張曉亮，張 毅

（天津工業(yè)大學(xué)紡織科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300387）

膠原蛋白是天然細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的主要成分，是哺乳動物組織中最常見的蛋白質(zhì)[1-3]，它可以作為一種生物醫(yī)用材料廣泛應(yīng)用于組織工程、醫(yī)用創(chuàng)傷敷料、藥物緩釋等領(lǐng)域，同時在食品和化妝品行業(yè)也有著廣泛的應(yīng)用[4-6]。兔皮中膠原蛋白含量高，而且在功能性質(zhì)等方面優(yōu)于水產(chǎn)類膠原蛋白，同時不存在豬皮、牛跟腱膠原蛋白在疫病等方面的限制，因此可以作為一種新的膠原原料[7-8]。

膠原蛋白凝膠是膠原蛋白分子在溶液中形成的具有三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的一種生物材料，它作為膠原蛋白一種重要的應(yīng)用形式，在食品、藥物緩釋材料、膠原海綿和膠原膜的制備等方面有著廣泛應(yīng)用[9-10]。國內(nèi)外對于膠原蛋白凝膠的研究多集中在凝膠的功能性和應(yīng)用性，而對于膠原蛋白形成凝膠條件的研究卻鮮有報道[11-12]。本實驗采用酸法從兔皮中提取膠原蛋白[13-15]，并對其理化性能進行分析，其次采用透析法制備膠原蛋白凝膠[16]，并且通過流變學(xué)分析pH值、溫度、濃度對兔皮膠原蛋白（rabbit skin collagen，RSC）溶液存儲模量（G’）和損耗模量（G”）的影響，進而探究這3 種條件對RSC形成凝膠的影響[17-18]。然后通過多組試驗獲得廣泛的數(shù)據(jù)，最后構(gòu)建多元非線性數(shù)學(xué)模型，從理論上闡述pH值、溫度、質(zhì)量濃度與G’和G”的數(shù)學(xué)關(guān)系，進而得到RSC溶液形成兔皮膠原蛋白凝膠（RSC-gel）的臨界條件，為膠原蛋白凝膠的形成及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉兔皮 山東中梁農(nóng)業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司；乙酸、NaOH、NaCl（均為分析純），KBr（光譜純） 天津風(fēng)船試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QSJ-C03A1打漿機 小熊電器股份有限公司；pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGL-16M離心機 湘儀（長沙）有限公司；SCIENTZ-10N真空冷凍干燥機 寧波新芝有限公司；MD 8000～14000透析袋 美國Sigma公司；CVO流變儀 英國Malvern公司；Evolution 201紫外-可見光分光光度計、Nicolet iS50型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Themo Fisher公司；LA8080型氨基酸分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 RSC的提取

將冷凍的兔皮用去離子水洗凈后剪成1 cm2塊狀，然后置于0.1 mol/L的NaOH溶液中攪拌16 h，除去兔皮上的非膠原物質(zhì)。將洗凈后的兔皮放入1 mol/L的乙酸溶液中，待兔皮溶脹后，用打漿機將兔皮打成漿狀，繼續(xù)加入上述乙酸溶液，使兔皮與乙酸溶液料液比為 1∶30（g/mL）。水解48 h后以10 000 r/min離心30 min，用5 mol/L的NaOH溶液將上清液的pH值調(diào)至中性，邊攪拌邊加入NaCl鹽析，使其最終濃度為5 mol/L。將鹽析出來的蛋白質(zhì)以10 000 r/min離心30 min后復(fù)溶在1 mol/L的乙酸溶液中，然后以去離子水為透析液，將離心得到的蛋白質(zhì)置于透析袋中，每6 h更換一次透析液，透析72 h后進行冷凍干燥，得到白色的兔皮膠原海綿。

1.3.2 RSC的提取率

根據(jù)GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》[19]分別測定兔皮（濕）和RSC的羥脯氨酸含量，根據(jù)羥脯氨酸的含量計算RSC的提取率，如式（1） 所示：

1.3.3 氨基酸分析

采用氨基酸分析儀對RSC進行分析。

1.3.4 有機波譜分析

紫外-可見光光譜分析：將RSC溶解在1 mol/L的乙酸溶液中，以該乙酸溶液為空白在190～600 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，步長1 nm，積分時間0.05 s。

傅里葉變換紅外光譜分析：在干燥條件下，將RSC粉末與KBr混合、壓片，光譜掃描范圍500～4 000 cm-1， 分辨率2 cm-1。

1.3.5 熱變性溫度的測定

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的RSC溶液，通過流變儀測定溶液在不同溫度下的黏度值，溫度范圍為10～50 ℃，升溫速率為5 ℃/min。

