鄔佳穎，毛丙永，谷佳玉，崔樹茂，張秋香

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

人體腸道內(nèi)定植著1014個(gè)微生物，包括1 000多個(gè)種[1]，腸道菌群組成受到基因、飲食、疾病等多種因素的影響。水蘇糖天然存在于地黃或大豆中，是一種由半乳糖(α1→6)半乳糖(α1→6)葡萄糖(α1→2β)果糖組成的功能性低聚糖，具有預(yù)防齲齒、調(diào)節(jié)腸道菌群、緩解便秘、保護(hù)肝臟等功能[2-4]。水蘇糖不能被人體消化吸收，會(huì)直接進(jìn)入大腸，有些腸道細(xì)菌能利用水蘇糖產(chǎn)氣[5]，因此攝入過量水蘇糖可能會(huì)導(dǎo)致脹氣等不良反應(yīng)。

目前關(guān)于腸道菌利用水蘇糖的相關(guān)研究較少。HAYAKAWA等在1990年研究大豆低聚糖對(duì)人類腸道菌群的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)所用的125株腸道細(xì)菌中，包括雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、多形桿狀菌屬、光崗菌屬、巨單胞菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌屬在內(nèi)的7個(gè)屬的58株菌能夠利用水蘇糖[6]。WAGNER等[7]發(fā)現(xiàn)給大鼠飼喂水蘇糖后會(huì)產(chǎn)H2，但未研究是哪些菌利用水蘇糖產(chǎn)氣；ZHONG等[8]發(fā)現(xiàn)水蘇糖可以促進(jìn)嗜酸乳桿菌CICC22162的生長(zhǎng)；水蘇糖與棉籽糖結(jié)構(gòu)類似，從自然發(fā)酵的綠桌橄欖中分離到的乳酸菌幾乎都能利用棉籽糖，其中81%的菌株也能發(fā)酵水蘇糖[9]。

本實(shí)驗(yàn)從健康人糞便中篩選能夠利用水蘇糖的細(xì)菌，并結(jié)合培養(yǎng)液上清液中糖的組成、菌株產(chǎn)氣情況、酶活以及基因組草圖分析等，研究菌株對(duì)水蘇糖的利用特性，對(duì)于水蘇糖與人體健康關(guān)系的研究具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

水蘇糖，上海源葉生物科技有限公司；棉籽糖，生工生物工程(上海)股份有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨，英國(guó)Oxoid公司。

改良腸道微生物培養(yǎng)基(gut microbical culture medium，GMM)：水蘇糖8 g，胰蛋白胨4 g，KH2PO42 g，酵母提取物2 g，NaCl 0.08 g，CaCl20.008 g，MgSO4·7H2O 0.002 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.73 mg，吐溫-80 0.5 mL，L-半胱氨酸鹽酸鹽1 g，ATCC Trace Mineral Mix 10 mL，ATCC Vitamin Mix 10 mL。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加入1.5%～2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂粉，并添加15 mL 0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的溴甲酚紫作為指示劑。

1.2 利用水蘇糖的腸道菌的分離與鑒定

采集2名健康成年人的新鮮糞便樣本，并將樣本懸浮在0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的生理鹽水中；梯度稀釋，將樣品涂布在以水蘇糖作為唯一碳源、并添加溴甲酚紫指示劑的GMM固體培養(yǎng)基上[10]，置于厭氧工作站37 ℃培養(yǎng)24～48 h；挑取能使培養(yǎng)基變黃的菌落，轉(zhuǎn)接到GMM固體培養(yǎng)基上，劃線分離、純化菌株，并對(duì)菌株進(jìn)行16S rRNA測(cè)序鑒定。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)上清液中水蘇糖的高效液相色譜分析

菌株在以水蘇糖作為唯一碳源的GMM培養(yǎng)基中37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，以8 000×g離心5 min收集上清液，采用高效液相色譜儀Water 1525測(cè)定上清液中水蘇糖的含量，外標(biāo)法定量。色譜條件：采用SugarPak1糖柱(300 mm，id 3.5 μm)，柱溫85 ℃，流動(dòng)相為純水，流量為0.4 mL/min。

