姚蓉 陸宇

反復(fù)不規(guī)范、不合理使用抗結(jié)核藥物及結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)耐藥性的產(chǎn)生，給結(jié)核病的治療帶來了困難和挑戰(zhàn)；研發(fā)活性更高、療程更短的抗結(jié)核新藥及藥品組合是解決此問題的關(guān)鍵。早期殺菌活性(early bactericidal activity，EBA)的測定是臨床評價抗結(jié)核新藥活性的第一步[1]。EBA通常定義為抗結(jié)核治療最初2 d 內(nèi)，每日每毫升痰液中活菌數(shù)[菌落形成單位(colony forming unit，CFU)]平均下降速率的對數(shù)值。最早關(guān)于EBA的研究開展于20世紀80年代的肯尼亞，研究發(fā)現(xiàn)治療各組肺結(jié)核患者痰活菌計數(shù)的下降速率在治療的前2 d最快，各組平均殺菌速率差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在隨后的2～14 d中，各組平均殺菌速率平穩(wěn)下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義[2]。測定EBA是臨床評價抗結(jié)核藥物的初始步驟，其對了解抗結(jié)核新藥的作用和特性具有重大貢獻。筆者擬從EBA研究的臨床意義、EBA研究的方法、主要抗結(jié)核藥品的EBA研究進展進行概括，旨在輔助臨床醫(yī)生選擇合適的抗結(jié)核藥品或藥品組合方案，尤其是耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)的治療，并為抗結(jié)核新藥的研發(fā)提供幫助。

一、 EBA研究的臨床意義

EBA被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準用于抗結(jié)核藥物Ⅱa期臨床試驗的療效評價，是快速、準確評估藥物是否具有抗結(jié)核活性和探索其安全性的方法，可指導(dǎo)后續(xù)研究的劑量選擇。同時，通過測定一種抗結(jié)核藥品在不同劑量下的EBA可估算該藥品的治療范圍[3]。除了證明一種藥物是否具有殺菌活性外，EBA研究還可以用來量化這種殺菌活性的程度。雖然單藥療法被認為可能會增加出現(xiàn)耐藥性的風(fēng)險，但在EBA研究的過程中并沒有發(fā)生過上述情況[2],推測EBA可能在某種程度上反映該藥物防止其他藥物產(chǎn)生耐藥菌的能力。EBA的大小能反映藥物進入肺部結(jié)核病灶的能力。因為一種藥物要具有殺菌活性，首先得進入相應(yīng)的肺組織才能發(fā)揮殺菌作用，而殺菌能力的大小則與抗結(jié)核藥物穿透組織能力密切相關(guān)。此外，評估新型抗結(jié)核藥物和方案的傳統(tǒng)療效試驗成本昂貴，需要2～4年時間才能完成，但EBA可以大大減少評估治療效果所需的時間。綜上所述，EBA研究對于抗結(jié)核新藥能否進入臨床應(yīng)用具有重要的意義。

二、 EBA研究的方法

(一) 患者納入和排除標準

一般來講，納入事先沒有接受化療的顯微鏡下痰涂片陽性的肺結(jié)核患者，且能夠產(chǎn)生足夠數(shù)量的隔夜痰(至少10 ml)，其年齡在18～60歲之間，體質(zhì)量超過40 kg，并同意進行HIV血清學(xué)檢查者。排除懷疑有粟粒病灶或結(jié)核性腦膜炎的患者，以及過去6個月內(nèi)接受過抗結(jié)核治療的患者，或者有糖尿病等慢性疾病共病和心電圖Q-T間期異常的患者[4]。

