鄭穎，龐思奇，馬嘉擎，任瑤瑤

峨眉山地區(qū)天南星科藥用植物ITS2序列及二級結構分析

鄭穎，龐思奇，馬嘉擎，任瑤瑤

西南交通大學生命科學與工程學院，四川 成都 610031

利用第二內(nèi)部轉錄間隔區(qū)（ITS2）序列作為DNA條形碼及其二級結構，對峨眉山地區(qū)天南星科藥用植物進行鑒定及聚類分析。于四川峨眉山地區(qū)采集20個不同種天南星科藥用植物樣本，提取基因組DNA，對ITS2序列進行PCR擴增測序，從GenBank下載26條天南星科植物ITS2序列；利用MEGA7.0計算分析所有序列種內(nèi)遺傳距離及種間遺傳距離，并采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)進化樹；根據(jù)ITS2數(shù)據(jù)庫信息預測并比較所有不同種樣本的ITS2序列二級結構差異。樣本種間K2P最小遺傳距離（0.049）大于種內(nèi)最大距離（0.021），有明顯的條碼間隔；NJ樹顯示各屬樣本各聚為一大支，各屬內(nèi)各種樣本又各聚為小枝；各屬及各種樣本ITS2二級結構均存在顯著差異。將ITS2序列作為DNA條形碼及其二級結構，可快速準確鑒定天南星科藥用植物。

天南星科；DNA條形碼；ITS2序列；二級結構；鑒定；資源調(diào)查

峨眉山地處四川盆地西南邊緣，面積154 km2，最高峰海拔3099 m，區(qū)域內(nèi)相對高差近2600 m，氣候垂直變化顯著，使植物生長具備了優(yōu)良的小環(huán)境，由山頂至山腳均分布著豐富多樣的藥用植物[1-2]。峨眉山境內(nèi)有天南星科植物37種，大部分種類均在不同方面藥用，有7種被《中華人民共和國藥典》收載，屬于藥用資源十分豐富的類群[3]。天南星屬藥用植物具有燥濕化痰、消腫解毒、祛風止痙等作用[4-6]；菖蒲屬藥用植物具有開竅化痰、鎮(zhèn)靜催眠等作用[7-9]；半夏屬藥用植物具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結等作用，可治療痰多咳喘、痰飲眩悸[4，10-11]；魔芋屬藥用植物具有抗腫瘤、解毒消腫、降血脂、降血糖等作用[12-14]；海芋屬藥用植物具有清熱解毒、消腫鎮(zhèn)痛作用，可治療風濕骨痛、癰疽腫毒大瘡等[15-16]。峨眉山天南星科藥用植物資源豐富，藥用歷史悠久，大部分兼具藥用、食用、觀賞價值，其中常見的有一把傘南星、半夏、石菖蒲、魔芋、虎掌、海芋等。

DNA條形碼技術是藥用植物資源物種鑒定研究的重要方法[17]。自陳士林[18]首次提出鑒定藥用植物的標準DNA條形碼為第二內(nèi)部轉錄間隔區(qū)（ITS2）序列以來，核糖體DNA ITS2序列受到廣泛關注，同時被多次用于多種藥材和藥用植物的鑒定，并表現(xiàn)出較強的鑒定能力[19]。本課題組已建立豐富的藥用植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，包括冬蟲夏草、川貝母及多種藏藥材等，均驗證了DNA條形碼技術的可行性。峨眉山地區(qū)的獨特地形、氣候適合天南星科植物的生長，擁有豐富的天南星科藥用植物資源，為進一步擴增DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，本課題組進一步探索峨眉山地區(qū)天南星科藥用植物DNA條形碼，驗證DNA條形碼技術在天南星科藥用植物資源物種鑒定研究中的可行性。