1.4 細(xì)菌利用水蘇糖生長(zhǎng)的表征

將菌株接種于以水蘇糖作為唯一碳源的GMM培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，每隔1 h取樣，測(cè)定菌液的pH值和600 nm處的吸光度(OD600)。同時(shí)取1 mL待測(cè)菌液于1.5 mL離心管以8 000×g離心5 min，收集上清液備用。當(dāng)菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，停止實(shí)驗(yàn)。

1.5 α-半乳糖苷酶活力測(cè)定

α-半乳糖苷酶活力測(cè)定主要參照SCALABRINI等[11]的方法：經(jīng)8 000×g離心5 min得菌泥和上清液，其中菌泥經(jīng)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗滌2次后重懸，與100 μL氯仿混合，振蕩破碎，制成粗酶液。將250 μL粗酶液或上清液與對(duì)硝基苯α-D-氨基半乳糖苷混合，在37 ℃下反應(yīng)30 min，加入0.2 mol/L 500 μL Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測(cè)定420 nm下的吸光值。菌泥測(cè)定結(jié)果對(duì)應(yīng)胞內(nèi)酶活，上清液測(cè)定結(jié)果對(duì)應(yīng)胞外酶活。

酶活定義：在測(cè)定條件下，1 min釋放1 μmol的對(duì)硝基苯酚所消耗的酶量(mL)為1個(gè)酶活力單位。

1.6 產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)

將菌株以3%的接種量接種于裝有倒置杜氏小管的水蘇糖GMM培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h，觀察產(chǎn)氣情況并記錄。

1.7 基因組草圖的測(cè)定

將菌株以4%的接種量接種至5 mL MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，置于厭氧工作站37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。活化2次的菌株以4%的接種量接種至裝有80 mL MRS液體培養(yǎng)基的藍(lán)蓋瓶中，置于厭氧工作站培養(yǎng)24～48 h。之后將菌液以8 000×g離心10 min得到菌泥，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行基因組草圖測(cè)序。

采用Illumina HiSeq 2000(Illumina Inc USA)[11]測(cè)序平臺(tái)對(duì)送測(cè)菌株的基因組進(jìn)行雙末端測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)即大于基因組100倍的PE150測(cè)出數(shù)據(jù)量。然后對(duì)其堿基質(zhì)量、堿基錯(cuò)誤率、堿基分布進(jìn)行質(zhì)量控制，對(duì)低質(zhì)量reads和adapter進(jìn)行質(zhì)量剪切，得到高質(zhì)量的讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)。上述步驟均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

使用短序列組裝軟件SOAPdenovo2進(jìn)行從頭組裝[12]，調(diào)試不同K-mer值，選取N50較長(zhǎng)和Scaffold數(shù)量較小的K-mer值進(jìn)行拼接，同時(shí)調(diào)節(jié)-u、-r、-R、-F等參數(shù)，獲得初步組裝結(jié)果?；趓eads的paired-end和overlap關(guān)系，將reads對(duì)比到contigs上，獲得最終組裝結(jié)果。調(diào)用Gap Closer軟件填補(bǔ)contigs間的內(nèi)部空白[13]，過濾500 bp讀長(zhǎng)以下的結(jié)果，獲得完整序列。

采用GeneMark1.1[14]和Glimmer3.02[15]軟件預(yù)測(cè)送測(cè)菌株草圖序列中的蛋白質(zhì)編碼基因，已默認(rèn)參數(shù)獲取開放閱讀框(open reading frame，ORF)的相關(guān)信息。在預(yù)測(cè)得到的編碼基因基礎(chǔ)上進(jìn)行基因的功能注釋，將草圖基因的蛋白質(zhì)序列與各大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，保留前5條序列相似性較高的結(jié)果，獲得相應(yīng)的功能注釋信息，以此初步確定該蛋白序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)具備相似的功能。上述步驟均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。本實(shí)驗(yàn)主要使用的是京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)的數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)包括了完整或部分測(cè)序基因組的序列、細(xì)胞生化過程的圖解以及酶分子、酶反應(yīng)等信息[16]。

