)基：未添加碳源的MRS肉湯培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；JB-VS-1300超凈工作臺 金壇市鑫鑫實驗儀器廠；DHP-9082恒溫培養(yǎng)箱 蘇州佳寶凈化工程設備有限公司；T20MM立式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；LC-15C型高效液相色譜儀（配有RID示差檢測器） 島津企業(yè)管理（中國）有限公司；Mini-Trans-Blot電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

取-80 ℃冰箱保存的菌種以10%接種量接于甘薯汁培養(yǎng)基，31 ℃培養(yǎng)24 h后，以4%接種量依次傳代，至菌液恢復絮凝活力后，擴大培養(yǎng)后備用，所有步驟均在超凈臺中操作。

1.3.2 L1產酶位置分析

將活化后的L1種子菌液以4%接種量接入無碳源的甘薯汁培養(yǎng)基，種子菌液用無菌水稀釋至OD600nm為1.0，生淀粉在熱空氣干燥箱中，以140 ℃干熱滅菌2 h后于超凈臺中加入培養(yǎng)基，在31 ℃連續(xù)培養(yǎng)5 d，每天測定酶活力。在4 ℃條件下，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，并通過0.45 nm細菌濾器過濾，沉淀用無菌蒸餾水洗滌2 次，相同條件下離心去上清液，并重懸于等體積無菌蒸餾水，以二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法對發(fā)酵液上清液、沉淀以及未離心全菌液進行酶活力測定。

1.3.3 生淀粉酶活力測定

參照Velikova等[21]的方法測定酶活力。以可溶性淀粉為底物，利用0.1 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制成質量分數(shù)2%的生淀粉懸液。首先在250 mL三角瓶中加入19 mL底物，于搖床培養(yǎng)箱中40 ℃預熱10 min，之后加入5 mL粗酶液，40 ℃、140 r/min恒溫振蕩1 h后，加入質量分數(shù)4%的NaOH溶液終止反應，取10 mL反應液于 5 000 r/min離心5 min，取上清液利用DNS法OD520nm測定還原糖含量。

酶活力定義為在40 ℃、pH 6.0條件下，1 h水解生淀粉酶產生1 μmol還原糖（以麥芽糖計）所需的酶量。

1.3.4 產酶誘導性及穩(wěn)定性分析

以tMRS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別以淀粉、葡萄糖、淀粉和葡萄糖混合物為碳源，并以tMRS為空白對照31 ℃下進行發(fā)酵，以24 h為一代次，進行5 次連續(xù)傳代，分別測定去細胞上清液及菌體沉淀的酶活力，并將上清液、沉淀酶活力之和作為總酶活力進行分析。

1.3.5 生淀粉酶的濃縮純化

取100 mL酶活力較高的菌液，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，加入硫酸銨至30%，過夜，將樣品離心，取上清液后加入硫酸銨至80%，充分沉降后，再次離心，取沉淀，加入等體積0.1 mol/L pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，置于透析袋中透析過夜，每2 h換一次水，用硫酸鋇檢測透析是否完全。將樣品置于截流量50 kDa的超濾管中，4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，濃縮至1 mL，冷凍保存。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）及基于Native-PAGE的酶譜分析

SDS-PAGE根據(jù)Komatsu等[22]的方法，使用10%分離膠和5%濃縮膠。在β-巰基乙醇存在下，將10 μL上樣緩沖液混合40 μL蛋白質溶液在100 ℃下加熱5 min，進行變性。電泳條件為濃縮膠80 V、分離膠120 V，考馬斯染色檢測蛋白條帶。

根據(jù)Karim等[23]的方法并加以改進，以Native-PAGE為基礎進行酶譜分析，將蛋白質溶液混合上樣緩沖液在70 ℃水浴4 min，然后進行（分離膠中加入1%可溶性淀粉）。電泳結束后，將凝膠在0.1 mol/L pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的冷溶液中振蕩30 min。將凝膠用水漂洗并置于0.3% I2、3% KI中染色5 min，然后將凝膠置于0.1 mol/L pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，直到從深藍色背景中可以看到亮帶。與SDS-PAGE不同的是，Native-PAGE的電泳液及上樣緩沖液中，均不含SDS和 β-巰基乙醇，且電泳電壓為濃縮膠60 V、分離膠100 V，電泳過程中冰浴，防止蛋白變性。