1.3.6 外部條件對RSC-gel形成的影響

1.3.6.1 溶液pH值對RSC-gel形成的影響

配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的RSC溶液，置于透析袋中透析，在不同pH值時取樣，選用流變儀的振蕩模式測定溶液的G’與G”，測試夾具為20 mm平板，間隙為1 000 μm，振蕩頻率為0.2 Hz，振蕩應(yīng)力為0.08 Pa，測試溫度為25 ℃。

1.3.6.2 溶液質(zhì)量濃度對RSC-gel形成的影響

配制質(zhì)量濃度為7、7.5、8、8.5、9 mg/mL的RSC溶液，置于透析袋中透析，在溶液pH 5時取樣，選用流變儀的振蕩模式測定溶液的G’與G”，流變儀其他參數(shù)設(shè)置同1.3.6.1節(jié)。

1.3.6.3 溫度對RSC-gel的形成的影響

配制質(zhì)量濃度為8 mg/mL RSC溶液，置于透析袋中透析，在pH 5時取樣，采用連續(xù)升溫模式，選用流變儀的振蕩模式測定溶液的G’與G”，溫度測試范圍為15～40 ℃，升溫速率為2 ℃/min，流變儀其他參數(shù)設(shè)置同1.3.6.1節(jié)。

1.3.7 RSC-gel的凝膠臨界條件分析

分別配制質(zhì)量濃度為6、8、10、12、20 mg/mL的RSC溶液，置于透析袋中透析，在不同pH值時，選用流變儀的振蕩模式分別測量不同溫度條件下RSC溶液的G’與G”，流變儀其他參數(shù)設(shè)置同1.3.6.1節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將所得實驗數(shù)據(jù)通過Matlab軟件對數(shù)據(jù)進行分析并建立回歸模型，使用SAS軟件對回歸模型進行檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 RSC的提取率

羥脯氨酸是膠原蛋白特有的亞氨基酸，通過比色法測定提取前后羥脯氨酸含量的變化，可以準(zhǔn)確描述膠原蛋白的提取率[20]。按照GB/T 9695.23—2008方法，以羥脯氨酸濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.01＋0.19X，R2=1。通過計算得RSC提取 率為69.18%。

2.2 氨基酸分析

表1 RSC氨基酸分析結(jié)果Table 1 Amino acid composition of RSC

從表1可以看出，RSC氨基酸總量為95.666%，含有7 種必需氨基酸與11 種非必需氨基酸，必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.623%，非必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為81.043%，其中羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.725%，可以作為一種補充氨基酸的食品源膠原蛋白。

2.3 有機波譜分析

2.3.1 紫外-可見光光譜分析

圖1 RSC的紫外-可見光光譜圖Fig. 1 UV spectrum of RSC

紫外吸收與肽鏈中的—COOH以及肽鍵中C＝O的n→π*躍遷有關(guān)[20]。從圖1可以看出，RSC的紫外最大吸收波長位于237 nm，與其他I型膠原蛋白類似，說明RSC為I型膠原蛋白[21]。而且RSC在283 nm和251 nm波長處均無明顯的紫外吸收，表明RSC含有很少的苯丙氨酸和酪氨酸，與氨基酸分析結(jié)果一致，同時RSC紫外吸收圖譜無其他的紫外吸收峰，表明提取得到的RSC純度高，不含有其他種類的蛋白質(zhì)[22]。

2.3.2 傅里葉變換紅外光譜分析

圖2 RSC的紅外光譜圖Fig. 2 FTIR spectrum of RSC

由圖2可知，RSC的紅外光譜圖的特征峰有酰胺A、B和酰胺I、II、III帶。酰胺A（3 440 cm-1）是由N—H鍵的伸縮振動引起的，表明RSC之間具有較多的氫鍵[23]；酰胺B位于2 930 cm-1處，它是由C—H鍵的伸縮振動導(dǎo)致的。與其他膠原蛋白相比[24]，RSC酰胺I帶的吸收峰（1 640 cm-1）和酰胺II帶的吸收峰（1 550 cm-1）由高頻區(qū)轉(zhuǎn)入低頻區(qū)，表明RSC具有更高的結(jié)構(gòu)秩序。酰胺III帶位于1 250 cm-1，1 450 cm-1處的峰面積與酰胺III帶的吸收峰面積比接近1∶1，說明RSC保持了完整的三螺旋結(jié)構(gòu)[25]。

2.4 熱變性溫度分析

圖3 RSC溶液黏度隨溫度變化關(guān)系Fig. 3 Relationship of collagen solution viscosity with temperature

