馮美琴，欒曉旭，孫 健,

（1.金陵科技學(xué)院動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210038；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095）

脂肪的過度氧化是發(fā)酵香腸加工、貯存過程中面臨的主要質(zhì)量問題之一，常常造成產(chǎn)品風(fēng)味、色澤和質(zhì)地劣變而使發(fā)酵香腸的品質(zhì)降低、貯期縮短[1-2]，因此控制脂肪氧化程度對于發(fā)酵香腸的生產(chǎn)至關(guān)重要。添加抗氧化劑是降低產(chǎn)品氧化變質(zhì)的有效手段。量大價低、抗氧化效果好的合成抗氧化劑如丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯和特丁基對苯二酚等常被添加在產(chǎn)品中用來抑制脂肪的氧化[3]。然而，研究發(fā)現(xiàn)合成抗氧化劑存在一定的安全性和毒性問題，所以安全、無毒的天然抗氧化劑的開發(fā)應(yīng)用引起了研究者們的廣泛關(guān)注[4-6]。VE、VC、多酚類化合物、竹葉提取物及迷迭香提取物等被發(fā)現(xiàn)能夠有效地抑制脂肪的氧化。但這些天然抗氧化劑因成本過高或影響食品的感官，在實際使用上存在著局限性。

研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵肉制品中添加具有抗氧化潛能的發(fā)酵劑是減緩脂肪氧化的有效方法[7]。乳酸菌是香腸發(fā)酵成熟過程中重要的發(fā)酵劑之一。乳酸菌通過發(fā)酵不僅可以快速產(chǎn)酸、抑制腐敗菌和致病菌的生長繁殖，還能夠賦予產(chǎn)品獨特的風(fēng)味、提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價值，保證產(chǎn)品的品質(zhì)與安全性[8]。大量研究表明，許多乳酸菌都具有抗氧化活性，但是不同菌株之間的抗氧化能力存在差異性，因此篩選具有高抗氧化活性的乳酸菌作為天然抗氧化劑提高發(fā)酵肉制品的抗氧化功能具有重要的實踐意義[9]。乳酸菌在自然界廣泛存在，而來源于傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品的乳酸菌更利于用作肉制品發(fā)酵劑。李默等[10]從金華火腿等5 種發(fā)酵肉制品中成功篩選到了1 株具有較高抗氧化活性的肉制品發(fā)酵劑希臘魏斯氏菌L23。郭慧芬等[11]通過體外體內(nèi)抗氧化實驗從6 種傳統(tǒng)發(fā)酵肉類產(chǎn)品中分離篩選出1 株抗氧化活性較強(qiáng)的菌株X31，最終鑒定為戊糖片球菌。Chen Qian等[7]報道了分離自哈爾濱紅腸的戊糖片球菌R1具有較高的抗氧化活性、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性，用該菌株接種生產(chǎn)香腸可以顯著降低脂肪氧化程度。Chen Qian等[12]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用該戊糖片球菌和彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌、木糖葡萄球菌混菌發(fā)酵生產(chǎn)香腸可以延緩肌肉蛋白質(zhì)氧化。相較于泡菜、酸奶等其他發(fā)酵食品，有關(guān)中國傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中抗氧化乳酸菌的篩選與應(yīng)用的報道較少。

本課題組前期從12 種傳統(tǒng)發(fā)酵香腸中篩選到3 株符合肉品發(fā)酵劑要求的乳酸菌，即發(fā)酵乳桿菌GZ114、植物乳桿菌NJ107和KM119[13]。本研究擬以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、Fe2＋螯合能力、還原能力等體外抗氧化指標(biāo)和SOD、GSH-Px和過氧化氫酶（catalase，CAT）等酶活力指標(biāo)系統(tǒng)評價3 株乳酸菌發(fā)酵上清液、菌體細(xì)胞和破碎提取物的體外抗氧化活性，并通過對3 株菌的疏水能力、耐模擬胃腸液消化能力和耐膽鹽能力檢測初步評價其益生特性，以期為具有較高抗氧化活性的功能性肉制品發(fā)酵劑的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum KM119，NCBI編號為MG798686）、發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum GZ114，NCBI編號為MG798687）、植物乳桿菌 （L. plantarum NJ107，NCBI編號為MG798688）均為本實驗室由傳統(tǒng)發(fā)酵香腸中分離所得。

1.1.2 試劑

胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛膽鹽、8-苯胺-1-萘磺酸（分析純）、DPPH（分析純） 美國Sigma公司；菲啰嗪 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MSA固體培養(yǎng)基、MRS肉湯 青島海博生物科技有限公司；SOD試劑盒、CAT試劑盒、GSH-Px試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他常規(guī)試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