本研究在峨眉山多個地區(qū)采集天南星科植物樣本，進行DNA提取、PCR擴增及測序后，于GenBank下載同屬和同科植物ITS2序列，并以ITS2序列為DNA條形碼，對所有ITS2序列進行種間和種內(nèi)遺傳距離分析、構建系統(tǒng)進化樹、二級結構預測及分析比較，鑒定天南星科藥用植物。以期為天南星科藥用植物研究奠定基礎，同時為天南星科植物藥材市場的可持續(xù)發(fā)展提供鑒別依據(jù)，并有助于進一步分析調(diào)查峨眉山藥用植物資源的種群量、分布環(huán)境、種群動態(tài)等信息。

1 儀器與試藥

T100 PCR擴增儀（美國Bio-Rad）；植物基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化有限公司，批號DP305-02）；引物[成都擎科梓熙生物技術有限公司（TSINGKE）合成]，100 μmol/L，正向ITS2F，反向ITS2R；移液器。

20份天南星科植物樣本于四川省峨眉山市龍池鎮(zhèn)、張壩村、黃灣鄉(xiāng)等地收集，經(jīng)西南交通大學生命科學與工程學院宋良科副教授根據(jù)其形態(tài)特征進行鑒定，共11種植物（見表1），標本保存于西南交通大學標本室。同時通過GenBank數(shù)據(jù)庫下載天南星科植物ITS2序列26條（見表2），使用BLAST方法在GenBank數(shù)據(jù)參考庫中對這些序列進行核對，相似度均大于99%，且已有研究者發(fā)表過包含這些序列的相關文章，可保證其準確性。

表1 20份天南星科植物樣本信息

植物名稱拉丁名序列長度/bpGC含量/%產(chǎn)地GenBank登錄號 一把傘南星Arisaema erubescens251.065.0四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)KT634023 花南星A. lobatum241.068.5四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)MN038130 花南星A. lobatum241.067.2四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)MN038131 異葉天南星A. heterophyllum244.062.3四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)MK161405 半夏Pinellia ternata251.073.7四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)MN038132 半夏P. ternata251.074.1四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)KU551864 半夏P. ternata251.073.7四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)MN038133 半夏P. ternata251.073.7四川省峨眉山市張壩村MN038134 虎掌P. pedatisecta252.073.8四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)MK524259 石菖蒲Acorus tatarinowii251.074.5四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)MK524255 石菖蒲A. tatarinowii251.074.5四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)MK524257 石菖蒲A. tatarinowii251.074.5四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)MK524258 石菖蒲A. tatarinowii252.074.6四川省峨眉山市龍池鎮(zhèn)MN038135 石菖蒲A. tatarinowii252.074.6四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)MN038136 菖蒲A. calamus258.072.9四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)MN038137 魔芋Amorphophallus konjac285.077.9四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)MK524261 海芋Alocasia odora267.073.8四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)MK524260 芋Colocasia esculenta251.072.6四川省峨眉山市黃灣鄉(xiāng)MK808042 芋C. esculenta251.072.6四川省峨眉山市張壩村MN038138 犁頭尖Typhonium divaricatum231.077.5四川省峨眉山市龍池鎮(zhèn)MN038140

表2 GenBank下載天南星科植物ITS2序列

名稱拉丁名GenBank登錄號 一把傘南星Arisaema erubescensMF589411、MF589412、MF589413 異葉天南星A. heterophyllumMF095999、MF096001、MF096003 花苞南星A. flavumMH258127、MH258128、MH258129 半夏Pinellia ternataMF589450、KM236639、KX675050 虎掌P. pedatisectaMF589444、MF589445、MF589446 菖蒲Acorus calamusFJ497034、FJ497036、FJ497037 魔芋Amorphophallus konjacKR534423、KR534424 海芋Alocasia odoraAF469030、KF863707 芋Colocasia esculentaMK028830 犁頭尖Typhonium divaricatumMK771851 鞭檐犁頭尖T. flagelliformeKM236658、KM236659

2 方法

2.1 樣品DNA提取、PCR擴增及測序

參照陳士林[20]對植物樣品DNA提取、測序等方法，對所采集的天南星科植物樣本進行DNA提取、ITS2片段PCR擴增及二代雙向測序，測序公司為成都擎科梓熙生物技術有限公司。