1.8 SignalP 5.0預(yù)測(cè)信號(hào)肽

在SignalP 5.0軟件中輸入菌株基因片段的氨基酸或核酸序列，選擇物種(革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌)后，系統(tǒng)將對(duì)其進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。結(jié)果以圖表形式呈現(xiàn)，根據(jù)出現(xiàn)Sec信號(hào)肽(Sec/SPI)、脂蛋白信號(hào)肽(Sec/SPII)、Tat信號(hào)肽(Tat/SPI)或無信號(hào)肽(other)的概率來確定測(cè)試基因片段是否存在信號(hào)肽。

1.9 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)中pH值、OD600、糖含量與酶活力的測(cè)定均為3次平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 能利用水蘇糖的腸道細(xì)菌的分離與鑒定

腸道細(xì)菌利用水蘇糖會(huì)產(chǎn)酸，使指示劑變色。根據(jù)指示劑變色結(jié)果，并結(jié)合16S rRNA測(cè)序鑒定，從糞便樣品中初步鑒定出23株能利用水蘇糖的細(xì)菌，包括6個(gè)屬、8個(gè)種(表1)。

表1 健康成年人糞便中分離到的能利用水蘇糖的細(xì)菌Table 1 The intestinal bacteria capable of utilizing stachyose isolated from the feces of healthy adults

由于實(shí)驗(yàn)所使用的水蘇糖純度僅為85%，試劑中含有的其他成分也可能被菌株利用，因此進(jìn)一步采用高效液相色譜法測(cè)定菌株上清液中水蘇糖的含量，根據(jù)水蘇糖的消耗量確定能夠利用水蘇糖的細(xì)菌。結(jié)果表明，實(shí)際能利用水蘇糖的細(xì)菌有12株，包括3個(gè)屬、4個(gè)種，分別為肺炎克雷伯氏菌、屎腸球菌、糞腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(表2)。

表2 細(xì)菌培養(yǎng)上清液中水蘇糖含量的測(cè)定 單位：g/L

已有文獻(xiàn)報(bào)道短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、肺炎克雷伯氏菌等多種菌株能夠利用水蘇糖[17-18]，而屎腸球菌、糞腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌利用水蘇糖的研究為首次報(bào)道。在BARBARA等[18]的實(shí)驗(yàn)中，屎腸球菌并不能利用水蘇糖，而本實(shí)驗(yàn)成功篩選到多株能夠利用水蘇糖生長(zhǎng)的屎腸球菌(A6、A22、B8B)。

2.2 腸道菌在GMM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

為研究篩選出來的腸道菌對(duì)水蘇糖的利用情況，從4種菌中各選1株測(cè)定其在以水蘇糖作為唯一碳源的GMM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(圖1)。各菌株以相同的接種量、相同的培養(yǎng)條件進(jìn)行生長(zhǎng)，呈現(xiàn)出不同的生長(zhǎng)情況。肺炎克雷伯氏菌A3生長(zhǎng)最快，在3 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，培養(yǎng)至5 h結(jié)束實(shí)驗(yàn)；屎腸球菌A6、糞腸球菌A13、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15在培養(yǎng)5 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，培養(yǎng)至8 h結(jié)束實(shí)驗(yàn)。進(jìn)入穩(wěn)定期后，4株菌的上清液pH值為4.40～5.40，A6、A13和B15的OD600達(dá)到1.30以上。

A-肺炎克雷伯氏菌A3；B-屎腸球菌A6；C-糞腸球菌A13；D-產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15圖1 菌株在以水蘇糖作為唯一碳源的GMM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curves of the strains in GMM medium with stachyose as the sole carbon source