1.3.7 不同來源生淀粉對L1產酶活力分析

以tMRS為基礎培養(yǎng)基，甘薯生淀粉、綠豆生淀粉、玉米生淀粉、可溶性淀粉于熱空氣干燥箱中140 ℃干熱滅菌2 h，無菌條件下分別加入tMRS培養(yǎng)基中，L1菌液以4%接種量分別接入培養(yǎng)基中，在31 ℃培養(yǎng)48 h后，以1.3.3節(jié)方法測定淀粉上清液及沉淀酶活力，并對總酶活力進行分析。

1.3.8 副干酪乳桿菌L1產酶單因素試驗

淀粉占混合碳源（葡萄糖＋淀粉）的比例50%、碳源添加量2%、接種量4%、培養(yǎng)基初始pH 6.0、培養(yǎng)溫度35 ℃為單因素試驗固定條件，以淀粉酶活力為指標，選擇淀粉占碳源比例（50%、60%、70%、80%、90%）、碳源添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、培養(yǎng)基初始pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、培養(yǎng)溫度（20、25、30、35、40 ℃）5 個因素進行單因素試驗，并選出3 個對總酶活力影響較大的因素進行響應面分析。

1.3.9 乳酸菌產酶條件響應面試驗

根據(jù)單因素試驗結果，確定產酶影響顯著且有意義的因素，設計3因素3水平的響應面試驗，確定最佳的產酶條件。

1.3.10 代謝產物分析

1.3.10.1 L1淀粉水解產物變化情況

利用高效液相色譜測定葡萄糖與淀粉混合碳源、以淀粉為碳源的2 個實驗組在48 h內的發(fā)酵液中，葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖含量及變化情況。色譜柱：Waters Spherisorb NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm），色譜檢測條件：檢測器為RID示差檢測器，流動相（乙腈∶水=75∶25，V/V），進樣量20 μL，流速0.8 mL/min。

1.3.10.2 L1水解淀粉過程中產酸情況

根據(jù)響應面試驗的最優(yōu)產酶條件，利用高效液相色譜測定無碳源、葡萄糖與淀粉的混合碳源、以淀粉為碳源以及葡萄糖為碳源的4 個實驗組在48 h內的發(fā)酵液中乳酸、乙酸、檸檬酸、草酸、酒石酸的含量及變化情況。色譜柱：Cosmosil C18-PAQ（250 mm×4.6 mm，5 μL），色譜檢測條件：流動相（pH 2.0，磷酸∶乙腈= 98∶2，V/V），檢測波長210 nm，進樣量10 μL，流速0.8 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件中的One-Way ANOVA、Design-Expert V8.0.6響應面設計軟件進行數(shù)據(jù)處理，結果以±s表示；采用GraphPad Prism 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 L1產酶位置分析

表1 L1產酶位置分析Table 1 Amylase activity in the fermentation broth of L1 and centrifugal supernatant and precipitate

由表1可以看出，L1具有利用淀粉的能力，但不同位置酶活力差異顯著（P＜0.05）。去細胞上清液、菌體沉淀以及未離心的全菌液均檢測到淀粉酶活力，上清液中檢測出較高的淀粉酶活力，在培養(yǎng)第1天檢測出最高酶活力為（28.35±0.45）U/mL；菌體沉淀檢測出的酶活力顯著低于去細胞上清液（P＜0.05），在第3天檢測出最高酶活力為（16.46±0.37）U/mL，且5 d內，去細胞上清液的酶活力均顯著高于菌體沉淀（P＜0.05），由此可以看出，L1對淀粉的水解利用是胞外淀粉酶及菌體細胞表面淀粉酶共同作用的結果，并以去細胞上清液中的胞外淀粉酶占主導。不同的淀粉酶在淀粉顆粒上表現(xiàn)出不同的降解模式，包括離心水解和向心水解，通常α-淀粉酶比β-淀粉酶更有效[20]，這種復雜的酶水解系統(tǒng)使L1可能具有更復雜的淀粉水解模式。

與去細胞上清液、菌體沉淀的酶活力相比，未離心的全菌液酶活力顯著低于上清液及沉淀酶活力，可能的原因是，測定酶活孵育底物過程中，未離心的菌液具有滿足細菌生長的氮源、無機鹽等，而酶解出的還原糖為菌體生長提供碳源，被細菌所利用，導致檢測出酶活較低。

