李冬龍，李拂曉，葛艷靜，謝彩鋒，劉繼棟，杭方學(xué)*

1(廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西壯族自治區(qū) 南寧，530004)2(蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西大學(xué)， 廣西壯族自治區(qū) 南寧，530004)

豆醬是一類(lèi)以豆類(lèi)為主要原料，利用微生物發(fā)酵制得的調(diào)味品，具有適口的咸、鮮等滋味，廣泛流傳于中國(guó)、日本、韓國(guó)等東亞國(guó)家和地區(qū)[1]。豆醬生產(chǎn)可分為制曲及制醬兩部分，其中制曲階段主要通過(guò)微生物代謝活動(dòng)產(chǎn)生蛋白酶[2]、淀粉酶[3]等以降解基質(zhì)，制醬階段通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵形成豆醬的特有風(fēng)味[4]。當(dāng)前，豆醬生產(chǎn)多以自然發(fā)酵為主，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)所需的高效、快捷及品質(zhì)穩(wěn)定等要求。針對(duì)此問(wèn)題，學(xué)者在豆醬發(fā)酵工藝控制[5]、發(fā)酵菌種選育[6]進(jìn)行了諸多研究。然而，對(duì)功能性豆醬制品的研發(fā)尚處于初級(jí)階段。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種中樞神經(jīng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓[7]、抗抑郁[8]、緩解體力疲勞[9]、防老年癡呆[10]、改善睡眠[11]等諸多作用，其食品安全性已得到廣泛驗(yàn)證。在生物體內(nèi)，GABA主要由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶脫羧所得[12]，其產(chǎn)量受限于基質(zhì)中的游離氨基酸含量。而豆醬制曲通過(guò)醬曲中的米曲霉等微生物活動(dòng)分泌蛋白酶降解醬曲中的蛋白質(zhì)，為微生物活動(dòng)及產(chǎn)品提供氨基酸態(tài)氮，蛋白酶活性的高低很大程度決定了產(chǎn)品的品質(zhì)。在常規(guī)工藝條件下，豆醬中可檢測(cè)到痕量的GABA[13]，制曲工藝的差異也會(huì)導(dǎo)致GABA含量波動(dòng)性變化。研究還表明，基質(zhì)中的碳源種類(lèi)對(duì)豆醬風(fēng)味形成[5]和GABA積累[14]有一定影響，如HAJAR-AZHARI等[15]和WAN-MOHTAR等[16]發(fā)現(xiàn)添加外源天然糖對(duì)米曲霉富集GABA有促進(jìn)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)制曲工藝及基質(zhì)成分優(yōu)化實(shí)現(xiàn)GABA在豆醬制品中的參數(shù)可控調(diào)節(jié)?；诖?，本研究擬通過(guò)豆醬制曲工藝及培養(yǎng)基質(zhì)中碳源優(yōu)化，考察對(duì)蛋白酶酶活、GABA含量及谷氨酸含量的影響。在此基礎(chǔ)上，使用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)分析各因素及其交互作用獲得最優(yōu)的制曲條件，實(shí)現(xiàn)高蛋白酶活力醬曲中GABA的過(guò)量積累。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆、糙米、香滿園特一級(jí)小麥粉,廣西南寧市冠超市；米曲霉孢子粉(Aspergillusoryzae3.042),上海佳民釀造食品有限公司。

L-酪氨酸、酪蛋白、Na2CO3、濃HCl、NaOH、三氯乙酸、蔗糖、NaH2PO4、Na2HPO4(均為分析純)；乙酸鈉、硼酸(優(yōu)級(jí)純)；福林酚試劑,北京索萊寶科技有限公司；谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品、鄰苯二甲醛、β-巰基乙醇(純度均>99%),上海麥克林生化科技有限公司；乙腈、甲醇(色譜純),廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-82A水浴恒溫振蕩器，金壇市醫(yī)療儀器廠；UV-1000紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；Cenlee 16R高速冷凍離心機(jī)，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；WK-800A高速藥物粉碎機(jī)，青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司；安捷倫1100高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；BMJ-160C霉菌培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；STARTER-3100酸度計(jì)、PWN124ZH電子天平，奧豪斯儀器有限公司；KQ-數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 豆醬制曲工藝

