符巍馬 潞譚贏 游潮

腦出血是腦卒中的常見類型，約占全部腦卒中的15%［1?2］。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，全球每年新增腦出血病例超過100萬例，隨著人口老齡化的加劇，預(yù)計(jì)病例數(shù)仍會(huì)繼續(xù)增加［3］。盡管以外科手術(shù)和支持治療為主要手段的治療方案日臻成熟，但大多數(shù)腦出血患者仍最終殘疾甚至死亡［4］。腦出血初期，原發(fā)性腦損傷所致血腫壓迫和出血灶周圍組織水腫形成占位效應(yīng)和顱內(nèi)高壓，導(dǎo)致腦疝形成和死亡；之后小膠質(zhì)細(xì)胞激活，誘導(dǎo)分泌多種促炎性因子、促進(jìn)氧化應(yīng)激和細(xì)胞毒性級聯(lián)反應(yīng)，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生功能損傷和死亡，最終引起繼發(fā)性腦損傷［5］。小膠質(zhì)細(xì)胞是關(guān)鍵的先天性免疫細(xì)胞，是在各種急性腦損傷的病理生理學(xué)機(jī)制中最先做出反應(yīng)的非神經(jīng)元［6］，活化后可分泌趨化因子、細(xì)胞因子、前列腺素及其他免疫調(diào)節(jié)分子［7］，這些分子在繼發(fā)性腦損傷和腦修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，采用包含骨髓來源的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的細(xì)胞療法可有效緩解缺血性卒中模型大鼠腦損傷程度、改善預(yù)后［8］。因此，筆者認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞的激活過程和免疫功能，以及與其他細(xì)胞之間的相互作用在腦出血的病理生理學(xué)機(jī)制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。腦出血后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)可以引起繼發(fā)性腦損傷，如果在調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變、促進(jìn)血腫吸收的同時(shí)抑制炎性因子釋放，可以減輕繼發(fā)性腦損傷，修復(fù)腦白質(zhì)之完整性，促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)。目前國外已公布的大型隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)并未顯示出積極的開顱血腫清除術(shù)可以改善預(yù)后，因此腦出血治療仍需從清除血腫的內(nèi)源性機(jī)制著手［9］。本文擬對腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞功能改變的研究進(jìn)展進(jìn)行概述，尤其關(guān)注小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、極化、增殖、分泌和吞噬等作用，并總結(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，以及以表型轉(zhuǎn)變?yōu)榘悬c(diǎn)的包括免疫調(diào)節(jié)劑在內(nèi)的各種調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的藥物、小膠質(zhì)細(xì)胞與其他神經(jīng)細(xì)胞之間的相互作用，重新思考腦出血的治療方向。

一、小膠質(zhì)細(xì)胞表型

小膠質(zhì)細(xì)胞是特異性存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞［10］，活化小膠質(zhì)細(xì)胞在不同病程階段可以轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型（促炎型）或M2型（修復(fù)型）兩種表型，這一動(dòng)態(tài)變化過程稱之為極化。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞可分泌多種促炎性因子和趨化因子，引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡；M2型小膠質(zhì)細(xì)胞主要是吞噬和清除病原體，修復(fù)組織細(xì)胞。在急性腦損傷過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞可動(dòng)態(tài)、瞬時(shí)改變其表型，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可在脊髓損傷、缺血性卒中和顱腦創(chuàng)傷病程中介導(dǎo)神經(jīng)組織損傷和修復(fù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，顱腦創(chuàng)傷和缺血性卒中動(dòng)物模型中小膠質(zhì)細(xì)胞可由M2型向M1型轉(zhuǎn)變，而在癲動(dòng)物模型中則M1型 和M2型 共 表 達(dá)［11］。近 年 關(guān) 于M1型 和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞極化的傳統(tǒng)概念引起爭議：Casella等［12］對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠模型的觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的M1型標(biāo)志物白細(xì)胞介素?6（IL?6）可被IL?4誘導(dǎo)并發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)作用；Kim等［13］在顱腦創(chuàng)傷小鼠模型中觀察到M1型和M2型經(jīng)典標(biāo)志物IL?1β和精氨酸酶1（Arg1）、腫瘤壞死因子（TNF）和甘露糖受體C1樣蛋白1（Mrc1）高度共表達(dá)于同一細(xì)胞。因此，目前尚無法確定小膠質(zhì)細(xì)胞究竟是發(fā)生M1型極化還是M2型極化?；谏鲜鼋Y(jié)果，有學(xué)者提出小膠質(zhì)細(xì)胞表型“二分法”過于簡單，不足以闡明小膠質(zhì)細(xì)胞的多種生物學(xué)功能［14］，但迄今尚未發(fā)現(xiàn)更多有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持更多的分類。因此，筆者認(rèn)為進(jìn)行腦出血?jiǎng)游锬Ｐ脱芯繒r(shí)，應(yīng)從疾病病程的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)探索小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬和血腫清除率等功能。