2.3 腸道菌培養(yǎng)上清液中水蘇糖及棉籽糖含量測(cè)定

由圖1可知，不同菌株對(duì)水蘇糖的利用情況不同。采用高效液相色譜跟蹤測(cè)定菌株培養(yǎng)上清中的水蘇糖和棉籽糖含量，發(fā)現(xiàn)所有菌株的上清液中水蘇糖的含量隨時(shí)間增長(zhǎng)而減少(表3、表4)，而棉籽糖含量的變化并不相同。其中，屎腸球菌A6和糞腸球菌A13的棉籽糖含量逐漸增加；而產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15上清液中的棉籽糖含量逐漸減少；肺炎克雷伯氏菌A3生長(zhǎng)較快，棉籽糖含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)(表4)。

表3 不同時(shí)間菌株上清液中殘留糖含量 單位：%

表4 不同時(shí)間肺炎克雷伯氏菌A3上清液中殘留糖含量 單位：%

2.4 腸道菌α-半乳糖苷酶活力測(cè)定

細(xì)菌水解水蘇糖需要α-半乳糖苷酶，根據(jù)酶所處位置(胞外、胞內(nèi))，可以進(jìn)一步推斷其利用機(jī)制。選擇穩(wěn)定期的菌株進(jìn)行酶活測(cè)定，由表5可知，肺炎克雷伯氏菌A3具有較高的胞外α-半乳糖苷酶活力，是胞內(nèi)酶活力的20倍；屎腸球菌A6、糞腸球菌A13的胞內(nèi)酶活力較高，是胞外酶活力的30～40倍；產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15的胞內(nèi)酶活力也較胞外酶活力高。由此可見，肺炎克雷伯氏菌A3的α-半乳糖苷酶以胞外為主，其余3株菌的α-半乳糖苷酶以胞內(nèi)為主。α-半乳糖苷酶大多存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，除肺炎克雷伯氏菌A3外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本與報(bào)道符合[19-20]。

表5 α-半乳糖苷酶酶活力測(cè)定 單位：U/L

2.5 菌株利用水蘇糖產(chǎn)氣情況

水蘇糖進(jìn)入人體后不被小腸消化吸收，可以達(dá)到大腸被腸道細(xì)菌發(fā)酵。攝入高劑量的水蘇糖，可能會(huì)出現(xiàn)腸胃脹氣、腹瀉、消化不良等不適反應(yīng)[21-22]。我們對(duì)篩選出的12株菌進(jìn)行了產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示，5株菌能夠利用水蘇糖產(chǎn)氣，分別為肺炎克雷伯氏菌A3、A4、A16、屎腸球菌B8和產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15，而其余7株不能產(chǎn)氣。其中，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15產(chǎn)氣最明顯，杜氏小管被氣泡充滿。氣體的產(chǎn)生能為產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌提供一個(gè)良好的厭氧環(huán)境，有助于它的生長(zhǎng)[23]。

表6 不同菌株在以水蘇糖作為唯一碳源的GMM培養(yǎng)基中的 產(chǎn)氣情況Table 6 Gas production of different strains in GMM medium with stachyose as the sole carbon source

腸道中的氣體主要有N2、O2、CO2、H2、CH4以及各種痕量氣體(如H2S、NO等)[24]。腸道菌發(fā)酵糖類產(chǎn)生的氣體主要有兩種：一是CO2，由戊糖磷酸途徑代謝6-磷酸葡萄糖產(chǎn)生；二是H2，由丙酮酸脫羧過程產(chǎn)生。丙酮酸脫羧產(chǎn)氫也可分為梭狀芽孢桿菌型和腸桿菌型[25]。在梭狀芽孢桿菌型中，丙酮酸脫羧后形成焦磷酸硫胺素(thiamine pyrohosphate，TPP)-酶復(fù)合物，該復(fù)合物將電子轉(zhuǎn)移給鐵氧還蛋白(ferredoxin,Fd)，還原型的Fd被氫化酶氧化并產(chǎn)生H2；在腸桿菌型中，丙酮酸轉(zhuǎn)化為甲酸，通過甲酸裂解以及Fd氧化釋放CO2和H2[26]。研究實(shí)驗(yàn)菌株產(chǎn)氣所涉及的酶系，需要結(jié)合基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.6 基因組草圖分析

