于志淵 鄭峻馬 潞李浩 游潮

根據流行病學調查資料統(tǒng)計，腦出血占世界范圍內全部腦卒中的10%～15%，我國這一比例則高達17%～55%［1?2］，腦出血患者發(fā)病后30天的病死率約為40%，發(fā)病后180天生活自理者僅占全部腦出血患者的20%［3?4］。腦出血的損傷機制包括原發(fā)性和繼發(fā)性腦損傷，出血和占位效應對腦組織的直接破壞稱之為原發(fā)性腦損傷［5］；出血后伴隨的炎癥反應、血?腦屏障（BBB）破壞，以及血腫周圍水腫形成等造成的腦組織新發(fā)損傷為繼發(fā)性腦損傷，與預后不良密切相關，被認為是腦出血治療的潛在靶點［6］。腦出血后血液成分釋放進入腦組織，首先活化小膠質細胞等中樞神經系統(tǒng)固有免疫細胞，引發(fā)炎癥反應信號轉導通路的級聯(lián)反應，破壞血?腦屏障，導致外周血免疫細胞浸潤活化，進而釋放各類細胞因子、趨化因子、自由基，以及其他毒性物質，形成免疫風暴，導致神經元及其支持細胞大量死亡［7?8］。另外，腦出血后24小時，破入腦組織的紅細胞發(fā)生裂解，由其釋放的血紅蛋白、血紅素和鐵離子等細胞毒性物質也在神經細胞死亡中發(fā)揮重要作用［9］。神經細胞死亡后釋放的一系列內源性危險信號，稱為損傷相關分子模式（DAMP），后者與模式識別受體相結合，激活固有免疫反應，誘發(fā)炎癥反應?細胞死亡?DAMP釋放?炎癥反應之惡性循環(huán)，此為腦出血后繼發(fā)性腦損傷的重要病理生理學機制［10］。常見的DAMP主要包括腺苷、熱休克蛋白（HSP）、白細胞介素?33（IL?33）等，而近年文獻報道的一系列研究更關注血紅素、高遷移率族蛋白1（HMGB1）、S?100B蛋白（S?100B）和過氧化物還原酶（Peroxiredoxin）等重要的DAMP在腦出血繼發(fā)性腦損傷中的作用，本文擬對此類內源性危險信號分子的研究進展進行概述，以為進一步的基礎研究和臨床轉化研究提供參考。

一、血紅素

腦出血后紅細胞隨血液擴散至腦實質，小膠質細胞通過吞噬紅細胞而在內源性血腫清除機制中發(fā)揮作用，該過程由CD36介導，受過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）調節(jié)，PPARγ活化可促進血腫清除并減輕腦出血后的繼發(fā)性腦損傷［11］。然而，當大量紅細胞進入腦實質后，內源性血腫清除機制則難以承受清除血腫的“重任”，加之腦實質的微環(huán)境不適宜紅細胞生存，紅細胞逐漸裂解、釋放血紅蛋白，后者進一步分解、釋放游離血紅素，最終經血紅素加氧酶降解形成游離鐵離子，游離血紅素和鐵離子均為重要的炎癥反應誘因［12］。血紅素是目前較為關注的血紅蛋白衍生DAMP，可激活免疫細胞，上調細胞黏附分子（CAMs）和細胞因子的表達，引起急性神經炎癥反應［13］。一方面，血紅素以Toll樣受體4（TLR4）依賴性方式激活巨噬細胞，誘導促炎性因子的分泌［14］；另一方面，顯著上調小膠質細胞TLR4和腫瘤壞死因子?α（TNF?α）等促炎性因子的表達。敲除TLR4基因或應用TLR4抗體可抑制血紅素誘導的小膠質細胞活化，動物實驗顯示，腦出血后小膠質細胞TLR4水平明顯升高，游離血紅素可使野生型小鼠促炎性因子水平和腦含水量顯著升高，加重神經功能缺損，而TLR4基因敲除小鼠則不出現(xiàn)與之相同的炎癥反應，表明腦出血后血紅素可通過TLR4信號轉導通路引起小膠質細胞活化并誘導核因子?κB（NF?κB）活化，繼而誘發(fā)神經炎癥反應，在腦出血繼發(fā)性腦損傷機制中發(fā)揮重要作用［15］。血紅素具有上調星形膠質細胞基質金屬蛋白酶?9（MMP?9）、促炎性因子和趨化因子等炎性反應物質表達的作用，而敲除TLR2基因或應用TLR2抗體則可使血紅素誘導的星形膠質細胞活化受到抑制；與野生型小鼠相比較，外源性血紅素并未誘發(fā)TLR2基因敲除小鼠產生急性神經炎癥反應，而且其血?腦屏障破壞和中性粒細胞浸潤程度明顯較輕，IL?1β、IL?6和TNF?α等促炎性因子水平顯著降低，神經功能缺損程度輕微，提示腦出血后血紅素所引起的繼發(fā)性腦損傷需依賴TLR2蛋白的表達［16］。上述研究結果表明，血紅素可根據不同細胞類型，采用不同模式識別受體，激活固有免疫反應，如通過TLR4蛋白激活小膠質細胞和巨噬細胞，通過TLR2蛋白激活星形膠質細胞。