1.M1型小膠質(zhì)細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞極化為M1型可誘導(dǎo)各種炎性因子的產(chǎn)生，炎性因子在分子水平的改變可反映腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)功能的變化。對腦出血患者的腦組織進(jìn)行免疫組化染色或流式細(xì)胞術(shù)分析，可鑒別小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物，包 括Iba1、CD11b、CD68和F4/80等［15?18］。正 常腦組織中CD11b僅由小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，而腦出血患者受損腦組織中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞亦表達(dá)該蛋白，故僅根據(jù)CD11b無法區(qū)分小膠質(zhì)細(xì)胞與中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CD45表達(dá)量可對二者進(jìn)行區(qū)分，CD45IntCD11b+為小膠質(zhì)細(xì) 胞、CD45HighCD11b+為巨 噬 細(xì) 胞［19?20］。腦 出 血 后，由M1型小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的炎性因子表達(dá)變化顯著，對Ⅳ型膠原酶和自體血誘導(dǎo)的腦出血大鼠模型觀察可見，血清IL?1β、IL?6、TNF和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）等炎性因子mRNA在急性期升高，相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)變化也遵循相似的病程節(jié)點(diǎn)［21?23］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，嚙齒類動(dòng)物腦出血3天內(nèi)腦組織IL?1β、IL?6和TNF水平升高，第4天開始逐步下降，至第7天恢復(fù)至正常水平；與上述促炎性因子不同，血清干擾素?γ（IFN?γ）在腦出血3天內(nèi)無明顯變化，但在腦出血后期（第7天）顯著升高［24?25］。盡管不同的腦出血?jiǎng)游锬Ｐ秃驮u估時(shí)間表達(dá)的特異性炎性因子水平不盡一致，但上述經(jīng)典的M1型標(biāo)志物在急性期的總體變化與腦出血患者保持一致。至腦出血慢性期（發(fā)病后14天），大多數(shù)炎性因子的表達(dá)已恢復(fù)至正常水平［25］，但是上述炎性因子在腦出血慢性期是否發(fā)生變化，以及這些變化是否影響神經(jīng)功能的恢復(fù)，目前尚難以確定。

2.M2型小膠質(zhì)細(xì)胞與M1型小膠質(zhì)細(xì)胞已取得的研究成果不同，目前關(guān)于M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的研究較少。已知M2型在缺血性卒中、多發(fā)性硬化和癲等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要的吞噬作用和毒物清除作用［26?28］。IL?10是M2型小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的抗炎性因子，除具有增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用外，還可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）抑制促炎性因子的產(chǎn)生［29］。研究顯示，腦出血患者血液和腦組織IL?10水平升高，且與再次出血有關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確［30?32］。在Ⅳ型膠原酶誘導(dǎo)的腦出血C57BL/6小鼠模型中，大多數(shù)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物IL?10、Arg1、Ym1和CD206 mRNA于腦出血后1天表達(dá)上調(diào)，而轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）以及IL?4 mRNA和蛋白于腦出血后3天表達(dá)顯著升高；但在自體血誘導(dǎo)的腦出血小鼠模型中，血腫周圍腦組織始終檢測不到IL?4，IL?10在腦出血2周內(nèi)亦無明顯改變，而TGF?β在腦出血第1～10天表達(dá)上調(diào)并持續(xù)至第14天，這一時(shí)期向腦組織定向注射TGF?β可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞IL?6的表達(dá)，進(jìn)而改善小鼠行為異常［25］。臨床實(shí)踐中，腦出血患者發(fā)病3天內(nèi)血漿TGF?β水平升高與發(fā)病后90天神經(jīng)功能預(yù)后改善相關(guān)，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物CD163亦表達(dá)上調(diào)［25］?；谏鲜龌A(chǔ)與臨床研究結(jié)果，推測TGF?β和CD163有可能是腦出血的潛在治療靶點(diǎn)。對自體血誘導(dǎo)的腦出血小鼠模型的觀察顯示，發(fā)病第1天CD206和Ym1表達(dá)即升高［33］，而Ⅳ型膠原酶誘導(dǎo)的腦出血大鼠模型則于發(fā)病第2和3天Ym1表達(dá)才升高［34］。目前，關(guān)于M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物在膠原酶誘導(dǎo)的腦出血模型中的動(dòng)態(tài)變化研究較少，現(xiàn)有數(shù)據(jù)僅顯示M1型標(biāo)志物在腦出血后3～6小時(shí)表達(dá)升高，M2型標(biāo)志物較M1型表達(dá)升高晚1天且持續(xù)時(shí)間更短。由于Ⅳ型膠原酶和自體血這兩種建模方式存在諸多差異，即使相同的實(shí)驗(yàn)條件下兩種模型得出的研究結(jié)果亦有許多不一致之處。因此建議，在有條件的情況下同時(shí)開展兩種建模方式，以便更準(zhǔn)確、全面地評估M1型和M2型標(biāo)志物與預(yù)后的關(guān)系。