將黃豆清凈，去除較差外觀黃豆，浸泡處理12 h去除豆腥味[17]。將浸泡后的黃豆蒸煮30 min，冷卻至40 ℃后與一定比例小麥粉混合，接種0.1%米曲霉孢子粉于霉菌培養(yǎng)箱制曲，濕度設(shè)置為95%，溫度控制為28～30 ℃，挑選最優(yōu)小麥粉與黃豆配比發(fā)酵基質(zhì)。優(yōu)化試驗(yàn)則在最優(yōu)小麥粉配比醬坯的基礎(chǔ)上，依次添加不同比例糙米粉、蔗糖后制曲。

1.3.2 豆醬醬曲水分含量的測(cè)定

使用直接干燥法，參考GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》。

1.3.3 蛋白酶酶活測(cè)定

稱(chēng)取醬曲5 g，充分研磨后使用pH 7.2的10 mmol/L H3PO4緩沖溶液稀釋至100 mL靜置30 min，各取1 mL上清液置于40 ℃水浴中預(yù)熱后測(cè)定酶活(以干曲重計(jì)算酶活)。蛋白酶活力測(cè)定依照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23527—2009 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 蛋白酶制劑》。蛋白酶活U定義：在40 ℃條件下，1 min水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸定義為一個(gè)U。

1.3.4 醬曲中GABA與谷氨酸提取及測(cè)定

稱(chēng)取GABA、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各0.100 g，使用超純水溶解至100 mL得1.0 mg/mL的GABA、谷氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。使用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液依次配制0.005、0.010、0.020、0.040、0.080、0.160、0.320 mg/mL的GABA、谷氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。樣品中GABA與谷氨酸提取方法在任佳秀等[18]的研究上改進(jìn)，稱(chēng)取醬曲0.5 g，加入5 mL三氯乙酸溶液，超聲提取30 min 2次，提取液經(jīng)離心(10 000 r/min、10 min、24 ℃)后，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶，置于4 ℃冰箱待測(cè)。

衍生化試劑與衍生條件在王嘉怡等[9]的研究上改進(jìn)，使用鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde，OPA)柱前在線衍生法。OPA衍生劑配制：稱(chēng)取120.0 mg OPA，依次加入2 mL甲醇(色譜純)、300 μL β-巰基乙醇及4 mL硼酸溶液(0.4 mol/L，pH 9.5)后經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾于樣品瓶中待用。使用安捷倫自動(dòng)進(jìn)樣器實(shí)現(xiàn)在線衍生，程序進(jìn)樣在現(xiàn)有研究[19]上改進(jìn)：吸取樣品5 μL；不吸取清洗瓶超純水；吸取OPA衍生劑5 μL；吸取清洗瓶超純水；在空氣中最大速度混合10 μL，不混合10次；等待2 min；進(jìn)樣。

色譜條件：色譜柱Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為25 mmol/L乙酸鈉溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序：0～5 min，流動(dòng)相為90%A和10%B；5～20 min，B相由10%上升至35%；20～28 min，流動(dòng)相保持65%A和35%B；在28～30 min，B相由35%降低至10%。檢測(cè)條件：安捷倫VWD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm；柱溫40 ℃；總進(jìn)樣量10 μL。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

按照1.3.1進(jìn)行制曲。糙米添加量對(duì)醬曲品質(zhì)的影響試驗(yàn)為：蔗糖添加量固定為6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，制曲時(shí)間固定為60 h，糙米添加量設(shè)定為黃豆質(zhì)量的0%、8%、16%、24%和32%；蔗糖添加量對(duì)醬曲品質(zhì)的影響試驗(yàn)：糙米添加量固定為16%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，制曲時(shí)間固定為60 h，蔗糖添加量設(shè)定為總質(zhì)量的0%、3%、6%、9%及12%；制曲時(shí)間對(duì)醬曲品質(zhì)的影響試驗(yàn)：糙米添加量固定為16%，蔗糖添加量固定為6%，制曲時(shí)間設(shè)定為36、48、60、72、84 h。以蛋白酶酶活、GABA含量及谷氨酸含量為指標(biāo)，判定最佳單因素條件。