2.2 數(shù)據(jù)處理

使用CodonCode Aligner軟件獲得每個序列的峰圖，分析測序結果，去除兩端序列，并使用BLAST方法在GenBank數(shù)據(jù)參考庫中對這些ITS2序列進行核對；測序得到的序列使用基于隱馬爾可夫模型的HMM注釋方法，去除拼接得到的一致序列的兩端28S和5.8S區(qū)段，得到標準ITS2序列[21]，并使用BLAST方法在參考庫中對這些ITS2序列進行測試。結合從NCBI下載的ITS2序列，使用MEGA7.0軟件計算遺傳距離，并在K2P模型的基礎上分析種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)進化樹[22]，各分支的支持率利用靴帶法（bootstrap，1000次重復）進行檢驗。各種屬植物樣本ITS2序列的二級結構參照Koetschan等[23]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站進行預測并比較。

3 結果

3.1 種內(nèi)、種間K2P遺傳距離分析

一把傘南星、半夏、芋的ITS2序列長度均為251 bp，其他樣本的ITS2序列長度均不同。所有樣本ITS2序列長度為231～285 bp，GC含量為62.3%～77.9%，平均GC含量為71.1%（見表1）。

研究發(fā)現(xiàn)，種間距離越大、種內(nèi)距離越小的物種間更適于條形碼鑒定[24]。本研究在K2P距離模型的基礎上，使用MEGA7.0軟件計算樣本種間及種內(nèi)遺傳距離，結果顯示所有天南星科植物樣本種內(nèi)最大遺傳距離為0.021，種內(nèi)遺傳距離平均值為0.000～0.014，種間最小遺傳距離為0.049，見表3。其中，一把傘南星和花南星遺傳距離最近，虎掌和石菖蒲遺傳距離最遠。各物種種間遺傳距離均明顯大于種內(nèi)遺傳距離，可見ITS2序列具有較好的種間特征，可作為鑒別天南星科植物的DNA條形碼。

表3 天南星科植物種內(nèi)、種間遺傳距離平均值

樣本A1A2A3A4P1P2A5A6A7A8C1T1T2 A10.0070.0500.0800.0600.1700.1500.5500.5600.2300.1500.1600.3900.180 A20.0490.0000.1000.0800.1700.1700.5900.6000.2300.1600.1600.3700.180 A30.0810.1010.0080.1300.2100.2100.6200.6500.2800.2100.2100.4400.220 A40.0590.0810.1270.0040.1400.1300.6200.6200.2400.1400.1600.3800.180 P10.1680.1680.2150.1420.0030.0700.6600.6600.2000.1200.1300.3800.180 P20.1520.1660.2090.1320.0650.0000.7000.6900.2200.1000.1000.4000.200 A50.5500.5870.6220.6190.6620.6980.0000.1000.7200.6500.6100.7000.570 A60.5640.6020.6480.6230.6620.6870.1030.0110.7300.6400.6100.7500.610 A70.2290.2260.2750.2390.2040.2220.7240.7330.0000.1800.2500.4000.200 A80.1520.1550.2070.1430.1160.1030.6500.6370.1830.0140.1100.3500.180 C10.1570.1640.2120.1560.1270.0960.6140.6090.2540.1070.0070.3800.220 T10.3860.3740.4390.3800.3750.3980.6960.7500.4010.3530.3760.0000.260 T20.1830.1830.2210.1820.1810.1960.5740.6090.2000.1780.2220.2580.000

注：A1、A2、A3、A4、P1、P2、A5、A6、A7、A8、C1、T1、T2依次為、、、、、、、、、、、、

天南星科植物樣本遺傳距離熱圖見圖1。可以看出，樣品種內(nèi)、屬內(nèi)K2P遺傳距離較小，為圖中顏色最淺的區(qū)域；各屬之間遺傳距離較大，為圖中顏色較深區(qū)域；熱圖中顏色最深的區(qū)域為菖蒲屬與其他屬樣本種間遺傳距離，其值最大。統(tǒng)計分析各樣本種間和種內(nèi)遺傳距離變異分布（見圖2）發(fā)現(xiàn)，種間變異距離主要集中在0.100～1.000，種內(nèi)變異距離集中在0.000～0.025，各樣本間存在較明顯的條碼間隔，因此ITS2序列在種水平上對天南星科樣本鑒定能力較強。