2.2 L1產酶的誘導性

表2 L1產酶誘導性及產酶穩(wěn)定性分析Table 2 Induction and stability analysis of amylase production by L1

如表2所示，L1在4 種培養(yǎng)基中連續(xù)傳代5 次，記錄每一代產酶情況，并對產酶誘導性及穩(wěn)定性進行分析。tMRS與tMRS＋淀粉組以及tMRS＋葡萄糖與tMRS＋葡萄糖＋淀粉組相比，添加淀粉組的酶活力均顯著高于不添加淀粉組（P＜0.05），且不同代次，這種現(xiàn)象均顯著 （P＜0.05），說明添加淀粉可以誘導L1分泌產生淀粉酶，且這種誘導性穩(wěn)定。這與大多數(shù)的淀粉分解乳酸菌（amylolytic lactic acid bacteria，ALAB）類似，在對ALAB的全基因組研究中，發(fā)現(xiàn)許多乳酸菌都含有負責水解淀粉的染色體，但只有被迫在淀粉環(huán)境中生存的菌株才能顯示出這些遺傳特征[24]。

通過對比添加淀粉為碳源的tMRS培養(yǎng)基中的酶活力（tMRS＋淀粉）及添加以葡萄糖和淀粉混合物為碳源的tMRS（tMRS＋葡萄糖＋淀粉）中酶活力，發(fā)現(xiàn)2 種培養(yǎng)基中淀粉存在的同時，葡萄糖的存在使tMRS＋葡萄糖＋淀粉組的酶活力顯著增加，檢測出了最大酶活力為（177.75±0.75）U/mL，與同代次的tMRS＋淀粉組的酶活力相比差異顯著（P＜0.05），最大酶活力為（67.52±0.57）U/mL?？赡艿脑蚴瞧咸烟亲鳛楦桌玫奶荚?，促使乳酸菌迅速生長，菌數(shù)的增加導致了酶活力的增加。Goh等[25]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖的存在也可能會與同為碳源的淀粉形成競爭抑制，過量的葡萄糖可能會抑制部分淀粉酶的表達，因此尋找葡萄糖與淀粉的最適比例尤為重要。

2.3 SDS-PAGE及酶譜分析

對初步純化的蛋白進行SDS-PAGE及酶譜分析，在變性條件和非變性條件下均顯示出了單一條帶，說明為同一蛋白。圖1A顯示出該生淀粉酶的估計分子質量為105 kDa。該分子質量在其他ALAB產的淀粉酶分子質量范圍內，如植物乳桿菌A6的分子質量為135 kDa[26]、木薯乳桿菌LMG18010的分子質量為140 kDa[27]。經碘染后，如圖1B所示，深藍色凝膠背景下出現(xiàn)一條淺色透明條帶，說明該位置的淀粉被水解，成功純化出了生淀粉酶。

圖1 生淀粉酶的SDS-PAGE（A）及酶譜（B）Fig. 1 SDS-PAGE (A) and zymogram (B) of raw starch-degrading amylase

2.4 不同來源生淀粉對L1產酶的影響

圖2 不同來源生淀粉對產酶活力的影響Fig. 2 Effect of raw starch from different sources on raw starchdegrading amylase activity

由圖2可知，L1對4 種不同來源生淀粉均具有水解利用能力。以不同來源淀粉為碳源的4 組，總酶活力均顯著高于未加碳源組的酶活力（P＜0.05），說明L1具有利用這4 種不同來源生淀粉的能力。可溶性淀粉組去細胞上清液酶活力為（29.193±0.30）U/mL，菌體沉淀的酶活力為（17.023±0.96）U/mL，其總酶活力顯著高于其他各組（P＜0.05）。甘薯淀粉組和綠豆淀粉組差異不顯著，總酶活力分別為（19.05±0.53）、（19.38± 0.43）U/mL，但均顯著高于玉米淀粉組（13.25± 0.29）U/mL（P＜0.05）。造成這種結果的因素有很多，淀粉顆粒的大小、淀粉的結晶程度、顆粒的形狀、磷含量以及直鏈、支鏈淀粉的比例等[28]，由于甘薯、綠豆、玉米淀粉的顆粒大小，結晶程度，直鏈、支鏈淀粉占碳源比例無法統(tǒng)一，為了下一步產酶優(yōu)化實驗具有良好的重復性，故選擇產淀粉酶活力最高，產酶最穩(wěn)定的可溶性淀粉為碳源。

