盧金 何文迪 馬少華 吳迪

(寧波衛(wèi)生職業(yè)技術學院，浙江 寧波 315100)

烏靈參屬子囊菌綱、炭角菌科的黑柄炭角菌，別名烏苓參、雞(土從)蛋，又名雷震子，主要產(chǎn)于江蘇、浙江、四川、云南、廣東、江西等地，生長在地下深處黑翅土棲白蟻廢棄的蟻巢上，是傳統(tǒng)的藥用真菌、食用菌，具有特殊的生物學特性、豐富的生理活性成分和廣泛的藥理作用，被世界藥用真菌研究、應用領域均視為珍稀、名貴藥材[1]。烏靈菌粉的鎮(zhèn)靜安神、抗失眠、抗抑郁、抗焦慮效果，在臨床上己經(jīng)得到證實，顯示中醫(yī)藥在這方面的獨特優(yōu)勢[2,3]。浙江佐力藥業(yè)以烏靈菌粉制造的烏靈膠囊被國家確定為“一類新藥”、“中藥保護品種”進入國家醫(yī)保目錄，是用于治療焦慮、抑郁和失眠等病癥的唯一單方型中藥制劑。

盡管烏靈參療效得到了認可，但因其生長環(huán)境奇特，自然資源采掘非常困難，使得野外采集的烏靈參樣品量有限，小分子化合物的分離純化報道較少，所以對其研究及推廣非常緩慢。目前，國內(nèi)已有烏靈發(fā)酵菌絲生產(chǎn)的報道，烏靈參的應用才成為可能，從高等真菌中尋找新的藥物以及生理活性物質(zhì)是目前國內(nèi)外藥物研究的熱點，作為一個具有廣闊開發(fā)潛力的藥用真菌，目前在產(chǎn)品開發(fā)上也僅以其發(fā)酵粉面世，所以烏靈參應用開發(fā)才剛剛開始。

1 烏靈參微觀結(jié)構(gòu)

圖1是新鮮烏靈參切片后用蘇木素伊紅聯(lián)合染色后，在光學顯微鏡下觀察到的圖片(放大1000倍)。從圖1可以看出，新鮮烏靈參內(nèi)部由絲狀菌絲纏結(jié)組成，細胞壁較薄,細胞排列疏散且相互纏繞,菌絲細胞之間有大量的空隙，這應該是便于貯存空氣和水分。

圖1 新鮮烏靈參切片放大圖(放大1000倍)

圖2是用掃描電鏡觀察烏靈菌粉，可以看到其表面為復雜的無規(guī)則斷面結(jié)構(gòu)，符合植物及真菌類粉碎后的特征。從圖2中可以看到菌粉表面有很多孔洞，這些孔洞的直徑小于1μm。這種結(jié)構(gòu)與圖1在顯微鏡下觀察到的大量絲狀結(jié)構(gòu)相一致。

圖2 烏靈菌粉表面掃描電鏡圖片

2 烏靈參提取物體制備

新鮮烏靈參子實體在45℃條件下烘干后破碎成粉末狀，然后用過80目篩子，利用超聲波細胞破碎儀對烏靈菌粉的醇分散懸濁液超聲破碎30min后，按照1∶10的料液比添加適量的80%丙酮，室溫下浸提12h，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將浸提液濃縮成浸膏，即烏靈參丙酮提取物。

3 紅外吸收光譜、液相色譜初步分析烏靈參提取物的主要官能團

用索氏抽提器分別使用水和丙酮為介質(zhì)對本研究團隊初步培養(yǎng)的烏靈參進行有效成分提取。用紅光光譜對烏靈菌粉做了定性檢測、用液相—質(zhì)譜聯(lián)用儀對提取的有效成分進行分析，實驗數(shù)據(jù)見圖3至圖5。圖3是提取前的烏靈菌粉紅外光吸收譜，圖4是提取后的烏靈菌粉紅外光吸收譜，圖5是烏靈參提取液的液相色譜峰。由于烏靈參的成分比較復雜，用現(xiàn)有的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果與其它儀器的分析結(jié)果有偏差，所以現(xiàn)在以物質(zhì)結(jié)構(gòu)計算理論分析為主。目前，質(zhì)譜測定的結(jié)果如下：最低質(zhì)量是30D；最高質(zhì)量是550D；第1個基團的第1個和第2個原子團的質(zhì)量都是149D，這個基團中的質(zhì)量分布為149D、167D、279D，保留時間均是30min；第2個基團的第1個原子團的質(zhì)量是91D，第2個原子團的質(zhì)量都是150D，這個基團中的質(zhì)量分布為91D、149D、150D、206D，保留時間均是30min；第3個基團的第1個原子團的質(zhì)量是149D，第2個原子團的質(zhì)量都是150D，這個基團中的質(zhì)量分布為149D、150D、167D、279D，保留時間均是30min；第4個基團的第1個原子團的質(zhì)量是149D，第2個原子團的質(zhì)量都是167D，這個基團中的質(zhì)量分布為149D、150D、167D、279D、263D、293D、307D，保留時間均是30min。