二、高遷移率族蛋白1

HMGB1是一種普遍存在于哺乳動物且含量豐富的非組蛋白DNA結合蛋白，腦出血后血腫周圍神經細胞受損，HMGB1自細胞核釋放至細胞外，成為重要的DAMP［17?18］。Zhou等［19］的研究顯示，腦出血患者血清HMGB1水平顯著高于正常對照者；該作者于腦出血小鼠模型亦觀察到同樣的結果，即血腫周圍組織HMGB1水平顯著升高，并于出血后72小時達峰值，出血后5天表達水平逐漸下降。有研究顯示，腦出血患者血清HMGB1表達變化與血腫量、美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評分、IL?6和TNF?α表達水平相關［19?20］，且為神經功能預后不良的重要影響因素，其受試者工作特征（ROC）曲線下 面 積（AUC）為0.718（95%CI：0.603～0.831，P=0.001）［20］。下調HMGB1表達可減輕腦出血繼發(fā)性腦損傷，HMGB1抑制劑丙酮酸乙酯可減弱小膠質細胞活化、抑制神經元凋亡、緩解腦水腫和神經功能缺損程度［21］；HMGB1單克隆抗體具有抑制HMGB1釋放、降低血清HMGB1表達水平、抑制小膠質細胞活化、緩解氧化應激反應和減輕腦水腫的作用［18］。動物實驗結果亦提示，HMGB1抑制劑甘草甜素可逆轉HMGB1激活固有免疫反應的作用，抑制神經元凋亡、減輕腦水腫和腦損傷程度、改善大鼠行為異常［22］；HMGB1抑制劑或晚期糖基化終末產物受體（RAGE）阻斷劑可減少急性期腦出血大鼠模型血腫周圍炎性細胞浸潤、下調促炎性因子表達、緩解腦水腫、改善神經功能［23］；而上調腦出血大鼠模型微小RNA?129?5p（miRNA?129?5p）表達則能夠有效抑制腦出血后HMGB1?RAGE信號轉導通路相關蛋白的 表 達［24］。上 述 研究 表 明，HMGB1?RAGE信號轉導通路可能參與腦出血急性期損傷機制。此外，亦有研究顯示，HMGB1在腦出血恢復期具有促進血管生 成 和 神 經 修 復 作 用［25?27］，今 后 尚 待 進 一 步 探 究HMGB1在腦出血不同階段的作用。

