郝紅英，劉麗娟，畢淑嫻

(省部共建煤炭高效利用與綠色化工國家重點實驗室，化學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，化學(xué)化工學(xué)院，寧夏大學(xué)，寧夏 銀川 750021)

酶的固定化的正式研究始于上世紀(jì)六十年代，是將酶限制在一定空間范圍內(nèi)，使其仍能起催化作用并可以重復(fù)回收利用的一種技術(shù)。固定化酶相較于自由酶，有著可重復(fù)利用的特點，有益于降低生產(chǎn)成本，且經(jīng)固定化的生物酶各方面的穩(wěn)定性也有所增加。辣根過氧化物酶由于具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性和耐酸堿性，常被用于工業(yè)含酚廢水降解的研究[1]。

大部分的固定化方法都需要有一個合適的載體作為支撐材料，載體材料對于酶的催化性能也有一定的影響，固定化酶的載體材料選擇通常具有以下要求：(1)材料本身無反應(yīng)活性；(2)對酶的活性無影響；(3)具有良好的穩(wěn)定性；(4)載酶量大；(5)價格實惠，材料易得；(6)耐酸堿腐蝕等。目前常研究的載體材料主要有無機材料、天然高分子材料、復(fù)合材料等[2]。

選用的油茶殼基活性炭的原材料油茶殼來源于我國南方廣泛種植的榨油原料油茶。油茶殼的本質(zhì)生物質(zhì)，其組成以纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等成分為主，其可經(jīng)炭化造孔等方式制備成為油茶殼基活性炭，具有較大的比表面積和豐富的孔道結(jié)構(gòu)是油茶殼基活性炭的一大優(yōu)點，對其改性制成油茶殼基活性炭磁性復(fù)合材料，可增強其固酶性能。油茶作為一種重要的油料作物，種植廣泛，產(chǎn)量大，榨油剩余的大量油茶殼若能對其加以利用，可達(dá)到變廢為寶的效果。并且將油茶殼基活性炭作為制備載體材料的原料，其良好的比表面積及其豐富的孔道結(jié)構(gòu)和表面含有的一定數(shù)量的含氧官能團賦予了其優(yōu)異的吸附性能，可以應(yīng)用于催化劑載體的研究。

本文油茶殼基活性炭為原料的磁性復(fù)合材料，上磁性之后的載體材料固載酶之后從反應(yīng)體系中分離出來更加高效，可提高材料重復(fù)使用率。

含酚廢水是污染水體的一大主要污染源，如果可以通過實驗室研究一種良好的固載酶對其中的酚類化合物進(jìn)行降解處理，對固定化技術(shù)在工業(yè)污水處理上具有一定的指導(dǎo)意義，有利于綠色化工技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步。

1 實 驗

1.1 材 料

油茶殼基活性炭、乙酸、殼聚糖、戊二醛、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉。油茶殼基活性炭由湖南省林業(yè)科學(xué)院自制。實驗用水為娃哈哈純凈水。

1.2 復(fù)合材料的制備

1.2.1 原料預(yù)處理

取適量1 mol/L的鹽酸與油茶殼基活性炭混合均勻后，超聲20 min，磁力攪拌2 h后水洗離心至中性，在80 ℃下烘干10 h。

1.2.2 AC-CTS的制備

將1.5%殼聚糖(CTS)和1.0 g油茶殼基活性炭(AC)按一定比例加入50 mL的小燒杯中，超聲20 min后，磁力攪拌10 h后用純凈水反復(fù)離心洗滌多次至pH=7，在80 ℃下烘干10 h，制得AC-CTS[3]。

1.2.3 Fe3O4磁性粒子的制備

取3.28 g FeCl3·6H2O和2.86 g FeSO4·7H2O加入100 mL去離子水中，在油浴鍋中以60 ℃為條件機械攪拌，緩慢滴加0.5 mol/L的NaOH至pH=9，超聲20 min，將制得的Fe3O4磁性粒子用純凈水離心水洗至中性，在60 ℃真空烘箱中干燥10 h。

1.2.4 AC-CTS-Fe3O4的制備

將Fe3O4磁性粒子和1.0 g AC-CTS復(fù)合材料按一定比例加入小燒杯中，并分散于pH=7的磷酸鹽緩沖液中，超聲20 min，攪拌10 h后用蒸餾水反復(fù)離心洗滌多次，80 ℃烘干10 h，制得AC-CTS- Fe3O4。