1.3.6 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果確定糙米粉添加量、蔗糖添加量及制曲時(shí)間3個(gè)因素的水平編碼范圍，以蛋白酶酶活、GABA含量和谷氨酸含量為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Coded levels for independent variables

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均為3次平行，使用SPSS 26.0和Origin 9.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及顯著性分析，使用Design Expert 10設(shè)計(jì)二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，使用Illustrator 23.0.2軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)發(fā)酵基質(zhì)選擇

醬坯提供了微生物增殖及產(chǎn)酶所需的營(yíng)養(yǎng)成分，通常情況下，醬坯由黃豆與淀粉按一定比例復(fù)配而成。已有的報(bào)道證明，淀粉來(lái)源及其與黃豆的復(fù)配比例對(duì)制曲效果有較大的影響[3]。本研究選擇小麥粉為基礎(chǔ)碳源，結(jié)果表明，隨小麥粉添加量的增加，醬曲蛋白酶活性呈現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，且制曲時(shí)間表現(xiàn)出一定程度延長(zhǎng)。如m(黃豆)∶m(小麥粉)=10∶2時(shí)，制曲48 h時(shí)達(dá)到最大酶活522.86 U/g，當(dāng)m(黃豆)∶m(小麥粉)=10∶6 時(shí)，制曲60 h時(shí)達(dá)到最大酶活僅為213.91 U/g (P=0.000 01<0.01)(圖1-a)。小麥粉持續(xù)補(bǔ)充導(dǎo)致蛋白酶活性下降可能是由于基質(zhì)中碳氮源比例失衡，影響微生物的繁殖代謝過(guò)程。同時(shí)，小麥粉的顆粒細(xì)小，較大比例加入可能使醬曲表面過(guò)于緊實(shí)而不易透氣，影響米曲霉的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致蛋白酶分泌不足[20]。本研究同時(shí)跟蹤檢測(cè)了制曲過(guò)程中基質(zhì)的含水量變化，不同復(fù)配比例下，基質(zhì)含水量的變化差異較小。隨制曲時(shí)間的增加，基質(zhì)含水量因菌體利用和生物熱蒸發(fā)等原因而迅速下降，制曲至60～72 h時(shí)，醬曲水分含量均降低至25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))以下，此現(xiàn)象與劉穎等[21]制備高活性醬曲水分含量變化相似。此外，制曲后期蛋白酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能為水分含量下降影響了菌體的生命活動(dòng)所致。由于米曲霉產(chǎn)酶最適水分含量在40%～50%[22]，故綜合考慮后本研究選擇m(黃豆)∶m(小麥粉)=10∶2的坯制備基礎(chǔ)醬坯。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 糙米對(duì)醬曲中蛋白酶酶活、GABA含量及谷氨酸含量的影響

通常情況下，小麥粉是醬曲中的主要碳源，而碳氮源種類(lèi)是影響米曲霉生長(zhǎng)及富集GABA的重要因素。在本研究中，把富集GABA常用的糙米作為額外碳源，為制曲過(guò)程實(shí)現(xiàn)高GABA積累提供便利。研究結(jié)果表明，未添加糙米組醬曲酶活最高722.82 U/g，其余組酶活隨糙米添加量增加不斷降低，當(dāng)添加32%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))糙米時(shí)，制曲結(jié)束時(shí)醬曲酶活最低僅為386.45 U/g(P=0.000 1<0.01) (圖2-a)。糙米加入導(dǎo)致蛋白酶活性下降可能為糙米以粉末狀加入基質(zhì)，使醬曲表面不易透氣，抑制微生物生長(zhǎng)導(dǎo)致酶活降低。同時(shí)對(duì)GABA含量的觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，雖然未添加糙米組醬曲酶活較高，但GABA含量相對(duì)較低,為0.105 mg/g，當(dāng)添加8%、16%糙米時(shí)GABA含量差異較小，達(dá)到最大值0.146 mg/g (P<0.01)。本研究還發(fā)現(xiàn)，糙米添加量的改變對(duì)谷氨酸含量影響較小。故綜合考慮后選擇添加8%糙米為優(yōu)化試驗(yàn)中心點(diǎn)。