OptiMairTM垂直流超凈工作臺 新加坡藝思高科技有限公司；HVE-50自動高壓滅菌 日本Hirayama公司； ICP260生化培養(yǎng)箱 德國Memmert公司；自動影像分析菌落計數(shù)儀 法國Interscience公司；Spectral Max M2e多功能酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；HH-42快速恒溫水浴箱 常州國華電器有限公司；SIM-F-124制冰機(jī) 日本Sanyo公司；WH-2微型渦旋混合儀 上海滬西分析儀廠有限公司；YP1201N電子天平 上海 精密科學(xué)儀器公司；PTF-A300型萬分之一電子天平 瑞士Precisa公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)及樣品制備

菌種在MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)18 h，傳代3 次，取最后一次活化的菌液4 ℃、6 000×g離心10 min，分別收集上清液和菌體。上清液經(jīng)0.22 μm的水系濾膜過濾，即為發(fā)酵上清液。菌體用超純水洗滌3 次后重懸，并將菌體數(shù)調(diào)整為109CFU/mL，分為2 份。1 份菌液作為菌體細(xì)胞，另一份經(jīng)冰浴超聲破碎細(xì)胞（300 W，工作2 s，暫停2 s，共10 min），破碎液于4 ℃、10 000×g離心15 min，收集上清液，鏡檢無完整細(xì)胞，即為破碎提取物。

1.3.2 抗氧化活性測定

1.3.2.1 DPPH自由基清除能力測定

參考Maryam等[14]的方法，測定DPPH自由基清除活性。

1.3.2.2 羥自由基清除率測定

根據(jù)Chen Qian等[7]的方法，測定羥自由基清除率。

1.3.2.3 超氧陰離子自由基清除率測定

參考Das等[15]的方法，測定超氧陰離子自由基清除率。

1.3.2.4 還原力測定

根據(jù)李默等[10]的方法，測定還原力。

1.3.2.5 螯合Fe2＋能力的測定

根據(jù)王剛等[16]的方法，測定Fe2＋螯合率。

1.3.2.6 SOD、CAT、GSH-Px活力測定

采用試劑盒，按照說明書使用。

1.3.3 乳酸菌疏水能力測定

參考陳明等[17]的方法，活化好的菌種于MRS液體培養(yǎng)基中在37 ℃培養(yǎng)18 h，4 ℃、10 000×g離心1 min，用pH 6.2 0.1 mol/L的硝酸鉀溶液洗滌2 次，重懸菌液，在600 nm波長處測定溶液吸光度，記為Ac。將菌懸液與二甲苯混勻（3∶1，V/V），室溫孵育10 min，劇烈混勻2 min，室溫靜置分層，測定下層水相的吸光度，記為As，按式（1）計算乳酸菌的疏水能力：1.3.4 乳酸菌耐胃腸液能力測定

模擬胃腸液的配制參考陳明等[17]的方法，將活化好的菌液按10%接種到模擬胃液中，混勻后于37 ℃靜置培養(yǎng)3 h，分別測定第0小時和第3小時培養(yǎng)液的活菌數(shù)。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液與模擬腸液按1∶9混合均勻，于37 ℃靜置培養(yǎng)3 h，測定培養(yǎng)液的活菌數(shù)，存活率按式（2） 計算：

式中：Nc和Ns分別為培養(yǎng)前后的乳酸菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.5 乳酸菌耐膽鹽能力測定

參考劉宏宇等[18]的方法，將活化好的菌種按2%接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，4 ℃、6 000×g離心10 min后收集菌體，洗滌，重懸于含5 mg/mL牛膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)4 h。分別在第0小時和第4小時進(jìn)行活菌計數(shù)，存活率計算同1.3.4節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的抗氧化活性比較

2.1.1 DPPH自由基清除能力比較

圖1 乳酸菌對DPPH自由基的清除能力Fig. 1 DPPH radical scavenging ability of lactic acid bacteria