對(duì)屎腸球菌A6、糞腸球菌A13、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15、肺炎克雷伯氏菌A3進(jìn)行基因組草圖測(cè)序，4株菌的基因組草圖數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳至NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果如表7所示。屎腸球菌和糞腸球菌的GC含量均在38%左右，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[27-28]。產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15的GC含量約為39%，基因數(shù)量最少；肺炎克雷伯氏菌A3在4株菌中GC含量最高。

表7 細(xì)菌的基因組草圖信息Table 7 Bacterial genome sketch information

送測(cè)基因組草圖的菌株中，肺炎克雷伯氏菌A3和產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15均能利用水蘇糖產(chǎn)氣。已有研究表明，肺炎克雷伯氏菌等兼性厭氧菌在產(chǎn)氣過程中，通過丙酮酸甲酸裂解酶將丙酮酸轉(zhuǎn)化為甲酸，再由甲酸裂解酶系統(tǒng)的多酶復(fù)合物分解甲酸產(chǎn)氫[29]。一般來說，甲酸裂解酶是由甲酸脫氫酶-H、氫化酶以及電子載體組成的復(fù)合物[30]。甲酸裂解酶-H的大亞基由fdh基因編碼表現(xiàn)出催化性質(zhì)，而其余部分是由hcyBCDEFG編碼起還原氫分子的作用[31]；hypABCDE編碼合成氫化酶[32]；fhlA作為決定性基因，是中央調(diào)節(jié)因子[33]。肺炎克雷伯氏菌A3的基因組草圖數(shù)據(jù)中能夠找到上述相關(guān)基因片段(圖2)。

A-氫化酶以及電子載體部分基因片段；B-甲酸脫氫酶-H大亞基部分基因片段圖2 肺炎克雷伯氏菌A3中與產(chǎn)氣相關(guān)的基因簇Fig.2 Gene clusters related to gas production in Klebsiella pneumoniae A3注：圖譜上箭頭的長(zhǎng)度和方向分別代表了基因的長(zhǎng)度和編碼方向；如果出現(xiàn)基因上下錯(cuò)開的情況，說明該基因與上游或下游基因有重疊(下同)

產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌產(chǎn)氫途徑是梭狀芽孢桿菌型，產(chǎn)氫過程主要涉及丙酮酸脫氫酶復(fù)合物。在銅綠假單胞菌中該復(fù)合物由調(diào)節(jié)基因(pdhR)，丙酮酸脫氫酶E1(aceE)，二氫脂酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶E2(aceF)和二氫脂酰胺脫氫酶E3(lpd)構(gòu)成[34]。產(chǎn)氣莢膜梭狀桿菌B15存在類似的基因片段(圖3)，由丙酮酸脫氫酶E1的α-亞基(pdhA)、丙酮酸脫氫酶E1的β-亞基(pdhB)，二氫脂酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶E2(aceF)和二氫脂酰胺脫氫酶E3(lpd)構(gòu)成。丙酮酸脫氫酶復(fù)合物在TPP作用下，將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A并釋放CO2，并在由por基因編碼的丙酮酸鐵氧還蛋白還原酶作用下將Fe3+轉(zhuǎn)化為Fe2+，F(xiàn)e2+又被氫化酶氧化釋放H2。

圖3 產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15中丙酮酸脫氫酶 復(fù)合物基因片段Fig.3 Gene fragment of pyruvate dehydrogenase complex in Clostridium perfringens B15