a-蛋白酶酶活變化;b-水分含量變化圖1 不同黃豆與小麥粉比例醬坯制曲中蛋白酶酶活及水分變化Fig.1 Protease activity and water content changes in different proportion of soybean and wheat flour

a-蛋白酶酶活變化;b-GABA、谷氨酸含量變化圖2 糙米添加量對(duì)醬曲品質(zhì)的影響Fig.2 The effect of the amount of brown rice on the quality of soybean koji

2.2.2 蔗糖對(duì)醬曲中蛋白酶酶活、GABA及谷氨酸含量的影響

傳統(tǒng)制曲通常采用淀粉為碳源，米曲霉等制曲微生物需合成淀粉酶以降解淀粉為可利用糖，一定程度上增加了菌體負(fù)荷。在醬坯中添加適量蔗糖可為微生物生長(zhǎng)提供速效碳源，方便微生物的快速增殖。研究結(jié)果顯示，醬曲酶活隨蔗糖添加量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并在添加6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖時(shí)達(dá)到最大536.18 U/g (P<0.01) (圖3-a)。對(duì)GABA含量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在添加0～12%蔗糖，GABA含量隨蔗糖增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在添加6%蔗糖時(shí)GABA含量達(dá)到最大0.151 mg/g且酶活力最高(P<0.01) (圖3-b)。添加少量蔗糖促進(jìn)米曲霉生長(zhǎng)使酶活上升，可能是增加了易代謝碳源，促進(jìn)了微生物生長(zhǎng)，而添加高比例蔗糖后導(dǎo)致滲透壓上升，不利于微生物生長(zhǎng)導(dǎo)致酶活降低。添加3%蔗糖時(shí)，出現(xiàn)酶活較低但GABA含量較高的原因可能為易代謝碳源的加入導(dǎo)致微生物過(guò)量增殖，菌體的氮代謝通路較旺盛但胞外酶分泌量減少。谷氨酸含量在添加3%蔗糖時(shí)達(dá)到最大，隨后隨蔗糖添加量的增加而不斷降低(P<0.01)。故綜合考慮后選擇添加6%蔗糖為優(yōu)化試驗(yàn)中心點(diǎn)。

a-蛋白酶酶活變化;b-GABA、谷氨酸含量變化圖3 蔗糖添加量對(duì)醬曲品質(zhì)的影響Fig.3 The effect of the amount of sucrose on the quality of soybean koji

2.2.3 制曲時(shí)間對(duì)醬曲中蛋白酶酶活、GABA含量及谷氨酸含量的影響

制曲時(shí)間長(zhǎng)短決定醬曲的品質(zhì)，通常醬曲的最大酶活出現(xiàn)在制曲48 h后[23]，同時(shí)，在最大酶活點(diǎn)后，因菌體數(shù)量增多且醬坯中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)出現(xiàn)短缺，不利于微生物生長(zhǎng)而導(dǎo)致酶活呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在本研究中，酶活隨著制曲時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在60 h達(dá)到最大酶活605.79 U/g，在36 h時(shí)最小僅為433.84 U/g (P=0.003 22<0.01) (圖4-a)。而制曲過(guò)程中醬曲的水分含量變化也與現(xiàn)有研究相似，呈現(xiàn)不斷下降趨勢(shì)[21]。此外，隨著制曲時(shí)間延長(zhǎng)，GABA含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在制曲60 h時(shí)達(dá)到最大值0.165 mg/g (P<0.01)。GABA含量呈現(xiàn)與酶活相似的變化趨勢(shì)，可能是蛋白酶降解的部分游離氨基酸參與了GABA的代謝通路[24]。此時(shí)醬曲中的GABA含量與XU等[13]豆醬成品中0.260～3.010 mg/g相比仍較低。但與CAI等[14]發(fā)現(xiàn)利用米曲霉的制曲過(guò)程可提升發(fā)酵基質(zhì)的GABA含量相吻合。此外，制曲時(shí)間對(duì)谷氨酸含量影響相對(duì)較小，由36 h的0.130 mg/g上升至48 h的0.138 mg/g后降低至0.125 mg/g。在綜合考慮GABA含量及酶活后，選擇制曲時(shí)間60 h為優(yōu)化試驗(yàn)中心點(diǎn)。