膠原蛋白的變性溫度可以通過測定其在不同溫度下的黏度值獲得，RSC溶液黏度值下降50%時的溫度即為RSC變性溫度[26]。由圖3可知，隨著溫度的升高，RSC溶液黏度值逐漸下降，其熱變性溫度為35.8℃，與中華鱉裙邊膠原蛋白的變性溫度相當(dāng)（36.5 ℃），但高于鱈魚皮（20 ℃）膠原蛋白的變性溫度[27-28]。

2.5 外部條件對RSC-gel形成的影響

膠原蛋白分子在溶液中形成凝膠的實質(zhì)是溶液中分子由無序狀態(tài)向有序空間結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，可以通過測定Maxwell力學(xué)模型中G’和G”描述這種變化過程[16]。G’描述的是材料存儲彈性變形能量的能力，是測定材料變形后回彈的指標(biāo)，通常表征材料的類固體行為；G”是指材料在發(fā)生形變時，由于黏性形變而損耗的能量大小，反映材料黏性大小，通常表征材料的類液體行為。

當(dāng)G’＜G”時，溶液呈液態(tài)，可近似看作是一種黏性液體；隨著G’增加，當(dāng)G’=G”時，溶液呈半固態(tài)，凝膠開始形成；隨著G’持續(xù)上升，當(dāng)G’＞G”時，溶液逐漸由半固態(tài)向類固態(tài)轉(zhuǎn)變。

2.5.1 pH值對RSC-gel形成的影響

圖4 RSC溶液pH值對凝膠的影響Fig. 4 Effect of pH on RSC gelation

從圖4可以看出，開始時，隨著pH值的升高，RSC溶液的G’和G”變化很小，且G’＜G”，這是由于溶液中的 H＋抑制了分子間氫鍵的形成，使得此時的RSC溶液具有液體的性質(zhì)；而隨著透析的進行，溶液pH值逐漸增大，H＋濃度逐漸減小，氫鍵等分子間作用力逐漸增強，RSC分子間產(chǎn)生更多的糾纏和網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，溶液開始向凝膠態(tài)轉(zhuǎn)變，G’和G”均逐漸增大，且G’增大的速率高于G”，當(dāng)G’≥G”時，溶液處于凝膠態(tài)。當(dāng)G’=G”時，RSC溶液處于臨界凝膠態(tài)[29]。

2.5.2 RSC溶液質(zhì)量濃度對RSC-gel形成的影響

圖5 RSC溶液質(zhì)量濃度對凝膠的影響Fig. 5 Effect of collagen concentration on RSC gelation

從圖5可以看出，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度較低時，兩種模量值很小，這是由于溶液中RSC分子的數(shù)目較少，此時 G’＜G”，溶液還處于液態(tài)；而隨著膠原蛋白質(zhì)量濃度的增加，溶液中RSC分子數(shù)增加，G’和G”都逐漸增大，且G’的增長速率大于G”，當(dāng)G’=G”時，溶液處于臨界 凝膠態(tài)[30]。

2.5.3 溫度對RSC-gel形成的影響

圖6 RSC溶液溫度對凝膠的影響Fig. 6 Effect of temperature on RSC gelation

從圖6可以看出，當(dāng)體系溫度較低時，溶液的兩種模量較高，這是由于分子熱運動小，此時G’＞G”，體系處于凝膠態(tài)；而隨著溫度的升高，分子熱運動逐漸加劇，兩種模量均呈下降趨勢，且G’的下降速率大于G”，當(dāng)G’=G”時，溶液處于臨界凝膠態(tài)；當(dāng)G’＜G”時，分子熱運動加劇，溶液處于非凝膠態(tài)。

從圖4、5可以看出，RSC溶液的pH值和質(zhì)量濃度與凝膠形成呈正相關(guān)，且兩種模量隨pH值和濃度的變化近似指數(shù)函數(shù)關(guān)系；而從圖6可看出，RSC溶液溫度與凝膠形成呈負(fù)相關(guān)，且在凝膠點附近，RSC溶液的兩種模量隨著溫度的升高而降低，近似于負(fù)相關(guān)的指數(shù)關(guān)系，因此可以通過構(gòu)建一個數(shù)學(xué)模型描述pH值、質(zhì)量濃度、溫度對RSC-gel模量的影響，以此確立凝膠的臨界條件。

