張玲玲，曹輝，白班俊，鐘竹，楊菁，許鐘

貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 貴州省人民醫(yī)院，貴陽550002

原發(fā)性肝癌是最常見惡性腫瘤之一，由于肝細(xì)胞癌(HCC)占其中90%以上，因此肝癌也常用來表示HCC。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶[1]，在細(xì)胞分裂分化、凋亡、自噬、遷移、蛋白質(zhì)翻譯和修飾以及細(xì)胞骨架重建等生物學(xué)過程中發(fā)揮作用，具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的功能。mTOR以mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTORC2)的催化亞基形式存在，而mTORC2及其異常調(diào)節(jié)信號通路與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。Xu等[2，3]研究表明，mTORC2在肝癌發(fā)生中具有關(guān)鍵作用。絲裂原活化蛋白激酶相關(guān)蛋白1(MAPKAP1)又稱mSin1，是多蛋白復(fù)合物mTORC2的主要蛋白之一[4]。因此，針對MAPKAP1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究，將有助于充分認(rèn)識肝癌的發(fā)生機(jī)制。2019年3～8月，我們應(yīng)用生物信息學(xué)方法對MAPKAP1基因啟動子區(qū)進(jìn)行序列分析，預(yù)測該基因近端啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，進(jìn)一步分析其在肝癌中上調(diào)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，為研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制、探索肝癌治療新思路提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 人MAPKAP1基因啟動子區(qū)序列的獲得 在美國國家生物技術(shù)信息中心在線核苷酸數(shù)據(jù)庫(Gene Bank)中獲得MAPKAP1基因序列，并基于MAPKAP1的基因序列ID，下載NCBI網(wǎng)站上外鏈接GeneCopoeia Inc.所提供的啟動子序列。

1.2 人MAPKAP1基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預(yù)測分析 在轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫TRANSFAC中，通過在線轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件Patch、P-Match、AliBaba2(http://www.gene-regulation.com/pub/programs.html)預(yù)測MAPKAP1啟動子序列順式作用元件，分析其可能轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。應(yīng)用Patch在線軟件分析，參數(shù)設(shè)置set of sites選擇“vertebrates”，Lower score boundary設(shè)為“90”，其他采用默認(rèn)設(shè)置；應(yīng)用P-Match在線軟件分析，限定“l(fā)iver_specific”，Cut-offs使用參數(shù)分別為“to minimize the sum of both error rates”“to minimize false negative matches”；應(yīng)用AliBaba2在線軟件分析，取在線軟件默認(rèn)設(shè)置參數(shù)。

1.3 肝癌組織中人MAPKAP1基因啟動子區(qū)可能轉(zhuǎn)錄因子的篩選 應(yīng)用在線肝臟基因數(shù)據(jù)庫Liveratlas(http://liveratlas.hupo.org.cn/)[5]檢索，選擇“Disease”，以 “hepatocellular carcinoma”為檢索詞檢索，依次點擊“HuLDi00052”和“more...”，篩查肝癌組織中表達(dá)上調(diào)的基因；與預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行對比，獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)集。

1.4 肝癌組織中人MAPKAP1與啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)性分析 通過TCGA數(shù)據(jù)庫(https://cancergenome.nih.gov/)提取篩選出的轉(zhuǎn)錄因子與MAPKAP1的肝癌組織芯片表達(dá)結(jié)果，采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件行Pearson相關(guān)性分析，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人MAPKAP1基因基本信息及啟動子序列 人MAPKAP1基因ID為79109，定位于9號染色體負(fù)鏈(9q33.3)；其mRNA ID包括NM_001006617.2、NM_001006618.1、NM_001006619.1、NM_001006620.1、NM_001006621.1、NM_024117.3，在肝臟及肝癌中主要為NM_001006621.1、其次為NM_001006619.1、NM_001006620.1等。該基因啟動子克隆產(chǎn)品ID為HPRM31628，全長1 689 bp，位于轉(zhuǎn)錄起始位點-1 470 bp至+218 bp。

2.2 人MAPKAP1基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測分析結(jié)果 Patch在線軟件分析，共預(yù)測1 181個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，手工篩查物種為人的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點共598個，匯總?cè)ブ睾蠊埠w149個轉(zhuǎn)錄因子。P-Match在線軟件分析，當(dāng)Cut-offs使用參數(shù)為“to minimize the sum of both error rates”時，預(yù)測到31個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，匯總?cè)ブ睾蠊埠w15個轉(zhuǎn)錄因子；當(dāng)使用參數(shù)為“to minimize false negative matches”，共預(yù)測到362個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，匯總?cè)ブ睾蠊埠w28個轉(zhuǎn)錄因子。AliBaba2在線軟件分析，共預(yù)測155個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，匯總?cè)ブ睾蠊埠w了63個轉(zhuǎn)錄因子。以上軟件預(yù)測結(jié)果匯總共255個，去重后共涵蓋214個轉(zhuǎn)錄因子。

2.3 肝癌組織中人MAPKAP1基因啟動子區(qū)可能轉(zhuǎn)錄因子篩選結(jié)果 應(yīng)用在線基因數(shù)據(jù)庫Liveratlas提取肝癌組織中表達(dá)上調(diào)的基因共2 171個，與上述預(yù)測的214個轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行對比，取交集獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子共有13個：C/EBP、CNBP、CTCF、DBP、IRF2、LEF1、NF1、NFKB1、PAX8、SMAD4、Sp3、SRF、YY1。

