楊婷婷 高謙

結(jié)核病耐藥監(jiān)測可以了解患者中結(jié)核病耐藥的程度、范圍，揭示耐藥變化趨勢和耐藥產(chǎn)生的影響因素。結(jié)核病傳播監(jiān)測則可以分析結(jié)核病近期傳播的動態(tài)變化，揭示傳播控制重點(diǎn)地區(qū)和人群，鑒定結(jié)核病的暴發(fā)事件，并對特定結(jié)核分枝桿菌流行菌株進(jìn)行傳播溯源等。結(jié)核病耐藥與傳播監(jiān)測將為制定精準(zhǔn)防控策略和合理分配衛(wèi)生資源提供決策依據(jù)。筆者就構(gòu)建基于結(jié)核分枝桿菌全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)數(shù)據(jù)的結(jié)核病耐藥及傳播監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)提出以下拙見。

一、我國結(jié)核病耐藥及傳播監(jiān)測現(xiàn)狀

我國現(xiàn)行結(jié)核病監(jiān)測體系包含結(jié)核病疫情監(jiān)測和耐藥監(jiān)測。結(jié)核病疫情監(jiān)測主要是通過傳染病直報和專報系統(tǒng)，實(shí)時掌握全國結(jié)核病疑似患者和活動性結(jié)核病患者的情況，包括流動人口和結(jié)核分枝桿菌與HIV雙重感染者。通過結(jié)核病患者個案信息網(wǎng)絡(luò)電子化管理，現(xiàn)有監(jiān)測體系能夠?qū)崟r了解并評價各地患者發(fā)現(xiàn)、治療管理和規(guī)劃活動的進(jìn)展[1-2]。2007—2008年，我國采用分層整群抽樣的方法，隨機(jī)抽取全國31個省份(中國香港、澳門和臺灣除外)共70個縣(區(qū))，首次組織了全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查工作[3]；從2015年開始，國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室利用31個省的72個區(qū)縣級結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)連續(xù)進(jìn)行全國性結(jié)核病耐藥性監(jiān)測工作，并計(jì)劃在此基礎(chǔ)上建立覆蓋288個監(jiān)測點(diǎn)、區(qū)、縣的結(jié)核病耐藥監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)[4]。

但是，我國目前的耐藥監(jiān)測體系在樣本量和檢測方法上仍存在一些問題。耐藥監(jiān)測主要基于抽樣樣本，目前每年約4000多株菌株，很難代表全國耐藥現(xiàn)狀。另外，采用表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“表型藥敏試驗(yàn)”)檢測方法，存在樣本轉(zhuǎn)運(yùn)困難、測試時間長、生物安全要求高、工作量大、不同實(shí)驗(yàn)室之間質(zhì)量控制困難等問題[5]。

我國目前還幾乎沒有開展結(jié)核病傳播監(jiān)測工作，只有少部分地區(qū)利用數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列(variable number of tandem repeats，VNTR)、IS6110和間隔區(qū)寡核苷酸分型(spacer oligonucleo-tide typing，Spoligotyping)等基因分型技術(shù)對收集的少量菌株進(jìn)行分析。筆者在全國的幾個研究現(xiàn)場開展了連續(xù)多年的基于VNTR分型的流行病學(xué)研究[6]，近年來也利用結(jié)核分枝桿菌WGS數(shù)據(jù)分析了這些現(xiàn)場結(jié)核病的傳播規(guī)律[7-8]。但這些分子流行病學(xué)方法的應(yīng)用目前僅停留在研究層面，并沒有真正發(fā)揮監(jiān)測作用。

二、基于WGS數(shù)據(jù)的結(jié)核病監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)優(yōu)勢及國外現(xiàn)狀

結(jié)核分枝桿菌WGS在結(jié)核病耐藥和傳播監(jiān)測方面具有很大的優(yōu)勢?；赪GS預(yù)測的分子藥敏與表型藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果相比，更加快速、全面、簡便和穩(wěn)定[9-10]。盡管目前分子藥敏結(jié)果與表型藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果還不完全一致(特別是對一些二線抗結(jié)核藥物)[11-12]，但作為耐藥監(jiān)測，只要采用相同的方法是可以反映耐藥變化趨勢的；同時，耐藥監(jiān)測對檢測結(jié)果的反饋時間要求比臨床診斷寬松，可以集中樣本統(tǒng)一送樣測序以降低成本，其費(fèi)用低于表型藥敏試驗(yàn)檢測。

