丁方謎，劉振東

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，浙江 杭州 310002）

胰腺癌是當(dāng)前常見的消化道腫瘤，因其發(fā)病的隱匿性，多數(shù)病人確診時已是局部進(jìn)展期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而無法手術(shù)，且其化療敏感性差，治療效果不佳，總體5年生存率僅9%[1]。2015年我國國家癌癥中心報(bào)告顯示，21世紀(jì)前10年，我國胰腺癌發(fā)病率和病死率平均年增長百分比均超過1%。2015年，胰腺癌在我國腫瘤中發(fā)病率已列第9位，死亡率為第 6 位[2]。

叉頭盒蛋白 D1（forkhead box D1，F(xiàn)OXD1）是轉(zhuǎn)錄因子中的一員，參與一系列生物學(xué)行為[3]。在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)FOXD1存在異常表達(dá)現(xiàn)象，并參與調(diào)控肺癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。在非小細(xì)胞肺癌組織特別是轉(zhuǎn)移灶中，F(xiàn)OXD1呈高表達(dá)，是非小細(xì)胞肺癌病人總生存期及無病生存期的獨(dú)立預(yù)測因子，其通過波形蛋白促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移[6]。

筆者發(fā)現(xiàn)，相對于正常的胰腺組織，F(xiàn)OXD1在多數(shù)胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達(dá)水平明顯升高。這符合FOXD1在多數(shù)腫瘤組織內(nèi)高表達(dá)的特征。另外，分析了胰腺癌細(xì)胞株和正常胰腺細(xì)胞株FOXD1表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)相對正常人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞株（human pancreatic ductal epithelial cell，HPDE），胰腺癌細(xì)胞株 SW1990、PANC-1和 BXPC-3的 FOXD1表達(dá)水平明顯升高。在降低FOXD1表達(dá)后，胰腺癌細(xì)胞株的增殖和轉(zhuǎn)移能力均受到一定抑制。研究顯示，F(xiàn)OXD1通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）通路來促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果為胰腺癌發(fā)展中FOXD1調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及侵襲提供一條重要的機(jī)制。

材料與方法

一、組織標(biāo)本和細(xì)胞株

組織標(biāo)本包含15例術(shù)后病理檢查為胰腺導(dǎo)管腺癌的病人，彼此無血緣關(guān)系，術(shù)前未接受化、放療或中藥治療等針對癌癥的特殊干預(yù)，取術(shù)中胰腺癌組織及距腫瘤邊緣2 cm以上正常胰腺組織。

人胰腺癌細(xì)胞株 SW1990、PANC-1、BXPC-3、正常HPDE為浙江省中醫(yī)院腫瘤研究所保存并傳代。細(xì)胞株使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每48 h更換細(xì)胞培養(yǎng)液，選擇處于對數(shù)生長期、活力良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。FOXD1-siRNA和NC-siRNA購自Santa-Cruz Biotechnology（sc-60649、sc-637007） and Sigma?？贵w購自中國上海生工生物工程股份有限公司。其中FOXD1抗體（貨號D160349）工作濃度為 1∶500，上皮鈣黏著蛋白（E-cadherin）抗體（貨號D190812）工作濃度為 1∶1 000，神經(jīng)鈣黏著蛋白（N-cadherin）抗體（貨號 D199282）工作濃度為 1∶500，磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白 （p-ERK）抗體 （貨號D151580）工作濃度為1∶1 000，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白ERK抗體 （貨號D199863）工作濃度為 1∶1 000，GAPDH 抗體（貨號 D190090）工作濃度為 1∶2 000。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）提取胰腺組織DNA

按照TIANamp Genomic DNA Kit操作步驟提取胰腺癌組織和鄰近正常胰腺組織DNA。離心管中加入組織和緩沖液GA，振蕩混勻。加入蛋白酶K溶液混勻，在56℃放置至組織溶解。加入緩沖液GB，70℃水浴10 min。加入無水乙醇并充分振蕩混勻15 s。將混合液加入吸附柱中（吸附柱在收集管內(nèi)），12 000 r/min離心30 s，棄去上層液。加入緩沖液GD，12 000 r/min離心30 s，棄去上層液。加入漂洗液PW，12 000 r/min離心30 s，棄去上層液，重復(fù)1次。將吸附柱放回收集管，12 000 r/min離心2 min，棄去上層液，室溫靜置晾干。將吸附柱轉(zhuǎn)移至干凈離心管，加入洗脫緩沖液TE，室溫放置5 min后12 000 r/min離心2 min，收集濾液。檢測濾液吸光度（optical density，OD）值，紫外分光光度計(jì)讀取260 nm和280 nm波長OD值，OD260/OD280比值為1.6～1.8的為純DNA，-20℃保存。