1.2.5 AC-CTS-Fe3O4-GA的制備

將4%戊二醛(GA)和1.0 g AC-CTS- Fe3O4復(fù)合材料按一定比例加入小燒杯中，超聲20 min，攪拌交聯(lián)10 h后用蒸餾水反復(fù)離心洗滌多次，80 ℃烘干12 h，制得AC-CTS- Fe3O4-GA復(fù)合材料。

1.3 固定化辣根過氧化物酶的研究

1.3.1 制備交聯(lián)載體

取用適量4%的戊二醛交聯(lián)后的油茶殼基活性炭磁性復(fù)合材料進(jìn)行HRP的固定，步驟如下：(1)稱取載體材料0.015 g/份于10 mL離心管中，用pH=7的緩沖液離心洗滌載體材料2次，備用；(2)將緩沖溶液洗過的載體材料分散于990 μL相應(yīng)pH值的磷酸鹽緩沖液中，將離心管冷藏備用。(3)在離心管中加入60 μL 1 mg/mL游離酶液，將離心管置于搖床中低溫下振蕩4 h，離心取出上清液，將固載酶用pH=7的緩沖液洗滌2次后，冷藏待用。

1.3.2 HRP活性測定

HRP濃度可以采用沃辛通法測定。HRP的底物為苯酚溶液，氧化劑是H2O2，顯色劑是4-APP(4-氨基安替比林)，用沃辛通比色法測定產(chǎn)物在510 nm波長處的吸光度值變化率KA510。底物苯酚充足條件下，酶濃度與吸光度值變化率呈一次線性關(guān)系。本實驗采用沃辛通(Worthington)法測定辣根過氧化物酶的酶活力，將一個過氧化物酶單位(1U)定義為在規(guī)定底物濃度下每分鐘分解1 μmol過氧化氫時所需的酶量[4]。

計算公式如下：

2 結(jié)果與討論

2.1 AC-CTS-Fe3O4復(fù)合材料的表征

2.1.1 AC-CTS- Fe3O4復(fù)合材料的紅外譜圖

從圖1 AC-CTS(a)、AC-CTS- Fe3O4復(fù)合材料(b)和AC-CTS-Fe3O4-GA載體材料(c)的紅外譜圖可得以下信息：(1)油茶殼基活性炭中的O-H鍵伸縮振動吸收峰和殼聚糖中的N-H伸縮振動吸收峰出現(xiàn)在3412 cm-1處；(2)C-H鍵的伸縮振動出現(xiàn)在3000 cm-1處；(3)C=O和C=C的伸縮振動峰出現(xiàn)在在1737 cm-1和1598 cm-1處；(3)通過對比a與b的紅外譜圖，在585 cm-1處是上磁性后Fe-O伸縮振動吸收峰[5]；(4)對比b和c的紅外譜圖，在1737 cm-1處出現(xiàn)了吸收峰強度增大的情況，這是因為殼聚糖的NH2與戊二醛的CHO發(fā)生Schiff反應(yīng)而生成Schiff鍵(C=N)形成的吸收峰和未參與反應(yīng)的戊二醛殘余的C=O伸縮振動引起的。

圖1 AC-CTS(a)、AC-CTS-Fe3O4(b)和

2.1.2 AC-CTS-Fe3O4復(fù)合材料的掃描電鏡圖

圖2 油茶殼基活性炭(a～b)和AC-CTS-Fe3O4(c～d)SEM圖

圖2為油茶殼基活性炭(a～b)和AC-CTS-Fe3O4(c～d)的掃描電鏡圖。從圖2a、b和圖2c、d的對比可知，在50.0 μm下觀察到油茶殼基活性炭表面為無序的凹凸不平溝壑狀結(jié)構(gòu)組成，而在500 nm下觀察到活性炭表面均由菜花狀的小顆粒堆積而成；而制備而成的油茶殼基活性炭磁性復(fù)合材料表面有許多微小顆粒附著在其表面，是四氧化三鐵磁性微粒與AC-CTS結(jié)合形成，且有許多空隙，有利于固載酶。

2.1.3 AC-CTS- Fe3O4復(fù)合材料的光電子能譜圖

圖3是AC-CTS-Fe3O4(a)、AC-CTS-Fe3O4-GA(b)的光電子能譜圖。從圖3a和圖3b對比可見，圖3b中N1s(400 eV)的特征吸收峰的峰強度明顯減弱，說明戊二醛成功和AC-CTS-Fe3O4交聯(lián)。