2.5 L1產酶條件優(yōu)化

2.5.1 單因素試驗結果

圖3 5 種因素對L1產淀粉酶的影響Fig. 3 Effects of initial medium pH, starch proportion in total carbon source, carbon source concentration, culture temperature and inoculum amount on amylase production by L. paracasei L1

如圖3所示，初始pH 6.5、淀粉占碳源比例70%、碳源添加量2%、培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量4%時酶活力最高，由于初始pH值、淀粉占碳源比例、碳源添加量對淀粉酶活影響較大，因此選擇此3 個因素進行響應面優(yōu)化。

2.5.2 響應面設計與結果

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Box-Behnken design with experimental values

在單因素試驗基礎上，選擇培養(yǎng)基初始pH值、淀粉占碳源比例及碳源添加量3 個因素對產酶條件進行響應面優(yōu)化設計，響應面Box-Behnken試驗設計及結果見表3。

2.5.3 模型方差分析及響應面分析

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variances for the developed regression equation

由表4 可以看出， 響應面模型影響極顯著 （P＜0.01），而失擬項影響不顯著（P=0.760 3＞0.05），說明該回歸模型實際值與預測值擬合度高，適用于對酶活優(yōu)化的分析預測。回歸系數(shù)R2為0.999 5，模型校正決定系數(shù)R2Adj為0.998 8，表明因變量與試驗考察的自變量間線性關系顯著，數(shù)據(jù)誤差較小，結果可信。該模型的A、C、AB、AC、A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），考慮顯著項，得到回歸模型方程：Y=188.52＋3.67A-0.59B＋11.47C-12.47AB-11.68AC-1.44BC-17.72A2-45.66B2-108.38C2。方程中，一次項系數(shù)的絕對值決定了該模型中各個因素對結果影響的主次順序，因此，各因素影響排序為：碳源添加量＞淀粉占碳源比例＞初始pH值。各因素交互作用響應面見圖4。

圖4 各因素交互作用對生淀粉酶活力影響的響應面和等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors on the activity of raw starch-degrading amylase

2.5.4 產酶最佳條件確定及驗證實驗

使用Design-Expert 8.0.6得到模型極值點，pH 6.5、淀粉占碳源68%、碳源添加量2.03%條件下，酶活力最高為193.83 U/mL，以此結果進行了3 次重復獨立驗證實驗，得到的酶活力平均值為（191.64±0.63）U/mL，是理論回歸預測值的98.87%，說明該模型理論值與實際情況擬合度良好，適用于L1產酶條件的優(yōu)化。

2.6 L1利用淀粉代謝產物分析

2.6.1 L1水解淀粉產物變化分析

通過對L1在48 h利用淀粉的水解產物分析，檢測其水解產物在不同時間的變化情況，對L1的淀粉代謝途徑進行初步分析。

如圖5A所示，L1以淀粉為碳源代謝過程中，產生了葡萄糖、麥芽糖，以及不同聚合度的麥芽低聚糖。0～6 h水解初始階段，葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖質量濃度迅速上升，分別達到（0.52±0.01）、（2.47±0.03）、（1.51±0.35）mg/mL；6 h后，麥芽三糖含量逐漸減少，葡萄糖及麥芽糖含量增加，并于20 h時達到峰值，質量濃度分別為（1.02±0.03）、（2.99±0.64）mg/mL。20 h后，葡萄糖、麥芽糖質量濃度緩慢減小，而麥芽三糖被大量消耗。而在整個反應過程中，只檢測到了低質量濃度的麥芽四糖，這與Kanpiengjai等[29]研究的淀粉酶水解淀粉的代謝產物種類類似。

如圖5B所示，當L1代謝混合碳源初期，易于被菌體代謝的單糖首先被利用，抑制了麥芽糖及麥芽低聚糖的產生，隨著生長時間的延長，麥芽糖及麥芽三糖含量增加，10 h時達到峰值，質量濃度分別為（4.15±0.43）、（1.79±0.11）mg/mL。且在生長過程中，麥芽糖及麥芽三糖濃度出現(xiàn)短暫上升趨勢，這可能是淀粉酶水解的結果。