（二）提取胰腺癌細(xì)胞株DNA

使用QIAmp DNA Mini Kit抽提細(xì)胞DNA。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)及消化后，1×磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，加入蛋白酶K混勻。加入緩沖液AL，56℃水浴10 min，加入無水乙醇振蕩混勻15 s，將混合液加入吸附柱內(nèi)。吸附柱在收集管內(nèi)，4 000 r/min離心1 min，棄去上層液。加入緩沖液AW1，4 000 r/min離心1 min，棄去上層液。加入緩沖液AW2，13000r/min離心3 min，棄去上層液。將吸附柱移入新收集管內(nèi)，13 000 r/min離心1 min，去除殘留的緩沖液AW2。移入新EP管中，加入緩沖液AE，室溫保溫1 min，4 000 r/min離心1 min后棄去離心柱，得到DNA溶液。紫外分光光度計(jì)讀取260 nm和280 nm波長OD 值，OD260/OD280比值 1.6～1.8時為純 DNA，-20℃保存。

（三）siRNA 轉(zhuǎn)染

將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以1×106個/孔鋪入6孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)保溫過夜。將siRNA用ribo FECT CP buffer稀釋，混勻后室溫保溫5 min。加入ribo FECT試劑，混勻后室溫保溫10 min。其間棄去6孔板內(nèi)培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加入完全培養(yǎng)液。將siRNA混合液加入6孔板內(nèi)，振蕩混勻，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后換液，轉(zhuǎn)染完畢的細(xì)胞用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（四）定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測胰腺組織及細(xì)胞FOXD1 mRNA含量

①引物設(shè)計(jì)：上游:5-GCGAGGACGAAGAAGACGAG-3；下游:5-TCCTCCAGATCCTCCAGCTC-3。② 反 應(yīng) 體 系 ：cDNA 2 μL，2 ×SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，滅菌 ddH2O 2 μL，上、下游引物各取 0.5 μL。 ③反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。④數(shù)據(jù)分析：以GAPDH為內(nèi)參，通過比較腫瘤組織與癌旁正常組織PCR的log10[2^(-ΔΔct)]值，來比較兩者間mRNA表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)參組，通過比較siRNA-control與siRNA-FOXD1 PCR的Δct值來比較兩者間mRNA表達(dá)水平。

（五）蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)檢測

蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)檢測細(xì)胞株FOXD1、E-cadherin、N-cadherin、p-ERK、ERK 表達(dá)。

采用超聲裂解法提取細(xì)胞全蛋白。按80 V的10%積層膠及120 V的4%分離膠進(jìn)行電泳。恒流300 mA轉(zhuǎn)膜2 h。5%的脫脂牛奶封閉液封閉PVDF膜1～2 h。洗膜后將PVDF膜置于一抗或GAPDH抗體中，4℃搖床保溫過夜，回收一抗漂洗。將膜置于二抗中，室溫?fù)u床保溫2 h，回收二抗漂洗。按1∶1將蛋白質(zhì)發(fā)光液A與B液混合，滴PVDF膜上，Tanon-4100全自動數(shù)碼凝膠圖像分析儀進(jìn)行成像分析。

（六）細(xì)胞計(jì)數(shù)盒8（CCK8）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取SW1990細(xì)胞株，分別用siRNA-FOXD1及siRNA-control進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后消化制成單細(xì)胞懸液，按1 000個/孔接種于 96孔培養(yǎng)板。隔夜后換液，總液體量100 μL/孔，設(shè)3個復(fù)孔，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每 24、48、72 h，加入 10 μL/孔，培養(yǎng)3 h后，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長下測定OD值。

（七）Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

取SW1990、PANC-1細(xì)胞株，均分別用siRNAFOXD1及siRNA-control進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將4℃的Matrigel基質(zhì)膠與預(yù)冷的無血清培養(yǎng)液1∶8混合，用預(yù)冷的槍頭鋪于小室聚碳酸酯膜，37℃保溫2 h等待凝固。用無血清的培養(yǎng)液重懸預(yù)先饑餓過夜的細(xì)胞，濃度為1×106個/mL。分別向小室及鋪有Matrigel基質(zhì)膠的小室中加入細(xì)胞懸液，下層24孔板加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。保溫合適時間后用結(jié)晶紫染料染色5 min，清洗染料。擦去小室內(nèi)側(cè)聚碳酸酯膜上的細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