基于WGS的基因型分析比傳統(tǒng)基因型分型技術(shù)(IS6110-RFLP、Spoligotyping和MIRU-VNTR等)具有更高分辨率，能夠更準(zhǔn)確地追蹤特定菌株的傳播和鑒定暴發(fā)事件[13]，為流行病學(xué)調(diào)查提供更可靠的線索[14]；WGS數(shù)據(jù)與患者流行病學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合可進(jìn)一步分析傳播的危險因素等(如傳播的高危場所及人群)[8]；長期監(jiān)測代表一個地區(qū)結(jié)核病近期傳播的成簇率動態(tài)變化，可以反映該地區(qū)結(jié)核病傳播控制的水平，同時可以用于評估控制策略的效果。此外，隨著測序數(shù)據(jù)的積累，可以在全省甚至全國范圍內(nèi)監(jiān)測伴隨人口流動的結(jié)核分枝桿菌的傳播和溯源，分析流動人口是在原籍感染還是到城市后感染發(fā)病，這對流動人口結(jié)核病防控政策的制定至關(guān)重要。

目前，英國、美國，以及歐洲一些國家已將WGS應(yīng)用于結(jié)核病耐藥和傳播的監(jiān)測，并取得了初步成果。英國在2017年率先宣布對英格蘭(西歐結(jié)核病發(fā)病率最高的地區(qū)之一)的所有結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行WGS，其結(jié)果用于結(jié)核病診斷、耐藥性檢測和菌株分型[15]。美國從2012年開始逐步推進(jìn)使用WGS替代VNTR鑒定傳播或暴發(fā)，并計(jì)劃在2021年全部使用WGS進(jìn)行成簇菌株鑒定[16]。自2015年以來，歐洲疾病預(yù)防控制中心(European Centre for Disease Prevention and Control，ECDC)一直支持將WGS應(yīng)用于公共衛(wèi)生預(yù)防的多試點(diǎn)研究和項(xiàng)目[17]。WGS的應(yīng)用提高了英國的耐藥檢測速度，并提供了對結(jié)核病傳播的準(zhǔn)確判斷以支持相關(guān)部門對成簇病例的調(diào)查[18]。EUSeqMyTB聯(lián)盟[19]進(jìn)行的一項(xiàng)分子流行病學(xué)研究表明，基于WGS的傳播監(jiān)測可以有效地顯示歐盟(European Union，EU)或歐洲經(jīng)濟(jì)區(qū)(European Economic Area，EEA)國家的國內(nèi)和跨境耐多藥/利福平耐藥結(jié)核病(MDR/RR-TB)傳播情況[20]。隨著WGS的成本不斷下降，預(yù)計(jì)將有更多的國家把其納入結(jié)核病監(jiān)測規(guī)劃。

三、SAM-TB平臺的建立解決了測序數(shù)據(jù)分析瓶頸

對WGS產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和解釋是目前該方法應(yīng)用的主要瓶頸之一[21]。WGS的常規(guī)分析流程及其產(chǎn)生數(shù)據(jù)的管理需要專門的生物信息學(xué)團(tuán)隊(duì)和高性能的服務(wù)器，而目前國內(nèi)大多數(shù)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室尚不具備。同時，WGS數(shù)據(jù)分析目前仍缺乏一致的、國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)流程，不同的分析流程輸出的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)數(shù)量和類型存在差異，對分析結(jié)果進(jìn)行交叉比較和驗(yàn)證存在困難[22]。不同分析流程得到的結(jié)果不適合直接整合用于鑒定基因組簇(傳播或暴發(fā)事件)[23]。因此，目前雖然已有多種分析工具可以進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌耐藥預(yù)測和傳播鑒定，但不同軟件得到的結(jié)果難以直接整合。

為克服上述瓶頸，筆者與深圳市慢性病防治中心合作，建立了一個界面友好、操作簡單、功能豐富的中英文結(jié)核分枝桿菌WGS分析平臺——SAM-TB (http://samtb.szmbzx.com)。該平臺基于Illumina測序獲得的paired-end序列，對結(jié)核分枝桿菌樣本進(jìn)行全基因組變異(包括SNP和indel)分析和耐藥突變鑒定，可以準(zhǔn)確預(yù)測菌株對17種抗結(jié)核藥品(異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、乙硫異煙胺、氧氟沙星、莫西沙星、鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素、對氨基水楊酸、環(huán)絲氨酸、利奈唑胺、氯法齊明、貝達(dá)喹啉和德拉馬尼)的耐藥性以及對4種一線抗結(jié)核藥品的敏感性[24]；通過重建系統(tǒng)發(fā)育樹和計(jì)算菌株間SNP距離分析菌株之間的遺傳關(guān)系，鑒定代表近期傳播的簇菌株；還可以鑒定非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)不同菌種，檢測結(jié)核分枝桿菌和NTM混合樣本。同時，該平臺支持樣本數(shù)據(jù)的批量上傳、批量分析和分析結(jié)果的批量導(dǎo)出，方便國內(nèi)外同道的使用。