(二)痰標本的收集和處理

化療開始前2 d連續(xù)12～16 h用寬口痰罐收集痰液，然后在治療期間從20時至8時收集痰標本，收集后盡快送實驗室處理。不能立即送至實驗室的標本應(yīng)冰凍保存，并于48 h內(nèi)送至實驗室。標本送至實驗室后，首先測量痰液體積，通過磁攪拌使標本均勻化30 min。將最大體積為10 ml的樣品加入0.1%二硫蘇糖醇等體積中，混勻，靜置20 min，得到消化后的痰液供進一步處理。由于痰標本在采集過程中通過口咽，培養(yǎng)污染限制了結(jié)核病痰培養(yǎng)的診斷率，故標本去污是一個重要的步驟。常規(guī)去污方法存在以下缺點：殺死許多MTB，程序昂貴和耗時，多個處理步驟增加了標本交叉污染和傳染實驗室工作人員的風(fēng)險。而N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)處理方法可以在不影響分離率和不增加污染率的情況下快速有效地減少污染微生物的數(shù)量[5]。在室溫下，分別加入等體積的NALC和低濃度NaOH進行液化消毒15 min；去污后，所有的標本都用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS；pH=6.8)進行中和，以4000×g離心15 min。離心后獲得的沉淀物再懸浮于2 ml的PBS中，用于涂片和接種到培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。有研究比較了5 h和12 h內(nèi)收集的痰標本中細菌負荷的變異性，發(fā)現(xiàn)其CFU計數(shù)或變異性沒有明顯差異[6]。這一發(fā)現(xiàn)表明，收集時間的減少不會影響痰標本的細菌載量。Nasci-mento 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，樣品質(zhì)量和實驗室程序變化引起的患者間和細胞內(nèi)變化，如痰液不完全均勻、痰中唾液過多、稀釋和菌落計數(shù)錯誤等因素會影響標本中的細菌載量。

(三)在固體培養(yǎng)基上進行CFU計數(shù)

將10倍梯度稀釋痰液接種于含兩性霉素、多粘菌素B、羧芐青霉素及三甲氧芐氨嘧啶的Middlebrook 7H10瓊脂平板培養(yǎng)基上[4]，37 ℃，5%～10% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培育3～4周。每周觀測培養(yǎng)板，在可產(chǎn)生10～50個可見菌落稀釋度的平板上計數(shù)菌落。先計數(shù)基線值(未開始用藥前)對應(yīng)的log10CFU，再計數(shù)用藥之后第n天的log10CFU，EBA值用未稀釋痰液log10CFU·ml-1·d-1來表示，然后根據(jù)公式：log CFU/ml(第0天)-logCFU/ml(第n天)/n，計算每例患者的EBA。

(四)在液體培養(yǎng)基上測定確定陽性時間(time to positivity，TTP)

在EBA研究中，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)和測定TTP具有更大的敏感性，并且檢測速度更快，且TTP的測定具有高度標準化的優(yōu)點，可在實驗過程中減少人為誤差，所以是CFU計數(shù)定量MTB的有效的替代方法[7]。TTP測定方法：將標本在BACTEC MGIT 960中培養(yǎng)，2.5 ml均質(zhì)化痰標本用1.5%的NaOH在室溫下消毒15 min，用PBS進行中和，以3000×g離心15 min。丟棄上清液后，將沉積物與PBS重新懸浮至2.5 ml，并將0.5 ml接種到MGIT管中[8]。在MGIT管中加入OADC增菌劑和含有多粘菌素B(6000 U)、甲氧芐啶(600 μg)、兩性霉素B(600 μg)、阿洛西林(600 μg)和納利昔酸(2400 μg)的雜菌抑制劑及0.5 ml的再懸浮顆粒，于37 ℃ 下孵育，系統(tǒng)自動標記陽性培養(yǎng)物，以小時為單位對TTP進行記錄[9]。

三、主要抗結(jié)核藥品的EBA研究

(一)一線抗結(jié)核藥品

1.異煙肼(isoniazid，INH)：INH是抗結(jié)核治療方案的重要組成藥品，可有效對抗快速分裂的MTB。INH的EBA呈現(xiàn)劑量相關(guān)性[10-11]。其在抗結(jié)核藥品中對MTB殺菌活性最高，300 mg INH所對應(yīng)的0～2 d的EBA為0.722 log10CFU·ml-1·d-1；且任何含有INH的方案，無論是單獨或與1或2種藥品聯(lián)合使用，都具有更高的EBA[2]。

2.利福平(rifampicin，RFP)：RFP是一種利福霉素類半合成廣譜抗菌藥，其EBA明顯低于INH[2]。研究顯示，RFP的EBA隨著藥品劑量的增加而增加，150 mg RFP的0～2 d 的EBA為0.071 log10CFU·ml-1·d-1，而600 mg RFP的0～2 d 的EBA為0.293 log10CFU·ml-1·d-1[12]。Diacon等[13]和Boeree等[14]的實驗均證明了高劑量的RFP可以使痰液中MTB載量下降更多，且安全性和耐受性良好。

3.吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)：PZA在結(jié)核病短程化療方案中起著至關(guān)重要的作用。Jindani等[2]研究顯示，PZA單藥對第0天至第2天痰培養(yǎng)菌落數(shù)下降的影響不大，EBA為0.44 log10CFU·ml-1·d-1。

