齊亞南，潘樹義，郭大志

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是外科急癥之一，特別是中重型TBI，病死率高，預(yù)后差。TBI的病理生理過程包括原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷，其中繼發(fā)性腦損傷是影響預(yù)后的最重要因素，神經(jīng)炎癥和氧化損傷是繼發(fā)性腦損傷致病的最主要因素。高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)能迅速有效的改善腦組織的缺氧狀態(tài)，具有減輕腦水腫、減輕炎癥、促進(jìn)神經(jīng)再生等作用，在TBI的治療中有廣泛應(yīng)用。因此本實(shí)驗(yàn)擬使用PCI3000精確顱腦撞擊儀(深圳瑞沃德科技公司)，采用控制性皮質(zhì)撞擊(cortical impact injury,CCI)方法建立中重型TBI大鼠模型，分別給予1.5絕對(duì)大氣壓(atmosphere absolute,ATA)和2.5 ATA高壓氧處理，比較兩種不同壓力高壓氧對(duì)中重型顱腦創(chuàng)傷大鼠的神經(jīng)功能及白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-10和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康清潔級(jí)成年雄性SD大鼠[北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心，SCXK(京)2006-008]，體質(zhì)量250～300 g，共計(jì)75只分為5組。①TBI組(n=15)：建立TBI模型成功且術(shù)后第1天(D1)改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified neurological severity score，mNSS)7～18分；②假手術(shù)組(sham組，n=15)：僅將顱骨開窗，不予頭部打擊；③1.5 ATA組(n=15)：在TBI組的基礎(chǔ)上給予1.5 ATA治療；④2.5 ATA組(n=15)：在TBI組的基礎(chǔ)上給予2.5 ATA治療；(5)空白對(duì)照組(n=15)：不給予處理，正常飼養(yǎng)。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明sham組與空白對(duì)照組各觀察指標(biāo)無(wú)顯著性差異。

1.2 TBI模型建立 利用PCI3000精確顱腦撞擊儀參照CCI方法建立模型[1]。術(shù)前大鼠均禁食禁水6～8 h。大鼠用小動(dòng)物麻醉機(jī)(異氟烷)麻醉后，俯臥位將大鼠頭顱固定于腦立體定向儀上，調(diào)節(jié)儀器確保頭顱保持水平。備皮消毒后,沿顱頂正中剪開頭皮，分離骨膜，暴露顱骨，用腦立體定位儀確定打擊位置(前鹵后3.5 mm，中線偏左3 mm)，鉆約5 mm的骨窗，保持硬腦膜完整。打擊深度6 mm，打擊速度4 m/s，停留時(shí)間500 ms，撞擊桿撞擊大鼠硬腦膜。完成打擊后，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，碘伏消毒傷口。

1.3 高壓氧治療方案 大鼠顱腦創(chuàng)傷模型成功后，高壓氧組大鼠分別在術(shù)后D1進(jìn)行1.5 ATA和2.5 ATA高壓氧治療，1/d(每次加壓5 min，穩(wěn)壓吸氧60 min，減壓5 min)，連續(xù)7 d。

1.4 模型評(píng)價(jià)方法 在術(shù)后D1、第3天(D3)、第7天(D7)進(jìn)行mNSS評(píng)分[2]。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：1～6分為輕型顱腦損傷；7～12分為中型顱腦損傷；13～18分為重型顱腦損傷。術(shù)后D1選擇mNSS評(píng)分為7～18分大鼠為中重型TBI模型。

1.5 血清 IL-1β、IL-10、SOD的含量測(cè)定 分別在術(shù)后D1、D3、D7采集各組大鼠的尾靜脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)血清IL-1β、IL-10、SOD的含量。

1.6 腦組織 IL-1β、IL-10、SOD的含量測(cè)定 分別在術(shù)后D1、D3、D7處死各組大鼠，提取損傷側(cè)海馬處的腦組織，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IL-1β、IL-10和SOD。

2 結(jié)果

2.1 不同壓力高壓氧對(duì)大鼠mNSS評(píng)分的影響 在D1，TBI組、1.5 ATA組和2.5 ATA組mNSS評(píng)分均高于sham組(P<0.05)，但3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在D3和D7，1.5 ATA組和2.5 ATA組mNSS評(píng)分均低于TBI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，1.5 ATA組和2.5 ATA組mNSS評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，圖1。