3.M1型與M2型小膠質(zhì)細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)變目前對腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞兩種表型的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變知之甚少。研究顯示，M1型和M2型標(biāo)志物在腦出血模型中的表達(dá)隨時(shí)間變化，在Ⅳ型膠原酶誘導(dǎo)的腦出血小鼠模型中發(fā)病3天內(nèi)即出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，自體血誘導(dǎo)的腦出血大鼠模型發(fā)病1周內(nèi)方出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，即發(fā)病3天內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞主要向M1型極化，再緩慢向M2型極化，故小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型極化后誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是急性期繼發(fā)性腦損傷的重要機(jī)制，隨后向M2型極化是神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵因素；而且M2型標(biāo)志物在老齡動(dòng)物模型中的表達(dá)變化與腦出血神經(jīng)功能預(yù)后密切相關(guān)［35］。然而，目前關(guān)于M2型標(biāo)志物的相關(guān)研究較少，尚無法確定其在腦出血亞急性期和慢性期的具體作用機(jī)制，鑒于某些M2型標(biāo)志物和細(xì)胞因子對小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用呈非特異性，因此建議采用多次免疫熒光染色檢測這兩種細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。

二、小膠質(zhì)細(xì)胞在血腫清除中的作用

小膠質(zhì)細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬能力，可在病理?xiàng)l件下吞噬并清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)β?淀粉樣蛋白（Aβ）、神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）以及凋亡致裂解的神經(jīng)元和神經(jīng)突觸碎片，同時(shí)也是血腫清除過程中的重要細(xì)胞，CD36、CD47和CD163可能參與小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬血腫的過程［35?36］。（1）CD36：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均顯示，腦組織CD36表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)血腫吸收［37］。CD36是過氧化物酶增殖物激活受體（PPAR）介導(dǎo)的下游基因轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵靶點(diǎn)，PPARγ激活可誘導(dǎo)CD36表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而強(qiáng)化小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬血腫的能力，而小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞Toll樣受體4（TLR4）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路則下調(diào)CD36的表達(dá)［38］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，TLR4缺陷型小鼠血腫周圍區(qū)域可觀察到較少的活化小膠質(zhì)細(xì)胞和較高水平的CD36和CX3C趨化因子配體1（CX3CL1）；自體血誘導(dǎo)的腦出血CD36-/-小鼠IL?1β和TNF mRNA表達(dá)高于野生型小鼠，該模型小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞在體外吞噬紅細(xì)胞的能力降低，但I(xiàn)L?10水平升高［38］。因此認(rèn)為，CD36表達(dá)缺失可導(dǎo)致TLR4表達(dá)上調(diào)，TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的小膠質(zhì)細(xì)胞通過下調(diào)CD36的表達(dá)和促進(jìn)IL?10的生成而減弱小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用并減慢血腫的吸收。（2）CD47：目前關(guān)于CD47與小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)性的研究相對較少。Ni等［39］采用自體血誘導(dǎo)腦出血野生型小鼠或CD47-/-小鼠模型，發(fā)現(xiàn)予以CD47治療的小鼠血紅素加氧酶?1（HO?1）降解速率增加，并以M2型極化方式加速血腫清除。（3）CD163：血紅蛋白清除劑受體CD163在血腫清除過程中具有潛在作用［40?41］。在自體血誘導(dǎo)的腦出血大鼠模型中，血腫消退的同時(shí)CD163表達(dá)升高，表明能夠調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的蛋白質(zhì)可以促進(jìn)血腫吸收［41］。由此可見，探尋能夠調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化和吞噬作用，并清除血腫的新靶點(diǎn)有可能引領(lǐng)腦出血治療的發(fā)展。