三、TCGA（the Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫

使用 GEPIA 網(wǎng)站（http://gepia.cancer-pku.cn/），檢索FOXD1 mRNA在胰腺癌和正常組織內(nèi)的表達(dá)水平，共350例樣本，及其與病人預(yù)后的關(guān)系，共178例病人。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的比較使用配對t檢驗(yàn)。用Kaplan-Meier方法進(jìn)行總生存期分析。Log-Rank法檢驗(yàn)組間生存差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TCGA數(shù)據(jù)庫研究FOXD1表達(dá)

筆者使用GEPIA網(wǎng)站，在TCGA數(shù)據(jù)庫內(nèi)檢索胰腺癌和正常胰腺組織內(nèi)FOXD1 mRNA的表達(dá)水平。共有179例胰腺癌組織和171例相對應(yīng)的正常胰腺組織，發(fā)現(xiàn)FOXD1 mRNA在胰腺癌表達(dá)高于正常胰腺組織（P＜0.05）（見圖 1）。

另外，分析FOXD1表達(dá)水平與病人預(yù)后的關(guān)系，共178例病人。在預(yù)后生存期方面的數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)OXD1高表達(dá)的胰腺癌病人，其生存期明顯短于FOXD1 相對低表達(dá)的胰腺癌病人（P＜0.05）（見圖 2）。

二、胰腺癌病人樣本及細(xì)胞株的FOXD1表達(dá)

筆者研究本院15例胰腺癌病人的樣本。術(shù)后標(biāo)本病理明確為胰腺導(dǎo)管腺癌，手術(shù)病理分期為ⅠB～Ⅲ期，入組年齡18～75歲,其中男8例,女7例。結(jié)果顯示，12例胰腺癌病人FOXD1 mRNA表達(dá)高于癌旁正常胰腺組織（見圖3）。

筆者對常用細(xì)胞株 SW1990、PANC-1、BXPC-3、HPDE，以蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)檢測FOXD1的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPDE的表達(dá)最低，均低于3株胰腺癌細(xì)胞系（見圖 4）。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫內(nèi)FOXD1高表達(dá)病人與低表達(dá)病人生存期比較

圖3 FOXD1在胰腺癌與正常胰腺組織的mRNA表達(dá)

圖4 FOXD1在胰腺細(xì)胞株的表達(dá)

三、siRNA轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞株FOXD1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)下降

根據(jù)蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)結(jié)果，選取FOXD1表達(dá)較高的SW1990、PANC-1細(xì)胞株，使用siRNA敲低FOXD1 表達(dá)（見圖 5）。

四、FOXD1敲低后胰腺癌細(xì)胞增殖及遷移減弱

轉(zhuǎn)染siRNA敲低SW1990細(xì)胞株FOXD1的表達(dá)后，CCK8實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組與對照組72 h OD值為 2.07±0.14 比 3.49±0.10，P＜0.01，提示 FOXD1 表達(dá)降低后，SW1990細(xì)胞增殖能力減弱（見圖6）。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示FOXD1干擾后，SW1990細(xì)胞遷移能力減弱（P＜0.01）（見圖7）。在另一株胰腺癌細(xì)胞株 PANC-1 中得到同樣結(jié)果（P＜0.01）（見圖 8）。

五、FOXD1敲低后胰腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白質(zhì)變化

圖5 敲低FOXD1后SW1990、PANC-1細(xì)胞株FOXD1 mRNA表達(dá)及蛋白質(zhì)表達(dá)

圖6 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測FOXD1敲低后SW1990增殖能力減弱

使用siRNA-FOXD1敲低SW1990細(xì)胞株的FOXD1表達(dá)量。與對照組siRNA-control轉(zhuǎn)染的SW1990細(xì)胞株比較，發(fā)現(xiàn)敲低FOXD1后，胰腺癌細(xì)胞株內(nèi)的E-cadherin和ERK表達(dá)增加，N-cadherin和p-ERK表達(dá)減弱，可見FOXD1敲低后，細(xì)胞的EMT受到抑制（見圖9）。