注：A1、A2、A3、A4、P1、P2、A5、A6、A7、A8、C1、T1、T2依次為Arisaema erubescens、A. lobatum、A. heterophyllum、A. flavum、Pinellia ternata、P. pedatisecta、Acorus tatarinowii、A. calamus、Amorphophallus konjac、Alocasia odora、Colocasia esculenta、Typhonium divaricatum、T. flagelliforme

圖2 天南星科藥用植物樣本ITS2序列種間和種內(nèi)遺傳距離變異分布

3.2 聚類樹分析

所有ITS2序列樣本NJ系統(tǒng)進化樹見圖3。通過系統(tǒng)發(fā)育關系分析天南星科各屬之間親緣關系的遠近：天南星屬、半夏屬、芋屬、海芋屬、魔芋屬聚為一大支，表明其親緣關系較近；菖蒲屬、犁頭尖屬分別聚成一個進化支，與其他物種有效區(qū)分，表明它們與其他屬之間的親緣關系較遠；靴帶法1000次檢驗各分支支持率均在62%以上，同時各屬內(nèi)各物種的ITS2序列均獨立聚為一小支，各支支持率均在50%以上，展現(xiàn)出較好的單系性，系統(tǒng)進化樹體現(xiàn)了不同屬之間的進化關系。NJ系統(tǒng)進化樹表明，ITS2序列可以識別不同種類的天南星科植物并將它們有效分開，鑒定成功率為100%。

圖3 基于ITS序列構建的天南星科植物樣本NJ系統(tǒng)進化樹

3.3 ITS2序列二級結構分析

根據(jù)Koetschan等[25]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)站預測天南星科植物的ITS2二級結構，所有樣本ITS2序列的二級結構見圖4。結果表明，所有物種的二級結構均由一個中心環(huán)及4個螺旋區(qū)（Helix）組成，但各物種在4個螺旋區(qū)的莖環(huán)（Loop）數(shù)量、長度、形狀、位置、大小方面均存在明顯差異。如、、、的中心環(huán)均為圓形但大小不同，且4個螺旋區(qū)的莖環(huán)數(shù)目均不相同，可明顯區(qū)分開，其他物種的中心環(huán)均為異形，但中心環(huán)的形狀及螺旋區(qū)均有所不同。因此，通過ITS2二級結構可以較直觀地鑒別天南星科植物。

圖4 天南星科ITS2序列的二級結構

4 討論

DNA條形碼鑒定技術不受環(huán)境、樣品、試劑、部位、形態(tài)等的限制，彌補了傳統(tǒng)鑒別方法的不足，成為鑒別中藥基原植物和藥材品種的有效手段，為藥材基原物種的鑒定提供了有力的科技支撐，應用日益廣泛[26]。研究表明，ITS2序列區(qū)域具有較高的變異性、相對穩(wěn)定的遺傳距離和較高的識別效率[27]，同時，其對植物具有良好的物種水平鑒定成功率和擴增成功率[28]。

已有的天南星科植物ITS2序列研究主要包括：利用rbeL、matK序列結合ITS2和psbA-trnH序列考察天南星科植物的PCR擴增效率以及種、屬水平的鑒定成功率[29]；利用ITS2序列對天南星科菖蒲屬植物進行生藥學鑒定并篩選其最佳適應DNA條形碼序列，建立分子鑒定石菖蒲的PCR方法，探討菖蒲屬基原問題[30]等。本研究主要利用ITS2序列作為DNA條形碼及其二級結構對峨眉山地區(qū)20種天南星科藥用植物進行鑒定及聚類分析，為天南星科DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的建立奠定基礎。本研究以傳統(tǒng)調(diào)查方法為基礎，將現(xiàn)代實驗方法、計算機技術與中藥材資源鑒定相結合，在準確鑒定天南星科藥用植物的同時，能夠為峨眉山地區(qū)該屬藥用植物的分布、種群及種群量研究提供指導，有利于掌握其分布特點、生態(tài)環(huán)境，在正確評價天南星科藥用資源狀況的基礎上，構建中藥資源長效保護機制，對其質(zhì)量控制、安全用藥及資源保護和合理開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