圖3 提取前的烏靈參粉紅外光吸收譜

圖4 提取后的烏靈菌粉紅外光吸收譜

圖5 烏靈參提取液的液相色譜峰

4 烏靈參提取物有效成效分析

利用超聲波細胞破碎儀對烏靈菌粉的醇分散懸濁液超聲破碎30min后，用丙酮熱抽提，然后用氣相—質(zhì)譜聯(lián)用儀分析烏靈參提取液中的有效成分。從離子出峰時間來看，烏靈參提取液含量較多的有4種成分。出峰時間約是：9.5min、10.9min、12.1min、15.0min之間。圖7至圖9是相關成分經(jīng)過和數(shù)據(jù)庫比對得到的分析圖譜。分析結(jié)果表明，提取物的成分比較復雜，一些單體擁有獨特的2-甲?；量┏砗蠁徇h(huán)的三環(huán)骨架，均為螺環(huán)吡咯生物堿，這些化合物在天然產(chǎn)物中非常稀少。其它小分子單體有：5-羥基-7-甲氧基-2-甲基-4-二氫色原酮(1)、5,7-二羥基-2-甲基-4-二氫色原酮(2)、5-羥基-2-甲基-4-二氫色原酮(3)、1-(2,6-二羥基苯)-3-羥基-丁酮(4)、5α,8α-過氧化麥角甾-6,22-二烯-3β-醇(5)、麥角甾-7,22-二烯-3β-5α,6β-三醇(6)、大戟醇(7)、β-谷甾醇(8)、2-(4-羥基苯)-乙醇(9)、8-二羥基-3-甲基-3，4-二氫異香豆素等。另外，不能被提取的物質(zhì)主要是多糖、腺苷、氨基酸、微量元素及蛋白質(zhì)等。

圖6 (A～J)烏靈參提取液各官能團質(zhì)譜圖

圖7 提取液中主要的離子分布出峰時間

圖8 14.007min離子峰對應的結(jié)構(gòu)式

圖9 16.531min離子峰對應的結(jié)構(gòu)式

烏靈參主要成分為腺苷、氨基酸、多糖、微量元素及蛋白等[4,5]。特別是氨基酸的種類異常豐富，構(gòu)成人體蛋白質(zhì)主要的20種a-氨基酸，烏靈參就有17種；人體本身無法自身合成8種必需氨基酸，烏靈參就有7種，并含有大量的谷氨酸和較多的賴氨酸[1,6]。1993年，有學者從烏靈參中分離獲得羧酸酯水解酶FE-Ⅰ、FE-Ⅱ、FE-Ⅲ和FE-Ⅳ。其中，F(xiàn)E-Ⅰ和FE-Ⅱ相對分子量約為78.5kDa，F(xiàn)E-Ⅲ和FE-Ⅳ約為78.5kDa，4種酶為同源二聚體，其亞基通過非共價鍵相連，酯酶活性較高[8]。

對于烏靈參所含的小分子單體成分研究，2001年，吳根福等從其深層發(fā)酵制品中獲得能捕捉DPPH自由基活性成分,推斷為5,8-二羥基-3-甲基-3,4-二氫異香豆素[9]。2008年，首次分離出5-羥基-7-甲氧基-2-甲基-4-二氫色原酮、5,7-二羥基-2-甲基-4-二氫色原酮、5-羥基-2-甲基-4-二氫色原酮、大戟醇、1-(2,6-二羥基苯)-3-羥基-丁酮、β-谷甾醇、5α,8α-過氧化麥角甾-6,22-二烯-3β-醇、麥角甾-7,22-二烯-3-β-5α,6β-三醇、2-(4-羥基苯)-乙醇等9個單體成分，其中化合物5-羥基-7-甲氧基-2-甲基-4-二氫色原酮、5,7-二羥基-2-甲基-4-二氫色原酮為首次分離到的天然產(chǎn)物[22]。2015年，分離出2個新的化學單體xylapyrrosides A和B及2個已知化合物pollenopyrrosides A和B，均為螺環(huán)吡咯生物堿，2-甲酰基吡咯稠合嗎啉環(huán)的三環(huán)骨架是其獨特結(jié)構(gòu)，在天然產(chǎn)物中極為少見[10]。此外，有研究報道顯示烏靈參還含有8-二羥基-3-甲基-3,4-二氫異香豆素成分[11]。