圖9 FOXD1敲低后EMT相關(guān)蛋白質(zhì)變化

討 論

圖7 Transwell實(shí)驗(yàn)示FOXD1敲低后SW1990侵襲遷移能力減弱

圖8 Transwell實(shí)驗(yàn)示FOXD1敲低后PANC-1侵襲遷移能力減弱

轉(zhuǎn)錄因子是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄過程中的重要調(diào)節(jié)因子，其受磷酸化、泛素化、乙?；?去乙?；约翱刂贫鄺l信號通路的兩個或多個蛋白質(zhì)之間相互作用的調(diào)控。這些信號通路參與調(diào)節(jié)不同的生理過程及病理變化，如癌癥等[7]。在人體內(nèi)，F(xiàn)OXD1由456個氨基酸構(gòu)成，除叉頭區(qū)域外，還擁有122個氨基酸長度的超酸性氨基端區(qū)域，被認(rèn)為是反式激活的功能域[8]。FOXD1在人體內(nèi)表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、前列腺等諸多組織器官[9-10]，在多種類型人類腫瘤中呈異常的高表達(dá)狀態(tài)，如乳腺癌、胃癌、肺癌等[4-5,11]。不同的是FOXD1在卵巢癌呈低表達(dá)狀態(tài)[12]。有研究顯示，F(xiàn)OXD1促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移并導(dǎo)致化療耐藥[5]。在結(jié)腸直腸癌中，F(xiàn)OXD1高表達(dá)與腸癌腫瘤體積、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及預(yù)后相關(guān)，可通過激活ERK 1/2信號通路促進(jìn)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移[13]。在胃癌的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，相比于正常胃組織，F(xiàn)OXD1在胃癌細(xì)胞中表達(dá)更高，其通過激活PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)胃癌進(jìn)展，并與腫瘤細(xì)胞化療抵抗相關(guān)[11]。以上結(jié)果顯示FOXD1的表達(dá)可在一定程度上作為腫瘤病人預(yù)后的參考依據(jù)；另一方面，也為部分FOXD1高表達(dá)的病人提供靶向治療的依據(jù)。因此，有必要研究FOXD1在胰腺癌中的表達(dá)。筆者在TCGA數(shù)據(jù)庫內(nèi)比較FOXD1在胰腺癌和正常胰腺組織內(nèi)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FOXD1在胰腺癌內(nèi)表達(dá)明顯高于正常胰腺組織，且其高表達(dá)與病人預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果也顯示，相比于癌旁正常組織，胰腺癌組織的FOXD1表達(dá)明顯升高。細(xì)胞研究顯示，與正常HPDE相比，F(xiàn)OXD1在常見胰腺癌細(xì)胞株如SW1990、BXPC-3、PANC-1中均呈高表達(dá)狀態(tài)。

FOXD1在多種腫瘤中發(fā)揮致癌基因的作用[9,12,14]。乳腺癌FOXD1呈高表達(dá)狀態(tài)。通過抑制P27的表達(dá)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞從G1期轉(zhuǎn)化成S期，導(dǎo)致癌細(xì)胞化療耐藥[5]。敲低FOXD1表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力[15]。一項(xiàng)肺癌的研究也證實(shí)，F(xiàn)OXD1高表達(dá)提高肺癌的侵襲性，其機(jī)制是通過Gal-3介導(dǎo)的 integrin-β1通路[14]。 FOXD1在結(jié)腸癌中，通過Plk2通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[13]。為研究FOXD1在胰腺癌發(fā)展中的生物學(xué)行為，筆者選取FOXD1表達(dá)水平最高的SW1990細(xì)胞株，使用siRNA轉(zhuǎn)染敲低FOXD1的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)FOXD1表達(dá)降低后，胰腺癌細(xì)胞增殖及遷移能力均出現(xiàn)一定減弱。在另一株胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1中，也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染FOXD1敲低表達(dá)，使細(xì)胞遷移能力減弱。

EMT是影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素之一，是由上皮細(xì)胞形態(tài)向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，其最大的特征在于細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-cardherin、occludin表達(dá)升高,而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如N-cardherin、vimentin表達(dá)降低。EMT是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程，除低氧誘導(dǎo)外，還受ERK、Wnt/β-catenin、Notch、TGF-β、FGF、EGF、HGF 等通路的調(diào)控[16]。 有研究顯示，ERK通路參與胰腺癌的增殖、侵襲及遷移[17-18]。一項(xiàng)結(jié)腸癌的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD1通過激活ERK通路促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在FOXD1被干擾后，ERK通路的p-ERK隨FOXD1被干擾而表達(dá)降低，而ERK表達(dá)升高，提示FOXD1可能是ERK的上游基因，敲低FOXD1可抑制ERK通路的活化。另外，筆者發(fā)現(xiàn)，隨著FOXD1表達(dá)下降，胰腺癌細(xì)胞株的上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物E-cardherin表達(dá)升高，而間充質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物N-cardherin表達(dá)降低，因此推測，F(xiàn)OXD1可能通過激活ERK通路影響EMT來促進(jìn)胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移，但其具體機(jī)制仍有待明確。

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)OXD1在胰腺癌組織及細(xì)胞株中呈高表達(dá)。降低FOXD1表達(dá)后，胰腺癌細(xì)胞的增殖及遷移能力均減弱。降低FOXD1表達(dá)后，上皮細(xì)胞表型E-cadherin及ERK表達(dá)升高，間質(zhì)細(xì)胞表型N-cadherin和p-ERK表達(dá)減弱。