三、S?100B蛋白

S?100B蛋白是一種通過星形膠質細胞表達和釋放的腦組織特異性鈣結合蛋白（CaBP），為RAGE之配體，二者相互作用在腦出血損傷機制中發(fā)揮重要作用［28］。腦出血后S?100B自受損的細胞質快速釋放進入血液［29］，活化星形膠質細胞和小膠質細胞，產生促炎性因子和活性氧（ROS），可進一步加重腦出血的繼發(fā)性腦損傷［30］。對Ⅳ型膠原酶構建的腦出血大鼠模型觀察發(fā)現(xiàn)，腦出血后6小時大鼠血清S?100B水平即達峰值［31］。臨床研究顯示，腦出血患者發(fā)病6小時內血清S?100B水平升高，24小時內達峰值，第2天進入平臺期，此后逐漸下降［32］；腦出血患者血清S?100B水平不僅高于正常對照者且可持續(xù)至發(fā)病后第7天［32?33］，且血清與腦脊液S?100B水平呈顯著正相關，均高于正常對照者［34］。研究顯示，腦出血患者血清S?100B水平明顯高于缺血性卒中患者，據此可對二者進行鑒別［29，35］。動物實驗結果顯示，腦出血大鼠模型血清S?100B水平與血腫量（r=0.37，P＜0.05）和血腫周圍水腫程度（r=0.48，P＜0.01）呈正相關［31］；臨床研究顯示，腦出血患者血清S?100B水平與Glasgow昏迷量表（GCS）評分呈負相關（r=?0.45，P=0.004），與血腫量（r=0.45，P＜0.0001）和血腫周圍水腫程度（r=0.27，P=0.033）呈正 相 關［32?33，35］。通過 血 清S?100B變 化，尚 可 判 斷 腦出血患者預后：血清S?100B水平升高為發(fā)病后1周病死率上升的預測因素（OR=1.046，95%CI：1.014～1.078；P=0.004）［32］；血清S?100B水平較高者大多預示早期神經功能惡化（P=0.001）和預后不良（P=0.003）［33］；另外，腦出血24小時內的血清S?100B水平被認為是出院時神經功能預后的預測因素（OR=1.02，95%CI：1.003～1.039；P=0.02）［36］；經 研 究 表明，S?100B水平預測神經功能預后不良的靈敏度可達100%、特異 度 為76.2%［35］。Ferrete?Araujo等［37］對36例腦出血患者進行前瞻性觀察發(fā)現(xiàn)，最終死亡13例、生存23例，而死亡患者入院時、發(fā)病后24和48小時血清S?100B水平均高于生存患者；生存患者神經功能預后良好者11例、預后不良12例，預后不良患者發(fā)病后24、48和72小時血清S?100B水平均高于預后良好患者，提示血清S?100B是腦出血患者病死和神經功能預后不良的早期預測指標。因此Ferrete?Araujo認為，血清S?100B可以成為腦出血治療的可行靶點，目前此類研究尚處于動物實驗階段。動物實驗顯示，應用Arundic acid抑制星形膠質細胞合成S?100B，可降低腦出血大鼠模型中樞和周圍神經系統(tǒng)S?100B的表達，以及抑制星形膠質細胞和小膠質細胞活化，減少促炎性因子釋放和活性氧生成，減少神經元凋亡，緩解腦出血引起的神經功能缺損和腦損傷［30，38］；電針和涼血通瘀方劑等中藥治 療亦可降 低血清S?100B水平［39?40］。S?100B在腦出血中的作用和相關機制尚待進一步研究。

四、過氧化物還原酶

Peroxiredoxin是一類氧化應激誘導型過氧化物酶，在哺乳動物細胞中可分為Peroxiredoxin1～6（Prx1～6）共6種亞型，具有氧化還原活性，可以調節(jié)氧化應激相關細胞凋亡，發(fā)揮神經保護作用［41］。（1）Prx1：是Peroxiredoxin中的主要出血應激誘導型亞型［42］。其主要表達于腦出血大鼠模型的星形膠質細胞和小膠質細胞，于紋狀體注射腺病毒使其過表達，可使炎癥反應減輕并抑制細胞凋亡［43］；注射丹紅注射液可上調腦出血大鼠模型星形膠質細胞Prx1的表達，下調TNF?α和IL?1β等促炎性因子的表達水平，以減輕腦出血后神經炎癥反應［44］。亦有研究顯示，Peroxiredoxin釋放至細胞外即失去抗氧化能力，其可激活TLR2/4信號轉導通路，從而加重神 經 炎 癥 反 應［45?46］。外 源 性Prx1具 有 激 活RAW264.7細胞TLR4/NF?κB信號轉導通路的作用，并分泌TNF?α和IL?6等促炎性因子。腦出血72小時內Prx1表達水平升高，并由凋亡細胞釋放至細胞外，激活TLR4/NF?κB信號轉導通路，使神經炎癥損傷進一步加重［47］；而蒿本內酯及其衍生物則可降低腦出血后Prx1的表達和釋放，抑制TLR4/NF?κB信號轉導通路的激活，減少免疫細胞活化和促炎性因子的分泌，從而改善腦出血后的神經功能缺損［48］。上述研究表明，腦出血后細胞內Prx1產生正向有益作用，而細胞外Prx1介導的TLR4/NF?κB信號轉導通路激活可在繼發(fā)性腦損傷機制中發(fā)揮重要作用。（2）Prx2：在紅細胞內表達豐富。于腦出血大鼠模型尾狀核注射裂解紅細胞可使其腦組織Prx2表達升高，引起腦水腫、血?腦屏障破壞、中性粒細胞浸潤、小膠質細胞活化、神經元死亡和神經功能缺損，而Prx2抑 制劑Conoidin A則可緩解 上 述損傷［49］。腦 出血后，注射Lipocalin?2可促進腦出血小鼠模型Prx2相關中性粒細胞浸潤、小膠質細胞/巨噬細胞活化、神經元凋亡，進而繼發(fā)腦水腫和神經功能缺損，而敲除或敲低Lipocalin?2則Prx2相關性腦損傷程度明顯減輕［50］。目前，尚無Prx3～6在腦出血后 繼發(fā)性腦損傷機制中作用的報道，因此，Peroxiredoxin在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中的作用及機制尚待進一步研究。