4.乙胺丁醇(ethambutol，EMB)：Jindani等[2]的實驗顯示，EMB單藥 0～2 d的EBA為0.246 log10CFU·ml-1·d-1，Botha等[15]的實驗結(jié)果為EMB的平均EBA低于(0.245±0.046) log10CFU·ml-1·d-1，其沒有滅菌活性，只對防止耐藥性的出現(xiàn)有價值，而對縮短治療時間無價值。

5.鏈霉素(streptomycin，Sm)：Sm可能是所有抗結(jié)核藥物中在體外具有最積極殺菌作用的藥品。開普敦的一項研究證實了氨基糖苷類抗生素的低EBA特性[16]。另一項研究顯示，Sm的0～2 d的EBA為0.094 log10CFU·ml-1·d-1，2～14 d的EBA為0.130 log10CFU·ml-1·d-1，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，Sm在治療前2 d的低EBA似乎不是延遲殺菌作用的結(jié)果[2]。

(二)二線抗結(jié)核藥品

1.氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones，F(xiàn)Q)：FQ具有較強的殺滅MTB的作用，已成為臨床治療耐藥肺結(jié)核的首選。Johnson等[17]研究顯示，INH的0～2 d的EBA(0.67 log10CFU·ml-1·d-1)大于莫西沙星(0.33 log10CFU·ml-1·d-1)和加替沙星(0.35 log10CFU·ml-1·d-1)，而高劑量左氧氟沙星(1000 mg)對應(yīng)的EBA 為0.45 log10CFU·ml-1·d-1；所有3種FQ 2～7 d的EBA相似，且大于INH。Pletz等[18]研究顯示，INH和莫西沙星0～5 d的EBA分別為0.209 log10CFU·ml-1·d-1和0.273 log10CFU·ml-1·d-1，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Sirgel等[19]研究顯示，250 mg、500 mg、1000 mg 和1500 mg環(huán)丙沙星對應(yīng)的0～2 d的EBA從無藥組的-0.011 log10CFU·ml-1·d-1分別增加到0.046 log10CFU·ml-1·d-1、0.092 log10CFU·ml-1·d-1、0.121 log10CFU·ml-1·d-1和0.205 log10CFU·ml-1·d-1，這些結(jié)果顯示出高劑量環(huán)丙沙星的顯著殺菌活性。

2.利奈唑胺(linezolid，Lzd)：Lzd屬于噁唑烷酮類抗生素，具有優(yōu)異的體外和體內(nèi)抗結(jié)核活性。Dietze等[20]為了評價Lzd在肺結(jié)核患者中的早期和延長EBA，讓患者接受7 d 的300 mg INH每日1次或600 mg Lzd每日2次或600 mg Lzd每日1次治療，結(jié)果顯示，3個研究組的0～2 d的EBA差異有統(tǒng)計學(xué)意義，INH的0～2 d的EBA (0.67 log10CFU·ml-1·d-1)大于每日1次和每日2次Lzd(分別為0.26 log10CFU·ml-1·d-1和0.18 log10CFU·ml-1·d-1)；另外，利奈唑類藥物的2～7 d的EBA最小。

3.氯法齊明(clofazimine，Cfz)：Ammerman等[21]系統(tǒng)地評估了Cfz在體外和體內(nèi)的EBA，結(jié)果顯示，無論是體外或體內(nèi)，任何濃度下的Cfz在第1周都沒有表現(xiàn)出殺菌活性；然而，在第2周，Cfz在體外表現(xiàn)出濃度依賴性的抗菌活性，在體內(nèi)觀察到有限的抗菌活性。這表明Cfz的延遲EBA可能更多的是由于其作用機制，而不是宿主相關(guān)因素。

4.阿米卡星(amikacin，Am)：Donald等[22]研究顯示，5 mg/kg、10 mg/kg和15 mg/kg的Am對應(yīng)的0～2 d的EBA 為0.041 log10CFU·ml-1·d-1、0.045 log10CFU·ml-1·d-1和0.052 log10CFU·ml-1·d-1，未接受藥物組的EBA為0.041 log10CFU·ml-1·d-1，給藥組與無藥組的EBA差異無統(tǒng)計學(xué)意義。另一項研究檢測了7例新診斷的涂片陽性肺結(jié)核患者用脂質(zhì)型Am治療的EBA，結(jié)果顯示，盡管Am的濃度很高，但一直無法檢測到任何EBA，表明Am未能從其脂質(zhì)體中釋放出來[23]。雖然Am殺菌作用可能比其他藥物要低，但其可用于出現(xiàn)預(yù)防耐藥性。Am和所有氨基糖苷類藥物的低EBA，可能是由于酸性微環(huán)境，限制了其化療早期的殺菌活性。