表1 表面元素組成

2.1.4 AC-CTS- Fe3O4復(fù)合材料的XRD圖

圖4為Fe3O4、AC-CTS-Fe3O4復(fù)合材料的X-射線衍射譜圖的對比圖，對比a、b之后，可以看出來，F(xiàn)e3O4和AC-CTS-Fe3O4復(fù)合材料的特征衍射峰基本上完全一致，說明制備而得的載體材料具有磁性，經(jīng)與相關(guān)文獻(xiàn)的Fe3O4粒子的XRD圖對比，在2θ=30.1°、32.3°、43.2°、54.1°、57.5°、62.6°及74.3°均為Fe3O4的特征衍射峰[5]，制備出來的Fe3O4、AC-CTS-Fe3O4復(fù)合材料均存在相同的特征衍射峰，結(jié)果表明所制備的微粒是Fe3O4粒子，且表明AC-CTS-Fe3O4復(fù)合材料具有相應(yīng)的磁性，成功制備出油茶殼基活性炭磁性復(fù)合材料。

圖4 Fe3O4(a)、AC-CTS-Fe3O4(b)XRD圖

2.2 固定化HRP的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 固載酶的熱穩(wěn)定性

通常溫度會增大酶促反應(yīng)速率，酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在高溫下會發(fā)生變性，酶活性將引起降低。由圖5可知，自由酶和固定化辣根過氧化物酶的最適反應(yīng)溫度均為50 ℃。相比于自由酶，固定化辣根過氧化物酶在20～60 ℃范圍內(nèi)均具有較好的催化活性，因此，固定化酶可以增加酶的熱穩(wěn)定性，具有良好的應(yīng)用前景。

圖5 反應(yīng)溫度對自由酶、固定化辣根過氧化物酶

2.2.2 固載酶的pH穩(wěn)定性

酶本質(zhì)是蛋白質(zhì)，變化的pH會影響酶分子活性部位中催化基團與結(jié)合基團的解離狀態(tài)，同時也影響著底物的解離狀態(tài)，pH也會對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。由圖6可見，自由酶在pH=7.0時具有較高的催化活性；固定化辣根過氧化物酶的在pH為8.0催化活性高，且其在pH>7的條件下比自由酶活性大，但處于酸性條件時催化活性較低，可能是由于酸性反應(yīng)體系影響了底物與酶蛋白的結(jié)合，降低了催化活性。

圖6 pH對自由酶、固定化辣根過氧化物酶酶活力的影響

2.2.3 固載酶的操作穩(wěn)定性

固定化酶的其中一個重要優(yōu)點是利于回收和重復(fù)利用，通過測定固定化辣根過氧化物酶的重復(fù)使用時的吸光度值，由圖7可知，固定化辣根過氧化物酶在重復(fù)使用7次后測得的吸光度值計算得到的相對活性僅為16.79%，原因在于洗滌過程中會有部分結(jié)合的酶分子脫落或者是載體材料的損失，且未洗滌干凈的染料物質(zhì)在固定化酶表面堆積，阻礙了酶與底物的結(jié)合，降低了催化活性。

圖7 固定化辣根過氧化物酶的操作穩(wěn)定性

2.2.4 固載酶的儲存穩(wěn)定性

如圖8所示，在4 ℃的環(huán)境下，固定化辣根過氧化物酶隨著儲存時間的延長，相對酶活有所下降，在儲存15天后，相對酶活剩余70%。

圖8 固定化辣根過氧化物酶的儲存穩(wěn)定性

3 結(jié) 論

油茶殼磁性復(fù)合材料固載酶最適pH=8.0，在堿性反應(yīng)體系中，固載酶具有更好的催化活性，有益于固載酶在堿性反應(yīng)體系中的應(yīng)用，而且適應(yīng)pH范圍更廣泛。自由酶和固載酶的最適溫度均為50 ℃，不過相較于自由酶，固載酶在20～60 ℃的溫度范圍內(nèi)，催化活性相對來說更穩(wěn)定一些，因此，固載酶較之于自由酶具有良好的熱穩(wěn)定性。油茶殼磁性復(fù)合材料固載酶儲存15天后相對活性剩余70%。與自由酶相比，固定化酶具有可回收再利用的優(yōu)點。油茶殼基活性炭磁性復(fù)合材料固載酶在重復(fù)使用7次后還有16.79%的活性。