2.4 肝癌組織中人MAPKAP1與啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，轉(zhuǎn)錄因子C/EBP、DBP、LEF1與MAPKAP1表達(dá)呈正相關(guān)(r分別為0.151 3、0.235 6、0.155 3，P均﹤0.01)，CNBP、CTCF、IRF2、NF1、NFKB1、PAX8、SMAD4、Sp3、SRF、YY1與MAPKAP1表達(dá)無明顯相關(guān)(r分別為-0.036 9、0.000 2、-0.004 0、-0.079 2、-0.132 6、0.042 4、0.033 9、-0.064 3、0.072 3、0.028 5，P均﹥0.05)。

3 討論

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，流行病學(xué)資料顯示中國肝癌病例占全球50%以上[6，7]，其發(fā)生過程中涉及一系列信號通路的異?；罨痆8]。由于肝癌異質(zhì)性大，當(dāng)前的治療手段適應(yīng)范圍和療效有限；對其發(fā)病分子機(jī)制進(jìn)行深入探索、尋找新的治療突破靶點，仍是肝癌研究的一個重要方向。PI3K/AKT/mTOR信號通路由PI3K、AKT和mTOR 3個重要分子節(jié)點組成，在細(xì)胞的正常生理代謝、腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要而關(guān)鍵的作用[9～12]。其中，AKT/mTOR通路的活化是肝癌發(fā)生最常見的分子事件之一。因此，mTOR抑制劑可以通過特異性抑制mTOR復(fù)合物及其信號通路中的各種信號分子而發(fā)揮抗腫瘤作用。研究mTORC2的結(jié)構(gòu)、功能、參與的信號通路及機(jī)制，可能為探索腫瘤的發(fā)生機(jī)制及其相關(guān)特異性靶向抑制劑治療腫瘤的研究提供新方向。

mTORC1和mTORC2是mTOR的兩種多蛋白復(fù)合體。mTORC1主要結(jié)構(gòu)由mTOR催化亞單位、mLST8、調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白raptor、負(fù)向調(diào)節(jié)因子DEPTOR和 PRAS40組成，主要功能為調(diào)控蛋白質(zhì)合成、調(diào)控細(xì)胞生長與增殖，能被雷帕霉素抑制[13，14]。mTORC2在肌動蛋白細(xì)胞骨架組織和細(xì)胞存活等方面發(fā)揮重要作用，由結(jié)構(gòu)蛋白mTOR、mLST8、MAPKAP1、Rictor、Deptor、Protor、Hsp70構(gòu)成，這些不同的結(jié)構(gòu)蛋白參與不同的生命活動調(diào)節(jié)過程[15，16]。mTORC2與細(xì)胞信號傳導(dǎo)關(guān)系密切。多種細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的因素，如生長因子、營養(yǎng)素、能量、應(yīng)激等，會通過mTORC2調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長。Rictor及MAPKAP1是mTORC2構(gòu)成一個整體的必要條件。MAPKAP1作為mTORC2的主要蛋白之一，具有保持mTORC2結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的功能，可剪切成5個亞基，含有Ras結(jié)合區(qū)和血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源結(jié)構(gòu)域，能夠抑制Ras信號。MAPKAP1參與mTORC2將AKT Ser473磷酸化過程，其亞型可獨立組裝mTORC2[17～20]，也是mTORC2亞細(xì)胞定位到質(zhì)膜的必要條件。mTORC2通過mSin1亞基在細(xì)胞膜上的定位，使mTORC2靠近其底物AKT、SGK和PKC。因此，細(xì)胞膜定位是mTORC2-AKT調(diào)控的一個重要方面。MAPKAP1是mTORC2激酶活性的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子。盡管生長因子刺激和核糖體結(jié)合都是已知的mTORC2激活因子，mTORC2的上游調(diào)控仍然不是很清楚[21]。

本研究通過利用生物信息學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子中共有13個在肝癌中表達(dá)上調(diào)，其中C/EBP、DBP、LEF1與MAPKAP1的表達(dá)呈正相關(guān)。C/EBP α是CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族的一員，作為轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞分化、增殖、代謝以及免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等病理生理過程，在多種腫瘤中異常表達(dá)。Lu等[22]研究表明，C/EBP α在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)則患者臨床預(yù)后更差。有報道顯示，mTORC2/AKT可通過下游分子上調(diào)C/EBP α的表達(dá)[23]，但C/EBP α是否影響mTORC2復(fù)合蛋白，尤其是MAPKAP1尚有待進(jìn)一步研究。DBP屬于脯氨酸和酸性氨基酸豐富的堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族，在肝臟解毒和藥物代謝中起重要作用。持續(xù)的DBP上調(diào)，可通過激活ERK1/2和 MAPK等信號通路促進(jìn)癲癇等疾病的發(fā)生[24]。但是，DBP是否可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)MAPKAP1表達(dá)未見報道。LEF1是LEF/TCF家族的成員之一，作為Wnt信號通路中的調(diào)控分子，可與β-連環(huán)蛋白結(jié)合來激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Fang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，LEF1還可通過NOTCH信號通路增加肝癌的侵襲能力和耐藥性，與臨床患者預(yù)后不良相關(guān)。目前，尚無關(guān)于LEF-1和mTORC2信號通路(包括MAPKAP1)之間相互作用的報道。綜上預(yù)測及分析，在肝癌發(fā)生過程中，轉(zhuǎn)錄因子C/EBP、DBP、LEF1可能在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)MAPKAP1的表達(dá)。此結(jié)果可通過小鼠肝癌模型等體內(nèi)實驗進(jìn)一步驗證，其進(jìn)一步研究為充分闡釋mTORC2生物學(xué)功能提供生物信息學(xué)基礎(chǔ)；鑒于目前研究中提示的mTORC2與腫瘤的關(guān)系，這可能為探索肝癌的發(fā)生機(jī)制及研究其特異性靶向治療藥物提供新的思路。