如圖1所示，3 株菌各組分均表現(xiàn)出一定的DPPH自由基清除效果，但清除能力差異較大。發(fā)酵上清液的清除率顯著高于其他2 個組分（P＜0.05），其中GZ114的清除率最高，可達(dá)91.93%。菌體細(xì)胞組KM119的清除活性最強(qiáng)，相當(dāng)于其發(fā)酵上清液活性的48%左右；GZ114的清除活性最弱，清除率僅為33.73%。而破碎提取物的清除活性較弱，活性最強(qiáng)的為NJ107，清除率分別比KM119和GZ114高2%和3%左右，但僅為其發(fā)酵上清液清除率的10%左右。李默等[10]研究發(fā)現(xiàn)，分離自發(fā)酵肉制品的30 株乳酸菌的菌體細(xì)胞和胞內(nèi)提取物的DPPH自由基清除活性較弱，而發(fā)酵上清液的DPPH自由基清除活性可高達(dá)91.24%，與本實驗結(jié)果一致。發(fā)酵上清液的DPPH自由基清除能力可能與菌株分泌的胞外多糖等胞外代謝產(chǎn)物有關(guān)，菌體細(xì)胞的清除能力則與菌體表面的化學(xué)物質(zhì)如表面蛋白或多糖有關(guān)[19]。結(jié)果表明，3 株乳酸菌清除DPPH自由基的活性物質(zhì)主要存在于胞外代謝產(chǎn)物中和菌體表面，細(xì)胞內(nèi)則較少。

2.1.2 羥自由基清除能力的比較

羥自由基是具有強(qiáng)氧化性的自由基，會引起生物分子的氧化損傷。羥自由基清除劑的加入可猝滅體系中的羥自由基，生成Fe2＋，引起體系吸光度的升高[20]。由圖2可知，菌體細(xì)胞的羥自由基清除率均高于其他2 個組分，KM119清除活性最強(qiáng)，可達(dá)37.61%，與其他菌株間差異顯著（P＜0.05）。發(fā)酵上清液組活性次之，NJ107清除率最高，約為其菌體細(xì)胞活性的73%。破碎提取物組活性最弱，清除率均低于10%，該結(jié)果與郭慧芬等[11]的報道類似。王曦等[20]也報道35 株乳酸菌僅菌體細(xì)胞表現(xiàn)出一定羥自由基清除能力，無細(xì)胞提取物和胞外分泌物的清除活性較弱甚至為零。羥自由基造成的氧化損傷主要源自Fe2＋和Cu2＋等過渡金屬離子存在時的芬頓反應(yīng)，抗氧化劑可以通過螯合這些離子抑制羥自由基的產(chǎn)生。

圖2 乳酸菌對羥自由基的清除能力Fig. 2 Hydroxyl radical scavenging ability of lactic acid bacteria

2.1.3 超氧陰離子自由基清除能力的比較

圖3 乳酸菌對超氧陰離子自由基的清除能力Fig. 3 Supernatant cation radical scavenging ability of lactic acid bacteria

由圖3可知，菌體細(xì)胞的超氧陰離子自由基清除活性最強(qiáng)，且各菌株活性較為接近，清除率在94%左右。破碎提取物組中GZ114的清除活性最強(qiáng)（91.2%），顯著高于其他兩菌株（P＜0.05），與其發(fā)酵上清液能力相當(dāng)。發(fā)酵上清液組NJ107的清除活性最弱，清除率僅為52.73%，但仍高于文獻(xiàn)報道的清除率（36.38%）[21]。乳酸菌存在的抗氧化酶如SOD、GSH-Px和CAT及其他氧化酶類是清除超氧陰離子自由基的重要酶促防御系統(tǒng)[21]。3 株乳酸菌的各組分均具有良好的超氧陰離子自由基清除活性，說明乳酸菌的各個組分中均可能檢測到抗氧化酶活性。

2.1.4 Fe2＋螯合能力的比較

過渡金屬離子會促進(jìn)氧化損傷，而Fe2＋是最典型的促氧化劑，若能被螯合則可以阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的啟動。由圖4可知，菌體細(xì)胞組Fe2＋螯合活性最高，與其他2 個組分間差異顯著（P＜0.05），其中NJ107的Fe2＋螯合率最高（77.13%）。發(fā)酵上清液組中GZ114活性最強(qiáng)，但僅相當(dāng)于其菌體細(xì)胞活性的37.45%，KM119活性最弱（16%）。破碎提取物組中最高的為NJ107，其螯合率分別比KM119和GZ114高3%和11%左右。以上結(jié)果表明，3 株乳酸菌均具有良好的Fe2＋螯合活性，菌株及組分間的差異可能是由于不同菌株螯合Fe2＋的活性物質(zhì)的種類、含量和分布不同引起的。Kai等[22]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌ME-3和干酪乳桿菌KCTC 3260的抗氧化效果是通過螯合金屬離子實現(xiàn)。由此可推斷3 株乳酸菌可通過螯合金屬離子提高抗氧化水平。