本研究將采自峨眉山不同地區(qū)的20份天南星科植物樣本PCR擴增、測序，采用隱馬爾可夫模型的注釋方法獲得ITS2序列，并從GenBank上下載同科序列26條。用MEGA7.0軟件分析種內(nèi)、種間遺傳距離并構建NJ系統(tǒng)進化樹，對其樣本間的條碼間隔進行考察。天南星科植物樣本種間和種內(nèi)遺傳距離分析顯示，種內(nèi)和種間變異分布有明顯的條碼間隔，其在熱圖上顏色較深，屬內(nèi)顏色次之，種內(nèi)顏色較淺。NJ系統(tǒng)進化樹表明，天南星科不同屬之間聚為幾個不同大支，親緣關系較遠，同屬之間親緣關系較近，屬內(nèi)不同種之間各聚為一小支。結合所有樣本ITS2序列種間及種內(nèi)遺傳距離值、條碼間隔分析、系統(tǒng)進化樹構建以及二級結構預測、比較等多種方法對ITS2序列的天南星科植物鑒定能力從不同方面進行了考察，結果表明，以ITS2序列作為DNA條形碼，在種水平上能夠很好地鑒定天南星科藥用植物樣本。因此，將ITS2序列作為DNA條形碼對天南星科植物進行鑒定具有準確、便捷的優(yōu)勢。

峨眉山素有“仙山藥園”的美譽，藥用、觀賞、食用等方面的資源植物豐富多樣[31]。利用DNA條形碼技術，可彌補傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法的不足，能夠快速、準確地鑒定某些藥用植物，有助于對峨眉山地區(qū)的藥用植物資源進行大范圍分析、調(diào)查。在不影響植物種類發(fā)展的前提下，進行合理的開發(fā)利用，更有利于藥用植物資源保護[32]。藥用植物種類多、分析數(shù)據(jù)量大，為使保護決策更科學，必須充分利用有關數(shù)據(jù)并建立有效的計算機信息管理系統(tǒng)[33]，結合植物種群分布特征與生態(tài)環(huán)境，正確全面評價藥用植物資源當前狀況，在此基礎上制定切實可行的保護及合理開發(fā)利用方案。

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Analysis on ITS2 Sequences and Secondary Structures of Medicinal Plants ofAraceae in Mount Emei

ZHENG Ying, PANG Siqi, MA Jiaqing, REN Yaoyao

To identify and conduct cluster analysis of medicinal plants of Araceae from Mount Emei using ITS2 sequences and their secondary structures.The total genomic DNAs were extracted from 20 samples of medicinal plants of Araceae from Mount Emei. The ITS2 sequences of these samples were amplified and bidirectional sequenced by PCR. Totally 26 ITS2 sequences were downloaded from the GenBank. Intra-species genetic distance and inter-species genetic distance of all sequences were analyzed using MEGA 7.0, and the neighbor-joining (NJ) method was adopted to build a phylogenetic tree. According to the information of ITS2 database, the secondary structure differences of ITS2 sequences of all different samples were predicted and compared.The minimum distance between species (0.049) was greater than the maximum distance within each species (0.021) with obvious barcoding gap; the NJ tree showed that the samples were clustered into different branches, and further clustering into sub-branches. Significant differences were also noticed in the secondary structures of ITS2 among different samples.Using ITS2 sequences as DNA barcode and their secondary structures can conduct accurate and rapid identification of medical plants of Araceae.

Araceae; DNA barcode; ITS2 sequences; secondary structures; identification; resource investigation

R282.5

A

1005-5304(2020)12-0064-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202004471

四川省科技計劃項目（2018SZ0061）；四川省中醫(yī)藥科學技術研究專項（2016Z013）

任瑤瑤，E-mail：yyren82@163.com

（2020-04-20）

（2020-05-09；編輯：陳靜）