菌株徹底代謝水蘇糖需要α-半乳糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶以及相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[35]。ALEXANDER等[36]研究了變異鏈球菌中多糖代謝(msmEFGK)轉(zhuǎn)運(yùn)體，擁有msmEFGK轉(zhuǎn)運(yùn)體的變異鏈球菌能夠轉(zhuǎn)運(yùn)代謝蜜二糖、棉籽糖、水蘇糖、異麥芽糖、異麥芽糖醇(圖4)，缺失msmE基因時(shí)，菌株不能利用棉籽糖或水蘇糖。aga、galA、melA等基因能夠編碼合成α-半乳糖苷酶參與水蘇糖的水解，當(dāng)水蘇糖被α-半乳糖苷酶水解后2個(gè)半乳糖就生成了蔗糖[35,37]。據(jù)報(bào)道，代謝蔗糖的基因簇由5個(gè)基因組成，包括sacK(果糖激酶)、PTS(PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng))、sacA(β-呋喃果糖苷酶)、sacR(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白)以及agl(α-葡萄糖苷酶)[38]。

圖4 變異鏈球菌msmEFGK轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取碳水化合物Fig.4 Carbohydrate uptake by msmEFGK transporters in Streptococcus mutans

通過分析菌株的基因組草圖，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15中與水蘇糖利用相關(guān)的基因與變異鏈球菌相似[36](圖4)。與變異鏈球菌相比，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15缺少msmK基因，但轉(zhuǎn)運(yùn)水蘇糖的功能并未受到影響，因此依靠msmEFG基因也能轉(zhuǎn)運(yùn)水蘇糖。產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15利用msmEFG轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)水蘇糖，由galA基因編碼的α-半乳糖苷酶將其水解為2分子半乳糖和1分子蔗糖。由dexB(α-葡萄糖苷酶)、scrA(PTS系統(tǒng))、sacA(β-呋喃果糖苷酶)、scrR(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子)、scrK(果糖激酶)構(gòu)成的基因簇負(fù)責(zé)水解蔗糖并用于后續(xù)代謝(圖5)。

圖5 產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15中與水蘇糖利用 相關(guān)的基因簇Fig.5 Gene clusters related to stachyose utilization in Clostridium perfringens B15

屎腸球菌A6和糞腸球菌A13在糖組成分析、α-半乳糖苷酶活力測(cè)定以及與水蘇糖代謝相關(guān)的基因方面均呈現(xiàn)出一定的相似性(圖6-A、圖6-B)，表明2株菌可能采用相同的方式利用水蘇糖。通過查閱《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(《Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology》)，發(fā)現(xiàn)屎腸球菌和糞腸球菌不能利用棉籽糖[39]。高效液相色譜結(jié)果顯示屎腸球菌A6和糞腸球菌A13在生長(zhǎng)過程中上清液中的棉籽糖含量增加(表3)，表明屎腸球菌A6和糞腸球菌A13均不能利用棉籽糖，這種現(xiàn)象與保加利亞乳桿菌利用乳糖的情況類似。保加利亞乳桿菌中存在乳糖/半乳糖逆向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(圖6-C)，乳糖通過lacS基因編碼的乳糖通透酶進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被水解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖被代謝利用，而游離的半乳糖則被釋放到細(xì)胞外[40]。屎腸球菌A6、糞腸球菌A13都有一段連續(xù)的galA、msmE、msmF、msmG基因，可能通過msmEFG轉(zhuǎn)運(yùn)體將水蘇糖轉(zhuǎn)運(yùn)胞內(nèi)，由galA基因編碼的α-半乳糖苷酶將水蘇糖水解為半乳糖和棉籽糖，再將不能利用的棉籽糖釋放到細(xì)胞外。而負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)棉籽糖至胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，目前尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

A-屎腸球菌A6；B-糞腸球菌A13；C-乳糖/半乳糖逆向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)圖6 屎腸球菌A6、糞腸球菌A13中水蘇糖利用 相關(guān)基因及保加利亞乳桿菌中乳糖/半乳糖逆向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Fig.6 Gene clusters related to stachyose utilization in Enterococcus faecium A6 Enterococcus faecalis A13 and lactose/galactose reverse transport system in Lactobacillus bulgaricus圖譜上箭頭的長(zhǎng)度和方向分別代表了基因的長(zhǎng)度和編碼方向