2.6 RSC-gel臨界條件分析

2.6.1 數(shù)據(jù)處理與線性化轉(zhuǎn)變

將pH值、溫度、質(zhì)量濃度3 個指標(biāo)的數(shù)據(jù)作為自變量x，構(gòu)建自變量矩陣：

將多組試驗所得的G’和G”分別作為因變量yG’和yG”，構(gòu)建因變量矩陣：

綜合上述分析，構(gòu)建pH值、溫度、質(zhì)量濃度與模量（G’和G”）的數(shù)學(xué)模型：

式中：G為存儲模量G’或損耗模量G”；P為RSC溶液的pH值；C為RSC溶液的質(zhì)量濃度；T為RSC溶液的溫度；k為系數(shù)。由上述模型可知，該數(shù)學(xué)模型為多元非線性數(shù)學(xué)模型，經(jīng)線性化得：

2.6.2 多元線性回歸分析

2.6.2.1G’回歸分析

表2 G’方差分析 Table 2 Analysis of variance of G’ model

表3 G’回歸分析Table 3 Regression analysis of G’ model

表4 G’參數(shù)估計 Table 4 Parameter estimates of G’ model

由表2可知，其F值為207.23，P值小于0.000 1，認(rèn)為y1與x1、x2、x3之間具有顯著的線性相關(guān)關(guān)系；由表3可知，R2值為0.945 3，說明該方程具有很高的擬合度。由表4可知，對于常數(shù)檢驗，t＝-10.20，P值小于0.000 1，說明截距項通過檢驗，估計值為-13.64；對于自變量x1、x2、x3，P值均小于0.000 1，說明所有自變量的系數(shù)均通過檢驗，表明該模型具有正確性，自變量系數(shù)分別為6.76、4.27 、-2.24。

綜合以上分析，可以得到線性回歸方程：

將上述線性回歸方程非線性化可得：

2.6.2.2G”回歸分析

表5 G”方差分析 Table 5 Analysis of variance of G” model

表6 G”回歸分析Table 6 Regression analysis of G” model

表7 G”參數(shù)估計Table 7 Parameter estimates of G” model

由表5可知，其F值為165.53，P值小于0.000 1，說明y2與x1、x2、x3之間具有顯著的線性相關(guān)關(guān)系；由表6可知，R2為0.932 4，說明該方程的擬合度很高；由表7可知，對常數(shù)檢驗，t＝-8.95，P值小于0.000 1，說明截距項通過檢驗，截距值為-10.22；對于自變量x1、x2、x3，P值均小于0.000 1，說明所有自變量的系數(shù)均通過檢驗，表明該模型具有正確性，自變量系數(shù)分別為4.74、3.36 、-1.59。

綜合以上分析，可以得到線性回歸方程：

將上述線性方程非線性化可得：

2.6.3 凝膠臨界模型的建立

從式（7）和式（9）可知，凝膠的兩種模量與體系的pH值、質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，與溫度呈負(fù)相關(guān)，與單因素試驗所得結(jié)論一致，且當(dāng)G’=G”，即G’-G”=0時，膠原蛋白處于凝膠臨界狀態(tài)，聯(lián)立可得膠原蛋白的臨界凝膠條件方程：

式中：P為RSC溶液的pH值；C為RSC溶液的質(zhì)量濃度；T為RSC溶液的溫度。當(dāng)處于非凝膠態(tài)，時，RSC溶液時，溶液處于凝膠態(tài)。根據(jù)臨界方程用Matlab軟件作出的三維曲面如圖7所示，該曲面可直觀表示RSC溶液的pH值、質(zhì)量濃度與溫度對凝膠形成的影響，曲面上所有的點都是凝膠的臨界點，曲面的內(nèi)側(cè)為凝膠態(tài)，外側(cè)為非凝膠態(tài)。

圖7 凝膠臨界曲面Fig. 7 Critical surface of RSC gelation

3 結(jié) 論

采用酸法從肉兔皮中提取并得到了膠原蛋白，提取率達到69.18%。通過紫外光譜圖發(fā)現(xiàn)RSC的最大吸收波長為237 nm，屬于I型膠原蛋白，紅外光譜圖表明膠原蛋白保持了原有的三螺旋結(jié)構(gòu)，同時測得其變性溫 度為35.8 ℃。

通過流變學(xué)對RSC凝膠條件進行研究后發(fā)現(xiàn)，RSC溶液pH值和質(zhì)量濃度與RSC-gel形成呈正相關(guān)，而溶液溫度與RSC-gel形成呈負(fù)相關(guān)。

通過構(gòu)建數(shù)學(xué)模型分析pH值、溫度、質(zhì)量濃度對與RSC溶液形成凝膠的綜合影響，得到RSC溶液G’和數(shù)學(xué)關(guān)系，其凝膠臨界條件為。上述數(shù)學(xué)關(guān)系對于其他來源的膠原蛋白同樣適用，上述數(shù)學(xué)模型也可為其他材料凝膠的成形提供理論基礎(chǔ)。