圖4 乳酸菌對Fe2＋螯合能力Fig. 4 Fe2+ chelating ability of lactic acid bacteria

2.1.5 還原力的比較

還原力主要是指通過酶（CAT、NADH氧化酶和NADH過氧化物酶等）和非酶復(fù)合物（VC、VE和GSH等）減少氧自由基和金屬離子的能力[23-24]，常作為評價抗氧化活性的重要指標(biāo)。由圖5可知，發(fā)酵上清液組的還原能力最強(qiáng)，菌株間差異不大，GZ114最高；菌體細(xì)胞組其次，約為上清液的60%～65%；破碎提取物組的還原能力最低，其中最高的GZ114也僅相當(dāng)于其發(fā)酵上清液的25.56%。Chen Qian等[7]認(rèn)為細(xì)胞表面蛋白質(zhì)或多糖可作為還原化合物以減少氧化應(yīng)激，由此可以推測具有還原活性的胞外分泌物和菌體表面物質(zhì)可能是3 株乳酸菌表現(xiàn)還原力的主要原因，而破碎提取物的還原能力則可能來自于細(xì)胞內(nèi)的抗氧化成分如NADH、NADPH、谷胱甘肽、尿酸及各類抗氧化酶等。

圖5 乳酸菌的還原能力Fig. 5 Reducing power of lactic acid bacteria

2.1.6 酶活力比較

乳酸菌的酶促抗氧化防御系統(tǒng)被認(rèn)為是抵御氧化損傷的一道重要屏障，其中抗氧化酶系統(tǒng)主要包括SOD、GSH-Px和CAT等[25]。本研究通過試劑盒測定法對3 株乳酸菌的SOD、GSH-Px和CAT抗氧化物酶水平進(jìn)行了比較。

表1 乳酸菌的SOD活力Table 1 SOD activity of lactic acid bacteria

如表1所示，3 株菌發(fā)酵上清液中SOD活力為23 U/mL 左右，顯著高于菌體細(xì)胞（P＜0.05），破碎提取物未檢出SOD活性。結(jié)果表明，3 株乳酸菌的SOD主要存在于胞外分泌物中，少部分附著于細(xì)胞表面。

表2 乳酸菌的GSH-Px活力Table 2 GSH-Px activity of lactic acid bacteria

由表2可知，3 株菌各組分均有一定的GSH-Px活力，發(fā)酵上清液組的GSH-Px活力顯著高于菌體細(xì)胞和破碎提取物。GZ114發(fā)酵上清液酶活力最高（36.30 U/mL）， KM119破碎提取物酶活力最低（10.16 U/mL）。NJ107破碎提取物的酶活力達(dá)27.46 U/mL，高于其發(fā)酵上清液（P＜0.05）；KM119菌體細(xì)胞的酶活力為16.83 U/mL， 顯著高于其破碎提取物（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，GSH-Px在不同乳酸菌菌株中的含量和分布不同。

由表3可知，菌株GZ114三組分的CAT活力較高，發(fā)酵上清液中活力最高（4.84 U/mL），與其余2 株菌差異顯著（P＜0.05）；NJ107次之，其中菌體細(xì)胞的活力最高；KM119活力最弱，且菌體細(xì)胞中未檢測出CAT。此外，CAT活力總體較弱，顯著低于同組分的SOD和 GSH-Px活力（P＜0.05）。

表3 乳酸菌的CAT活力Table 3 CAT activities of lactic acid bacteria

SOD具有清除超氧陰離子自由基的能力，GSH-Px和CAT則能夠清除過氧化物和羥自由基。結(jié)合圖2、3可知，3 株乳酸菌的羥自由基清除率與GSH-Px和CAT含量不呈正比，超氧陰離子自由基清除活性與SOD活力也不呈正相關(guān)，說明除了抗氧化酶類，3 株乳酸菌還含有其他可以清除羥自由基和超氧陰離子自由基的活性物質(zhì)[26-28]。以上結(jié)果表明，3 株乳酸菌的抗氧化活性是抗氧化酶和其他非酶抗氧化物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