根據(jù)α-半乳糖苷酶酶活力測(cè)定結(jié)果(表5)，肺炎克雷伯氏菌A3可能在胞外水解水蘇糖，但是分析基因組草圖并未發(fā)現(xiàn)能將α-半乳糖苷酶釋放至胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(圖7)。利用SignalP 5.0對(duì)菌株基因片段中的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)α-半乳糖苷酶的基因片段中并無信號(hào)肽，無法產(chǎn)生分泌蛋白(表8)。因此，肺炎克雷伯氏菌A3是否能在胞外水解水蘇糖還有待驗(yàn)證。

圖7 肺炎克雷伯氏菌A3中α-半乳糖苷酶及 β-呋喃果糖苷酶所在基因簇Fig.7 Gene clusters of α-galactosidase and β-fructofuranosidase in Klebsiella pneumoniae A3

綜上所述，初步判斷菌株對(duì)水蘇糖可能的利用方式為：

(1)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15通過msmEFG轉(zhuǎn)運(yùn)體將水蘇糖轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，然后由胞內(nèi)α-半乳糖苷酶和β-呋喃果糖苷酶水解成單糖進(jìn)行后續(xù)利用；

(2)屎腸球菌A6和糞腸球菌A13利用msmEFG轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)水蘇糖，α-半乳糖苷酶將其水解為半乳糖和棉籽糖，通過類似乳糖/半乳糖逆向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的方式，將不利用的棉籽糖釋放到細(xì)胞外；

(3)肺炎克雷伯氏菌A3對(duì)水蘇糖的利用方式目前尚不明確，仍需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

表8 肺炎克雷伯氏菌A3中α-半乳糖苷酶信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果Table 8 Prediction results of α-galactosidase signal peptide in Klebsiella pneumoniae A3

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從糞便中成功篩選到12株能夠利用水蘇糖的腸道細(xì)菌，分別屬于肺炎克雷伯氏菌、屎腸球菌、糞腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌。

不同菌株利用水蘇糖的生長(zhǎng)情況不同，利用水蘇糖的方式也存在差異。大部分菌株以胞內(nèi)α-半乳糖苷酶為主，肺炎克雷伯氏菌以胞外α-半乳糖苷酶為主，12株菌中僅肺炎克雷伯氏菌A3、A4、A16、屎腸球菌B8和產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15能夠利用水蘇糖產(chǎn)氣。不同菌株的產(chǎn)氣方式也不同,肺炎克雷伯氏菌A3通過丙酮酸甲酸裂解酶將丙酮酸轉(zhuǎn)化為甲酸，再由甲酸裂解酶分解甲酸產(chǎn)氣；產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌B15利用丙酮酸脫氫酶復(fù)合物產(chǎn)生CO2。

菌株對(duì)水蘇糖的利用可能存在以下2種方式：(1)利用msmEFG轉(zhuǎn)運(yùn)體將水蘇糖轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，由α-半乳糖苷酶和β-呋喃果糖苷酶將其水解利用；(2)利用msmEFG轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)水蘇糖，α-半乳糖苷酶將其水解為半乳糖和棉籽糖，將不利用的棉籽糖釋放到細(xì)胞外。

本實(shí)驗(yàn)篩選得到了12株能利用水蘇糖的腸道細(xì)菌，并采用高效液相色譜技術(shù)結(jié)合基因組學(xué)分析，研究了菌株對(duì)水蘇糖的利用方式。今后可以更深入地研究腸道細(xì)菌對(duì)水蘇糖的利用機(jī)制，揭示攝入過量水蘇糖引起人體不適的機(jī)理，對(duì)于探究水蘇糖與人體健康的關(guān)系具有一定的指導(dǎo)意義。