三、小膠質(zhì)細(xì)胞與其他神經(jīng)細(xì)胞之間的相互作用

1.神經(jīng)元CX3CL1/CX3CR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可激活小膠質(zhì)細(xì)胞并介導(dǎo)其與神經(jīng)元之間的相互作用［42?44］。綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的CX3CR1小鼠模型被廣泛用于小膠質(zhì)細(xì)胞激活和功能研究［45?46］，缺血性卒中小鼠模型顯示，神經(jīng)元釋放CX3CL1，并通過CX3CR1參與小膠質(zhì)細(xì)胞激活，而CX3CL1敲除小鼠對缺血?再灌注損傷的敏感性顯著降低［47］；自體血誘導(dǎo)腦出血小鼠模型顯示，TLR4敲除小鼠CX3CL1和CD36 mRNA表達(dá)均高于野生型小鼠，而單核細(xì)胞特異性CX3CR1缺陷小鼠神經(jīng)功能有所改善，表明腦出血后神經(jīng)元分泌的CX3CL1參與小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用和神經(jīng)功能恢復(fù)［48］。由 此 可 見，腦出血后CX3CL1與CX3CR1結(jié)合可誘發(fā)神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞之間的反應(yīng)，并參與小膠質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變。

2.星形膠質(zhì)細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)胞可以分泌多種調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞激活和極化的趨化因子，包括CXC趨化因子配體1（CXCL1）、CXCL2、CC趨化因子配體20（CCL20）、CCR1和CCR2等，這些趨化因子在腦出血患者的血腫周圍組織中呈高表達(dá)，表明其在腦出血的病理生理學(xué)機(jī)制中具有潛在作用［49］。在自體血誘導(dǎo)的腦出血大鼠模型中，紋狀體和大腦皮質(zhì)CXCL2水平于建模第1天即顯著升高［50］；在Ⅳ型膠原酶誘導(dǎo)的腦出血小鼠模型中，抑制CCL2或CCR2表達(dá)可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞激活并下調(diào)iNOS的表達(dá)，從而促進(jìn)血腫吸收并且改善神經(jīng)功能［51］；而在自體血誘導(dǎo)腦出血的CCR2-/-小鼠模型中，則可見較少的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞激活和早期運(yùn)動(dòng)功能改善［52］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，IL?15作為星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用因子，可加劇腦出血后繼發(fā)性腦損傷［53］。由此可見，深入探究小膠質(zhì)細(xì)胞極化、吞噬作用和星形膠質(zhì)細(xì)胞的其他功能有助于提高對腦出血病理生理學(xué)機(jī)制的理解。

3.少突膠質(zhì)細(xì)胞腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞極化與少突膠質(zhì)細(xì)胞功能之間的相互作用目前尚未闡明。Ⅳ型膠原酶誘導(dǎo)的腦出血小鼠模型發(fā)病2周內(nèi)可見血腫周圍白質(zhì)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和分化，但具體機(jī)制尚不清楚［54］。多發(fā)性硬化動(dòng)物模型顯示，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞在髓鞘再生期間可促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖和分化，可能與神經(jīng)功能恢復(fù)有關(guān)［55］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，超聲引導(dǎo)下全血注射誘導(dǎo)腦出血后，少突膠質(zhì)細(xì)胞可分泌觸珠蛋白，并在24小時(shí)內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞（包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞）保護(hù)作用，使其免受血紅蛋白裂解后產(chǎn)生的氯化血紅素和鐵離子引起的毒性作用［56］。未來有待更多基礎(chǔ)與臨床研究拓寬小膠質(zhì)細(xì)胞與少突膠質(zhì)細(xì)胞之間相互作用的認(rèn)知。

四、小結(jié)

小膠質(zhì)細(xì)胞在腦出血病程中發(fā)揮重要作用，其激活程度、表型極化、血腫清除機(jī)制及其與神經(jīng)細(xì)胞之間的相互作用是目前腦出血研究的熱點(diǎn)。盡管目前關(guān)于腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞極化的諸多機(jī)制尚不十分明確，但一些實(shí)驗(yàn)性藥物已經(jīng)證明可以通過抑制M1型極化或增強(qiáng)M2型極化，達(dá)到減輕繼發(fā)性腦損傷、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的效果。如何在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間節(jié)點(diǎn)既可抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞激活、減少各種炎性因子分泌，又可促進(jìn)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞激活、最大程度加速血腫清除，從而抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)、保護(hù)神經(jīng)功能，尚待更多基礎(chǔ)與臨床研究的驗(yàn)證。由此可見，在探索腦出血治療藥物的道路上，特異性存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞依然具有巨大的研究價(jià)值和應(yīng)用前景。

利益沖突無