2.2 乳酸菌的疏水能力

能夠黏附于宿主細(xì)胞的表面是乳酸菌定植于腸道中發(fā)揮益生作用的前提，而菌體表面的疏水性與黏附能力有一定的相關(guān)性，因此菌體表面疏水性常常被用來評價乳酸菌的黏附性能[29]。如圖6所示，NJ107的疏水能力最強(qiáng)（13.45%），顯著高于其余2 株乳酸菌（P＜0.05）。KM119的疏水能力次之，為8.85%，GZ114的疏水能力最差，僅為6.34%。結(jié)果表明，菌種不同疏水性有差異，即使菌種相同，在菌株水平上，疏水性也具有差異性，這一結(jié)論與占萌等[29]和Murphy[30]的研究一致。研究表明，細(xì)菌的表面疏水性與細(xì)菌的非特異性黏附密切相關(guān)[31-32]，疏水性高的乳酸菌可與消化道上皮細(xì)胞間形成較強(qiáng)的相互作用力，有益于細(xì)菌附著。李清等[33]分析了10 株植物乳桿菌的表面疏水性，證實疏水性與細(xì)胞黏附能力呈正相關(guān)。由此推測NJ107可能具有較好的黏附能力，有助于其益生功能的發(fā)揮。

圖6 乳酸菌的疏水能力Fig. 6 Hydrophobic ability of lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌耐胃腸道消化能力

乳酸菌只有具備良好的耐胃腸道消化能力，保持較高的存活率才能發(fā)揮其益生功能。如表4所示，3 株菌均具有良好的耐消化能力。其中，在模擬胃液（pH 3.0）中消化3 h后，3 株乳酸菌的存活率均在87%以上，NJ107存活率最高，為89.17%，與其他2 株菌差異不顯著 （P＞0.05）。繼續(xù)在模擬腸液中消化3 h，NJ107仍可保持75.79%的存活率，GZ114次之，均顯著高于KM119的存活率（P＜0.05）。Han Qi等[34]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌對人體消化液有良好的耐受能力，與本實驗結(jié)果類似?？傮w而言，經(jīng)模擬胃腸液消化后菌株存活率高低依次為NJ107、GZ114、KM119，且3 株菌的存活率均在70%以上，說明3 株菌對模擬胃腸液都有較好的耐受性。

表4 乳酸菌在模擬胃腸液中消化后的存活率Table 4 Survival rates of lactic acid bacteria after digestion in simulated gastrointestinal

2.4 乳酸菌耐膽鹽能力

腸液的主要成分為胰液和膽汁，因此益生菌要在人體腸道內(nèi)發(fā)揮作用，除要具有良好的耐胃腸道酶系消化能力外，還應(yīng)具有一定的膽鹽耐受能力。膽鹽在腸道中質(zhì)量濃度一般為0.3～3 mg/mL，本實驗設(shè)計了5 mg/mL的高膽鹽質(zhì)量濃度比較3 株菌對膽鹽的耐受能力。由表5可知，在5 mg/mL的高膽鹽環(huán)境中培養(yǎng)4 h后，KM119的存活率高達(dá)91.45%，顯著高于其他2 株菌（P＜0.05），NJ107和GZ114的耐膽鹽能力相對稍低，4 h后的存活率在76%左右。劉宏宇等[18]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌對5 mg/mL膽鹽的耐受能力較差，與本研究結(jié)果不同，這可能與菌種差異或菌株來源有關(guān)。結(jié)果表明，3 株菌均具有良好的耐膽鹽能力，具備作為功能性發(fā)酵劑開發(fā)利用的潛力。

表5 乳酸菌的膽鹽耐受能力Table 5 Bile salt tolerance capacities of lactic acid bacteria

3 結(jié) 論

本實驗比較了分離自傳統(tǒng)發(fā)酵香腸、具有良好發(fā)酵特性的3 株乳酸菌的抗氧化活性、表面疏水性、耐胃腸道消化能力和耐膽鹽能力。結(jié)果表明，3 株菌均具有良好的體外抗氧化活性，但不同的抗氧化指標(biāo)測得的菌株間和各組分間的抗氧化活性差異較大，這可能與抗氧化反應(yīng)機(jī)制及菌株中抗氧化活性物質(zhì)的分布、種類、濃度不同有關(guān)。綜合而言，3 株菌的發(fā)酵上清液和菌體細(xì)胞的抗氧化活性明顯高于破碎提取物，為今后3 株乳酸菌作為天然抗氧化劑的應(yīng)用提供了參考依據(jù)。菌株表面疏水性高低依次為NJ107＞GZ114＞KM119，3 株菌在模擬胃腸道酶系消化、0.5%高濃度膽鹽環(huán)境下均能保持較高的存活率。因此，3 株乳酸菌均可作為高抗氧化活性的功能性肉品發(fā)酵劑用于實際生產(chǎn)或益生性產(chǎn)品的進(jìn)一步研究。