五、其他

除上述4種重要DAMP外，還有其他常見DAMP，如HSP、腺苷、IL?33等內源性危險信號分子，近年也有研究探討其在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中的作用。（1）HSP：是一類進化上相對保守的分子伴侶家族，通過調節(jié)應激反應參與腦出血的病理生理學機制［51］。HSP70家族是常見的HSP，采用格爾德霉素上調HSP70表達可以減輕腦出血小鼠模型的神經炎癥反應，降低血?腦屏障損傷，改善其神經功能［52］。葡萄糖調節(jié)蛋白75（GRP75）是HSP70家族成員，誘導腦出血大鼠模型過表達GRP75可以降低促炎性因子的分泌，抑制炎癥反應，減少神經元凋亡，具有神經保護作用［53］。HSP32亦稱為血紅素加氧酶?1（HO?1），其在腦出血繼發(fā)性腦損傷中的作用仍存爭議［54］。動物實驗顯示，通過miRNA?183?5p抑制HO?1表達可減輕腦出血小鼠模型氧化應激和神經炎癥反應，從而改善其神經功能［55］。基于腦出血大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，HO?1可通過調節(jié)磷脂酰肌醇3?激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）信號轉導通路發(fā)揮神經保護作用［56］。在腦出血小鼠模型發(fā)病早期，HO?1可加重神經炎癥反應和氧化應激反應，促進細胞死亡和腦白質損害；至疾病后期，HO?1則促進血腫吸收和血管生成，有利于神經功能的恢復［57］。上述結果提示，HO?1在腦出血病理生理學機制中的作用較為復雜，尚待更多研究深入探討。（2）ATP：腦組織富含ATP，是一類常見的DAMP［58］。腦出血后受損傷的神經細胞釋放ATP，激活嘌呤能P2X7受體并產生信號級聯(lián)反應，最終導致促炎性因子釋放和細胞死亡［59］?；谀X出血小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，P2X7受體水平于腦出血后24小時達到峰值，且主要表達于神經元，P2X7受體激活后可通過細胞外信號調節(jié)激酶1/2（ERK1/2）/NF?κB信號轉導通路加重氧化應激反應［60］；抑制P2X7受體可通過絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號轉導通路限制腦出血大鼠模型繼發(fā)性腦損傷的進展［61］；?；撬峋哂幸种芇2X7受體作用，可緩解腦出血大鼠模型神經炎癥反應，減少神經元凋亡和腦白質損傷［62］。上述研究結果表明，ATP相關信號轉導通路有可能是腦出血的潛在治療靶點。（3）IL?33：屬于IL?1家族成員，可結合其膜受體腫瘤抑制素2（ST2），激活免疫細胞［63］?；谀X出血小鼠模型的研究顯示，IL?33可以減輕腦出血后炎癥反應、細胞凋亡與自噬，緩解腦水腫，具有神經保護作用［64］。Chen等［65］發(fā)現(xiàn)，IL?33能夠促進腦出血大鼠模型小膠質細胞由促炎癥型向抑炎癥型轉變，減輕神經元損傷和腦白質損傷，改善神經功能。

綜上所述，DAMP功能多樣化，與細胞類型密切相關，在腦出血后不同階段可能發(fā)揮不同作用。因此，未來研究有必要進一步深入探討不同類型DAMP在不同階段對不同細胞的作用，同時也有必要開發(fā)針對DAMP的治療策略，以改善腦出血患者預后。

利益沖突無