a-蛋白酶酶活變化;b-GABA、谷氨酸含量變化圖4 制曲時(shí)間對(duì)醬曲品質(zhì)的影響Fig.4 The effect of the amount of making koji time on the quality of soybean koji

2.3 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)圖2～圖4的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取糙米添加量(A)、蔗糖添加量(B)、制曲時(shí)間(C)作為3因素，以蛋白酶酶活(Y1)、GABA含量(Y2)、谷氨酸含量(Y3)為響應(yīng)值，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)Table 2 Quadratic regression orthogonal rotation combination design with experimental results

2.3.2 以蛋白酶酶活為指標(biāo)的回歸模型方差分析及交互作用影響

對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析得表3，擬合蛋白酶酶活(Y1)的二次回歸方程為：Y1=628.66-21.54A-12.96B+56.20C-12.72AB+2.05AC-13.16BC-32.71A2-67.30B2-46.57C2。表3表明該模型極顯著(P<0.01)，無(wú)失擬性因素存在(P=0.134 1>0.05)，方差分析顯示，C、A2、B2、C2對(duì)回歸方程影響較大(P<0.01)，A對(duì)回歸方程影響顯著(0.01

表3 以蛋白酶酶活為評(píng)價(jià)指標(biāo)的回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis results of regression model using protease activity as evaluation index

如圖5-a所示，隨著蔗糖添加量與糙米添加量的增加，酶活呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，通過(guò)二維等高線圖可知兩因素之間存在一定交互作用。如圖5-b所示，隨著糙米添加量與制曲時(shí)間的增加，酶活呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，通過(guò)二維等高線圖可知，兩因素之間不存在交互作用。由圖5-c可知，隨著蔗糖添加量與制曲時(shí)間的增加，酶活呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，通過(guò)二維等高線圖可知兩因素之間存在一定交互作用。綜合圖5和表3，3因素對(duì)酶活的影響力為：制曲時(shí)間>蔗糖添加量>糙米添加量。

a-蔗糖添加量與糙米添加量;b-糙米添加量與制曲時(shí)間; c-蔗糖添加量與制曲時(shí)間圖5 糙米添加量、蔗糖添加量及制曲時(shí)間交互作用對(duì) 豆醬曲蛋白酶酶活的影響Fig.5 Effects of brown rice content, sucrose content and koji-making time on protease activity of soybean koji

2.3.3 以GABA含量為指標(biāo)的回歸模型方差分析及交互作用影響

同理由表4可知，GABA含量(Y2)二次回歸方程為：Y2=-0.143+0.016A+0.016B+0.014C-0.005AB-0.004AC+0.006BC-0.005A2-0.019B2-0.014C2。由表4可知，該回歸模型極顯著(P=0.000 2<0.01)，無(wú)失擬性因素存在(P=0.053 3>0.05)，方差分析顯示，A、B、C、B2、C2對(duì)回歸方程影響十分顯著(P<0.01)，簡(jiǎn)化回歸方程為：Y2=-0.143+0.016A+0.016B+0.014C-0.019B2-0.014C2。其中A、B、C、B2、C2的相關(guān)系數(shù)和與總系數(shù)和比例R=92.60%，其他因素影響系數(shù)占7.40%，簡(jiǎn)化方程仍有較好擬合性。

表4 以GABA含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)的回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis results of regression model using GABA content as evaluation index