5.對氨基水楊酸(p-aminosalicylic acid，PAS)：PAS的EBA僅在4例患者中進行過評價，其0～2 d的EBA為0.259 log10CFU·ml-1·d-1，但其2～14 d的EBA較低，只有0.076 log10CFU·ml-1·d-1[2]。與其他單一藥物方案相比，其表現(xiàn)出的殺菌作用較弱。

6.利福布汀(rifabutin，Rfb)：Chan等[12]研究顯示，服用300 mg和600 mg Rfb的患者0～2 d的EBA 分別為0.014 log10CFU·ml-1·d-1和0.075 log10CFU·ml-1·d-1，計數(shù)變化小，不會隨劑量的增加而增加。

7.利福噴丁(rifapentine，Rft)：Sirgel等[24]將Rft分為600 mg、900 mg、1200 mg等3個劑量組，其EBA與劑量大小的相關(guān)性很小，0～2 d的EBA和2～5 d的EBA分別為0.257 log10CFU·ml-1·d-1和0.194 log10CFU·ml-1·d-1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

(三)新型抗結(jié)核藥物

1.貝達喹啉(bedaquiline，Bdq，TMC207)：Bdq是一種二芳基喹啉類藥品，是過去40多年來美國FDA批準用于治療耐藥結(jié)核病的第一種藥品[25]。Rustomjee等[26]測定了Bdq治療0～7 d的EBA，其將Bdq分為3個劑量組，分別是25 mg、100 mg和400 mg，并與300 mg INH和600 mg RFP進行了比較，結(jié)果顯示，各劑量組0～7 d的EBA分別為(0.04±0.46) log10CFU·ml-1·d-1、(0.26±0.64) log10CFU·ml-1·d-1、(0.77±0.58) log10CFU·ml-1·d-1；雖然Bdq在治療的最初幾天沒有顯示出明顯的反應(yīng)，但從第4天起，觀察到400 mg Bdq的顯著殺菌活性，說明Bdq具有延遲殺菌活性。同時，可以發(fā)現(xiàn)，在治療4～7 d，400 mg Bdq每天的CFU下降幅度與同期的INH和RFP相似。此外，Bdq的耐受性好，沒有研究藥物相關(guān)的嚴重不良事件發(fā)生。在南非進行的一項研究顯示，Bdq治療14 d的EBA為0.061 log10CFU·ml-1·d-1[27]。另一項研究評估了每日100 mg、200 mg、300 mg和400 mg Bdq治療14 d的EBA，分別在第1個治療日加藥200 mg、400 mg、500 mg和700 mg，第2個治療日加藥100 mg、300 mg、400 mg和500 mg，以使Bdq血漿水平迅速達到所需的目標濃度。這四組Bdq治療14 d的EBA分別為0.040 log10CFU·ml-1·d-1、0.056 log10CFU·ml-1·d-1、0.077 log10CFU·ml-1·d-1和0.104 log10CFU·ml-1·d-1，所有的Bdq組均表現(xiàn)出明顯的殺菌活性，抗菌作用隨著劑量的增加而升高[28]。

2.德拉馬尼(delamanid，Dlm，OPC-67683)：Dlm是繼Bdq之后，由日本大冢制藥研發(fā)的第2種抗結(jié)核新藥[29]。在南非進行的一項為期14 d的 EBA研究顯示，Dlm分為100 mg、200 mg、300 mg和400 mg等4個劑量組；結(jié)果顯示，盡管4個治療組的EBA差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但與接受100 mg 和400 mg Dlm治療組相比，接受200 mg和300 mg Dlm治療組有更多患者在14 d內(nèi)經(jīng)歷了0.9 log10CFU·ml-1·d-1痰菌載量下降的反應(yīng)，表明Dlm具有顯著的連續(xù)殺菌活性，但其殺菌活性無劑量依賴性[30]。Saliu等[31]研究發(fā)現(xiàn)，Dlm的滅菌率表現(xiàn)出濃度依賴性，在最高劑量水平(1.0 mg/ml)下，優(yōu)于INH，接近或等同于RFP。