圖1 各組大鼠不同時(shí)間神經(jīng)功能缺損評(píng)分統(tǒng)計(jì)(aP<0.05)

2.2 不同壓力高壓氧對(duì)血清IL-1β、IL-10和SOD含量的影響 在D1，TBI組、1.5 ATA組和2.5 ATA組血清IL-1β含量較sham組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在D3和D7，1.5 ATA組和2.5 ATA組IL-1β含量較TBI組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但1.5 ATA與2.5 ATA組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，圖2A。在D1，TBI組、1.5 ATA組和2.5 ATA組血清IL-10含量較sham組均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在D3和D7，1.5 ATA組和2.5 ATA組IL-10含量較TBI組明顯升高(P<0.05)，1.5 ATA組IL-10含量比2.5 ATA組升高更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，圖2B。在D1和D3，TBI組、1.5 ATA組和2.5 ATA組血清SOD含量與sham組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在D7，1.5 ATA組血清SOD含量較TBI組明顯升高，1.5 ATA組SOD含量比2.5 ATA組升高更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，圖2C。

圖2 血清IL-1β、IL-10和SOD含量(*P<0.05；**P<0.01)

2.3 不同壓力高壓氧對(duì)腦組織內(nèi)IL-1β、IL-10和SOD含量的影響 在D1，TBI組、1.5 ATA組和2.5 ATA組腦組織IL-1β含量較sham組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在D3和D7，1.5 ATA組和2.5 ATA組IL-1β含量較TBI組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但1.5 ATA與2.5 ATA組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，圖3A。在D1，TBI組、1.5 ATA組和2.5 ATA組IL-10含量較sham組均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在D3和D7，1.5 ATA組和2.5 ATA組IL-10含量較TBI組明顯升高，1.5 ATA組IL-10含量比2.5 ATA組升高更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，圖3B。在D1和D3，TBI組、1.5 ATA組和2.5 ATA組SOD含量較sham組無(wú)明顯區(qū)別(P>0.05)；在D7，1.5 ATA組腦組織SOD含量較TBI組明顯升高，1.5 ATA組SOD含量比2.5 ATA組升高更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，圖3C。

圖3 腦組織內(nèi)IL-1β、IL-10、SOD含量(*P<0.05；**P<0.01)

3 討論

3.1 炎癥反應(yīng)在創(chuàng)傷性腦損傷發(fā)生發(fā)展中的作用和變化規(guī)律 大量臨床和基礎(chǔ)研究表明，炎癥反應(yīng)和氧化損傷在創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中起到關(guān)鍵作用[3-4]。IL-1β是一種促炎因子，能夠刺激粘附分子的表達(dá)，增加白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，使白細(xì)胞聚集在缺血灶周圍，從而加重繼發(fā)性腦損傷及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，此外，IL-1β又能激活巨噬細(xì)胞和星形細(xì)胞，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[5]。Ni等[6]證實(shí)，TBI大鼠與sham組、假手術(shù)組相比較，數(shù)小時(shí)內(nèi)腦內(nèi)IL-1β的含量明顯升高。給予骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療后，TBI組大鼠的IL-1β含量及mNSS評(píng)分均降低。本研究發(fā)現(xiàn)，中重型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血清和腦組織IL-1β的含量顯著升高，早期高壓氧治療可顯著降低IL-1β的含量，提示高壓氧可降低促炎因子水平，減輕神經(jīng)炎癥損傷，但高壓力與低壓力高壓氧治療效果并無(wú)顯著性差異。

生物體內(nèi)往往存在“自我平衡”機(jī)制，有促炎因子必有抗炎因子。IL-10便是體內(nèi)抗炎因子的代表，主要來源于單核巨噬細(xì)胞和T輔助細(xì)胞，通過抑制多種炎癥因子的活化和炎癥因子的產(chǎn)生而降低炎癥反應(yīng)[7]。Yuan等[8]研究發(fā)現(xiàn)，既往收治的顱腦創(chuàng)傷患者在入院48 h內(nèi)IL-1β、IL-10的含量均明顯升高，且有研究發(fā)現(xiàn)在大鼠實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證得出，顱腦創(chuàng)傷組大鼠IL-1β、IL-10含量均高于sham組。這提示炎癥反應(yīng)和抗炎過程是一對(duì)“雙生子”，始終貫穿于TBI的發(fā)生發(fā)展過程中。本研究發(fā)現(xiàn)，中重型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血清和腦組織IL-10的含量顯著升高，早期高壓氧治療可進(jìn)一步促進(jìn)IL-10含量升高，提示高壓氧不但具有抗炎作用，還可以增加機(jī)體自身抵抗炎癥損傷能力。此外，本研究發(fā)現(xiàn)低壓力高壓氧的“抗炎”效果更好。