如圖6-a所示，隨著蔗糖添加量與糙米添加量的增加，GABA含量呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，通過(guò)二維等高線圖可知兩因素之間存在一定交互作用。如圖6-b所示，隨著糙米添加量與制曲時(shí)間的增加，GABA含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，通過(guò)二維等高線圖可知兩因素之間存在一定交互作用。如圖6-c所示，隨著蔗糖添加量與制曲時(shí)間的增加，GABA含量呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，通過(guò)二維等高線圖可知兩因素之間存在一定交互作用。綜合圖6和表4，3因素對(duì)GABA含量的影響力為蔗糖添加量>糙米添加量>制曲時(shí)間。

a-蔗糖添加量與糙米添加量；b-糙米添加量與制曲時(shí)間； c-蔗糖添加量與制曲時(shí)間圖6 糙米添加量、蔗糖添加量及制曲時(shí)間交互作用 對(duì)豆醬曲GABA含量的影響Fig.6 Effects of brown rice content, sucrose content and koji-making time on GABA content of soybean koji

2.3.4 以谷氨酸含量為指標(biāo)的回歸模型性方差分析及交互作用影響

同理由表5可知，谷氨酸含量(Y3)二次回歸方程為：Y3=0.232+0.004A-0.003B-0.007C+0.003AB+0.008AC+0.007BC+0.002A2-0.014B2+0.002C2。由表5可知，該回歸方程模型不顯著(P=0.345 5>0.05)，其中有顯著性影響誤差來(lái)源B2的相關(guān)系數(shù)總和與總系數(shù)和的比例R=回歸平方和/總平方和=49.71%，回歸模型的擬合度較差，故不用此模型預(yù)測(cè)最佳工藝點(diǎn)。

表5 以谷氨酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)的回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis results of regression model using Glutamate content as evaluation index

2.3.5 最佳工藝點(diǎn)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)蛋白酶酶活和GABA含量回歸模型分別可得出最優(yōu)組合：糙米添加量7.4%、蔗糖添加量5.9%及制曲時(shí)間66.2 h，預(yù)測(cè)酶活達(dá)最大649.86 U/g，預(yù)測(cè)GABA含量0.140 mg/g，谷氨酸含量0.226 mg/g；糙米添加量10.6%、蔗糖添加量6.3%及制曲時(shí)間63.7 h，GABA含量達(dá)最大0.159 mg/g，預(yù)測(cè)酶活542.50 U/g，谷氨酸含量0.242 mg/g。

綜合考慮后選擇糙米粉添加量9.0%、蔗糖添加量6.1%及制曲時(shí)間65 h為優(yōu)選條件，預(yù)測(cè)蛋白酶酶活622.08 U/g、GABA含量0.152 mg/g和谷氨酸含量0.233 mg/g。驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)得，蛋白酶酶活(592.13±25.01) U/g、GABA含量(0.148±0.012) mg/g及谷氨酸含量(0.241±0.010) mg/g，與回歸模型預(yù)測(cè)值基本一致。優(yōu)化后的豆醬曲與LEE等[6]使用米曲霉和芽孢桿菌混合制曲相比，與最低組蛋白酶酶活(458.5±18.0) U/g相比較高，略低于酶活最高組(627.8±17.9) U/g，證明此法制得的富含GABA醬曲有較高酶活。制曲結(jié)束時(shí)，醬曲表面菌絲生長(zhǎng)均勻，外觀呈黃綠色且未出現(xiàn)燒曲現(xiàn)象，呈現(xiàn)濃郁曲香并無(wú)不良風(fēng)味，為豆醬的制醬工藝提供良好的風(fēng)味基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)建立3種影響因素(糙米粉添加量、蔗糖添加量、制曲時(shí)間)與3個(gè)響應(yīng)值(蛋白酶酶活、GABA含量、谷氨酸含量)相互作用模型，得出添加9.0%糙米粉及6.1%蔗糖，制曲時(shí)間65 h時(shí)醬曲品質(zhì)最佳，蛋白酶酶活為(592.13±25.01) U/g、GABA含量為(0.148±0.012) mg/g、谷氨酸含量為(0.241±0.010) mg/g，與回歸模型預(yù)測(cè)值基本一致。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)出一種提供高酶活且有較高GABA含量的制曲方法，為后續(xù)開(kāi)發(fā)富含GABA豆醬提供了一定的理論參考。