四、建立基于WGS的結(jié)核病耐藥和傳播監(jiān)測數(shù)據(jù)庫

目前，在我國建立基于結(jié)核分枝桿菌WGS的結(jié)核病耐藥和傳播監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)的條件已經(jīng)成熟。首先，按照中國疾病預(yù)防控制中心要求，區(qū)縣級結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室都具備開展痰培養(yǎng)的能力，痰培養(yǎng)陽性菌株數(shù)量將越來越多。其次，國內(nèi)相關(guān)企業(yè)的測序能力較強(qiáng)，測序方便、簡單，只需將培養(yǎng)陽性菌株滅活后送往公司，公司提供菌株DNA提取、建庫、測序服務(wù)，總費(fèi)用在350元左右，并且價格還將下降。第三，SAM-TB數(shù)據(jù)分析平臺的建立，使測序數(shù)據(jù)的分析統(tǒng)一、簡便。因此，筆者建議應(yīng)該盡快建立結(jié)核分枝桿菌臨床菌株WGS數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫中包括結(jié)核分枝桿菌測序數(shù)據(jù)和與菌株對應(yīng)的來自國家結(jié)核病專報系統(tǒng)的患者基本信息。同時，數(shù)據(jù)庫具備數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及圖形化展示功能，可以實(shí)時顯示菌株對所有抗結(jié)核藥物的耐藥水平、變化趨勢，以及結(jié)核分枝桿菌近期傳播患者的分布和傳播的熱點(diǎn)區(qū)域，實(shí)現(xiàn)對結(jié)核病耐藥和傳播的監(jiān)測?，F(xiàn)階段可以先建立省、市級的監(jiān)測數(shù)據(jù)庫，監(jiān)測本省、市內(nèi)結(jié)核病的耐藥與傳播。由于各省、市采用統(tǒng)一的數(shù)據(jù)來源(結(jié)核病專報網(wǎng)數(shù)據(jù))和測序數(shù)據(jù)分析平臺，待時機(jī)成熟即可較為容易實(shí)現(xiàn)全國數(shù)據(jù)共享，建成全國結(jié)核病耐藥和傳播監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)。

五、因省制宜，逐步推進(jìn)培陽菌株測序，發(fā)揮WGS監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)優(yōu)勢

結(jié)核病耐藥和傳播監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)是一個逐步建立的過程，數(shù)據(jù)積累越多，其作用就越大，但必須現(xiàn)在開始起步。考慮到各省、市經(jīng)濟(jì)水平的差異，筆者建議目前可以先將醫(yī)療機(jī)構(gòu)培養(yǎng)陽性的菌株滅活后送省級機(jī)構(gòu)統(tǒng)一保管(比運(yùn)送和保存活菌簡單、方便、安全)，根據(jù)經(jīng)費(fèi)狀況將部分或全部滅活菌株交測序企業(yè)，由其負(fù)責(zé)DNA提取、建庫、上機(jī)測序，最后提供質(zhì)量可靠的測序數(shù)據(jù)。

另外，目前很多單位都在建立菌株樣本庫，有些單位也已經(jīng)保留了很多菌株樣本。由于活菌標(biāo)本的保存、運(yùn)送對生物安全的要求高，還需要大量的-80 ℃冰箱。因此，建議除非有明確的目的和完善的臨床研究設(shè)計(jì)方案，才有必要和價值建立樣本庫。否則，筆者建議將所有菌株測序，建立數(shù)字菌株庫，這樣完全能夠滿足結(jié)核病耐藥和傳播監(jiān)測及常規(guī)的研究需要。如暫時沒有經(jīng)費(fèi)測序，則建議保留滅活的菌株，待有條件再行測序。

六、結(jié)語

隨著我國結(jié)核病患者的痰培養(yǎng)的比例提高、WGS的成本快速下降，以及SAM-TB測序數(shù)據(jù)分析平臺的建立，在我國建立基于WGS的結(jié)核病耐藥和傳播監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)成為可能。以各省為單位逐步推進(jìn)結(jié)核病耐藥和傳播監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)的建設(shè)，實(shí)現(xiàn)實(shí)時監(jiān)測耐藥結(jié)核病的變化趨勢、追蹤結(jié)核病的傳播與暴發(fā)，以提高我國結(jié)核病控制水平，刻不容緩。