血清SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，是清除自由基的首要物質(zhì)，能夠催化超氧陰離子等自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，維持機(jī)體內(nèi)氧自由基的動(dòng)態(tài)平衡[9]。SOD可提高機(jī)體抗氧化水平，降低氧化物的含量,減輕腦損傷周圍腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng),促進(jìn)腦損傷的恢復(fù)。Chen等[10]研究顯示，TBI后6 h氧化應(yīng)激即可顯著增加，大鼠血清中SOD含量先下降、后升高，表明氧化應(yīng)激反應(yīng)是TBI腦損傷的重要機(jī)制之一。本研究進(jìn)一步探討高低兩種壓力高壓氧治療對(duì)氧化損傷的作用效果發(fā)現(xiàn)，早期高壓氧治療可顯著增加中重型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血清和腦組織中SOD含量升高，且1.5 ATA組大鼠SOD含量比2.5 ATA組升高更顯著，提示早期高壓氧治療不僅不會(huì)增加氧化損傷，反而具有增加機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力，且低壓力高壓氧效果更優(yōu)。

3.2 高壓氧壓力在神經(jīng)損傷中的作用 大量研究表明高壓氧對(duì)腦損傷具有積極的治療作用及效果[11]。但是，尚不清楚哪種高壓氧治療壓力更有利于降低神經(jīng)細(xì)胞的炎性反應(yīng)，更有利于促進(jìn)腦損傷的恢復(fù)。Cui等[12]對(duì)現(xiàn)有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行Meta分析發(fā)現(xiàn)，給予腦損傷大鼠3.0 ATA高壓氧治療與2.0 ATA高壓氧治療，均可減輕腦水腫情況，但并無(wú)明顯差別。研究發(fā)現(xiàn)，給予腦損傷大鼠2.5 ATA、3.0 ATA高壓氧治療后，梗塞面積及血流均明顯改善[13-14]。上述研究提示，高壓力的高壓氧對(duì)減輕腦水腫、改善損傷區(qū)域血供和氧供效果更好。此外，Harch等[15]發(fā)現(xiàn)給予腦損傷大鼠1.5 ATA高壓氧治療后，大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中學(xué)習(xí)成績(jī)顯著提高。Kusuda等[16]研究發(fā)現(xiàn)，給予帕金森病模型大鼠1.3 ATA高壓氧治療后，高壓氧組大鼠在旋轉(zhuǎn)木馬和平衡木試驗(yàn)中評(píng)分均優(yōu)于對(duì)照組。以上文獻(xiàn)報(bào)道說明，低壓力的高壓氧治療在促進(jìn)神經(jīng)損傷方面也有著一定的療效。因此，未來有必要進(jìn)一步研究高壓氧壓力在治療不同類型神經(jīng)損傷中的作用和機(jī)制。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，早期高低不同壓力高壓氧治療均可促進(jìn)中重型創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的神經(jīng)損傷恢復(fù)，減輕神經(jīng)炎癥和氧化損傷，“低壓力”高壓氧的抗炎和抗氧化的能力優(yōu)于“高壓力”高壓氧，從經(jīng)濟(jì)性和安全性角度考慮，低壓力高壓氧在中重型創(chuàng)傷性腦損傷的治療中更值得臨床推廣。但是，本研究尚存在以下不足：(1)本實(shí)驗(yàn)采用嚙齒類動(dòng)物大鼠作為研究對(duì)象，其自身神經(jīng)損傷修復(fù)能力比靈長(zhǎng)類(人)強(qiáng)，減少了不同處理組效果的差異性；(2)炎癥反應(yīng)往往發(fā)生于創(chuàng)傷性腦損傷的數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)內(nèi)，本研究是比較不同壓力高壓氧治療后1 d、3 d和7 d的IL-1β、IL-10、SOD表達(dá)情況，其可能不是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵作用時(shí)間。將來需要更進(jìn)一步的動(dòng)物和臨床研究。