3.PA-824(pretomanid)：PA-824是一種硝基咪唑類化合物，抑制MTB蛋白質(zhì)和細胞壁脂質(zhì)的合成。Diacon等[32]針對PA-824做了兩項研究，第一項研究將PA-824分成200 mg、600 mg、1000 mg和1200 mg等4個劑量組，結(jié)果表明，TTP測定的PA-824活性與痰菌CFU定量測定的結(jié)果相似。PA-824的EBA對所有4個劑量都相當，所有組的0～14 d平均每日痰菌量下降0.098 log10CFU·ml-1·d-1，治療14 d的TTP總體每天平均增加了4.106 h，由于在試驗的最低劑量下出乎意料地達到了最大療效，因此，應(yīng)該進一步探索PA-824在較低劑量下的殺菌活性，以確定EBA測量的該藥物的劑量反應(yīng)范圍。第二項研究中，患者隨機接受口服劑量為50 mg、100 mg、150 mg和200 mg的PA-824，結(jié)果顯示，4組劑量水平的平均EBA之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但在50 mg的劑量下，可以看出PA-824的療效呈略低的趨勢[33]。結(jié)合既往研究結(jié)果，可知PA-824在100～1200 mg 的廣泛劑量范圍內(nèi)具有均勻活性。在未來的臨床研究中，PA-824劑量在100～200 mg之間似乎是評估的最佳選擇。最近的小鼠劑量分餾研究表明，PA-824的殺菌活性呈時間依賴性，且臨床劑量的藥代動力學(xué)模型與目前的研究結(jié)果一致，PA-824每日劑量低至100 mg將產(chǎn)生最大的殺菌效果[34]。

4.Q203：Q203通過抑制分枝桿菌細胞色素bc1復(fù)合物來抑制MTB細胞能量的產(chǎn)生。de Jager等[35]進行了一項為期14 d的研究，將Q203分為100 mg、200 mg和300 mg共3個劑量組，以標準治療方案(R-H-Z-E，R：利福平；H：異煙肼；Z：吡嗪酰胺；E：乙胺丁醇)作為陽性對照組，EBA的大小用log10TTP來表示。對應(yīng)的0～14 d的EBA分別為0.0036、0.0087和0.0135，標準治療方案組對應(yīng)的EBA為0.0207，且任何劑量下的Q203治療均沒有出現(xiàn)嚴重的藥物不良反應(yīng)。

5.AZD-5847：2009年12月，阿斯利康公司研制的該公司首個抗結(jié)核候選藥AZD-5847進入Ⅰ期臨床試驗階段。AZD-5847是一種對MTB具有體外活性的噁唑烷酮抗生素。Furin等[36]將AZD-5847分為4個劑量組：500 mg每日1次，500 mg每日2次，1200 mg每日1次，800 mg每日2次。結(jié)果顯示，500 mg AZD-5847每天2次可使痰標本在固體培養(yǎng)基上的CFU下降0.039 log10CFU·ml-1·d-1，其余組別均未檢測到殺菌活性；當用TTP來評估EBA時，在每天2次500 mg和每天2次800 mg的劑量下，其TTP明顯增加，分別為每天1.24 h和1.21 h, 其他劑量的AZD-5847沒有顯示出明顯的TTP增加。

四、 問題與展望

綜上所述，EBA研究因受試人數(shù)較少，需時短，在抗結(jié)核新藥研發(fā)的臨床試驗階段成為一種快速而簡易的人體藥效學(xué)指標。但是EBA也存在一些局限性：第一，存在細菌和真菌污染問題，故最好使用選擇性培養(yǎng)基進行EBA研究；第二，某些藥物(如EMB)的劑量相關(guān)反應(yīng)可能只有在較長的研究期間才會明顯；第三，如果只研究前2 d的治療，某些藥物的活性就不會被檢測到，如PZA的活性直到開始治療大約4 d后才變得明顯；第四，由于大多數(shù)EBA研究的受試者人數(shù)很少(每組通常在3～8例之間)，單個患者的去除會帶來相當大的統(tǒng)計誤差；第五，EBA只能檢測易于咳出體外的病變處的MTB，而不能檢測肉芽腫、結(jié)節(jié)和空洞壁的細菌，故不能很好地預(yù)測治療失敗和復(fù)發(fā)。新一代EBA試驗(NCT02371681)正在評估正電子發(fā)射體層攝影(positron emmision tomography，PET)和CT在抗結(jié)核病新藥早期快速評估中的潛在作用，優(yōu)化EBA研究的方法學(xué)，以便豐富試驗設(shè)計。隨著方法學(xué)的進一步優(yōu)化，EBA研究將對抗結(jié)核新藥及新方案的Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗研究具有重要的指導(dǎo)意義。