盡管混合碳源中存在菌體更易代謝的單糖，淀粉的水解作用依然存在。但容易代謝的單糖被優(yōu)先代謝至一定質量濃度后，淀粉水解作用才開始，從圖5可以看出，B組中麥芽糖和麥芽三糖出現(xiàn)時間與A組相比出現(xiàn)了延后。葡萄糖的存在沒有影響淀粉水解產物種類，這種淀粉水解代謝情況的可能作用途徑為：來源L1的淀粉酶首先將淀粉顆粒水解為大量麥芽糖和麥芽三糖，葡萄糖由麥芽糖或麥芽三糖水解而來，但葡萄糖是由麥芽三糖一步水解而來，還是通過麥芽糖這一中間產物代謝而來，就此問題討論大致分為兩個觀點。Busch等[30]研究結果表明，麥芽三糖可同時水解出麥芽糖和葡萄糖，與大部分文獻報道中淀粉酶水解淀粉反應類似。Suganuma等[31]研究提出，麥芽三糖作為催化劑，促進麥芽糖基轉移，從而降解麥芽糖生成葡萄糖。L1水解淀粉的淀粉酶種類將作為下一步的研究內容，進一步探究L1代謝生淀粉的機制。

圖5 副干酪乳桿菌L1碳水化合物變化分析Fig. 5 Changes in carbohydrates during fermentation of L. paracasei L1

2.6.2 L1代謝淀粉產酸分析

大多數(shù)乳酸菌產乳酸的同時，還有乙酸的產生，部分還產生甲酸、檸檬酸及琥珀酸[32-33]。在L1代謝過程中，未檢測出乙酸，屬于同型發(fā)酵菌株，草酸、酒石酸含量微少，且質量濃度在生長代謝過程中基本保持不變。

如圖6所示，與空白組相比，以淀粉組乳酸產量增加顯著（P＜0.05），12 h后乳酸含量趨于穩(wěn)定，第20小時乳酸質量濃度達到最大值（14.32±0.43）mg/mL，與江楊娟等[34]研究的乳酸菌代謝大豆糖蜜生產乳酸的最高產量12.18 mg/mL接近，說明L1在以淀粉為單一碳源的條件下，也具有較高的產乳酸能力。

圖6 副干酪乳桿菌L1產酸分析Fig. 6 Analysis of acid production during fermentation of L. paracasei L1

混合碳源組與淀粉組相比，L1生長前期產乳酸速率更高，可能的原因是，葡萄糖的存在縮短了L1的遲緩期，更快的到達對數(shù)期，菌數(shù)的增加導致產酶量增加，在這兩因素的共同作用下，產酸量顯著增加，第20小時乳酸質量濃度達到峰值為（21.45±0.20）mg/mL。 葡萄糖為碳源組與混合碳源組相比，盡管乳酸質量濃度最高為（32.42±0.76）mg/mL，但混合碳源組的葡萄糖添加量僅為32%，盡管以生淀粉為碳源略微降低了乳酸的產量，但由于生淀粉的廉價且不需要進行預處理，這種碳源顯示出了更高的經濟價值，在一步法生產乳酸的工藝中有著重要意義。

綜上所述，在生淀粉基質中，L1具有較好的產乳酸能力，在混合碳源中產酸，表現(xiàn)出了高效、高產的特點，是利用生淀粉一步法生產乳酸的潛力菌株。同時，同型發(fā)酵的特點也使其在食品發(fā)酵生產中有著更好的感官評價。

3 結 論

在對L1代謝生淀粉的研究中，發(fā)現(xiàn)L1在特異性結合淀粉的同時，水解并利用生淀粉來維持其生長。研究發(fā)現(xiàn)，生淀粉酶存在于菌體表面及上清液。生淀粉可以誘導L1分泌淀粉酶，該酶對不同來源的生淀粉均有代謝能力，純化后檢測其分子質量估計值為105 kDa，對培養(yǎng)條件優(yōu)化后酶活力可達到（193.83±0.63）U/mL。淀粉水解產物中的碳水化合物以葡萄糖、麥芽糖為終產物，麥芽低聚糖為中間產物，碳源中引入葡萄糖后，顯示出了葡萄糖優(yōu)先利用，淀粉次級利用的模式；L1具有較強的產乳酸能力，在混合碳源中，乳酸質量濃度最高可達（21.45±0.20）mg/mL，表現(xiàn)出高效、高產的特點，以生淀粉為碳源大大降低了成本，對乳酸菌在淀粉類基質中的應用有著重要意義，同時從代謝角度證明了副干酪乳桿菌L1有代謝生淀粉的能力。