耿曉東 周英 汪成忠 錢劍林

摘要：連作障礙對牡丹的生長發(fā)育會產生嚴重的影響，根際微生物環(huán)境會對這種改變做出相應的反饋，因此，對連作狀態(tài)下的不同種植年限鳳丹牡丹根際微生物環(huán)境的研究有重要意義。采用Illumina 高通量測序技術，以蘇州地區(qū)的3、6、10年生鳳丹牡丹根際土壤為研究對象，對根際真菌群落進行測序分析，研究真菌ITS rDNA可變區(qū)的豐富度和多樣性指數。測序后不同種植年限根際土中共得到1 020 520條原始序列，序列過濾拼接后可得613 250 條序列（tags）;3組土壤樣品共含有891個分類操作單元（OTUs），涵蓋了5 門、115綱、15目、175 科、230屬、320種菌群;3年生鳳丹牡丹根際優(yōu)勢菌群為球囊菌門（Glomeromycota）、木耳科（Auriculariales）、盤菌科（Pezizaceae）、球腔菌科（Mycosphaerellaceae）;6年生鳳丹牡丹的優(yōu)勢真菌群落主要有肉座菌目（Hypocreales）、鬼傘屬（Coprinopsis）、巢菌科（Nidulariaceae）、黑蛋巢菌（Cyathus）、銀耳目（Tremellales）;10年生鳳丹牡丹的優(yōu)勢真菌群落主要有絲膜菌屬（Cortinarius）、蠟皮馬鞍蠟殼菌（Helvellosebacina）、革菌屬（Thelephora）。α多樣性分析和β多樣性分析均表明，不同種植年限鳳丹牡丹根際土菌群群落多樣性所呈現的規(guī)律為6年生>3年生>10年生。此外還發(fā)現，在連作狀態(tài)下不同種植年限的鳳丹牡丹根際真菌群落多樣性之間有顯著差異，菌群群落多樣性呈先升高后降低的趨勢。

關鍵詞：鳳丹牡丹;多樣性;根際微生物;連作;群落結構

中圖分類號： S685.110.4;S154.3? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）23-0145-07

收稿日期：2021-09-27

基金項目：江蘇省現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項（編號：JATS[2020]340）;江蘇省蘇州市農業(yè)技術應用基礎研究項目（編號：SNG2018052）;蘇州農業(yè)職業(yè)技術學院科技發(fā)展專項（編號：19QN1010、PY2003）。

作者簡介：耿曉東（1979—），男，江蘇揚中人，副教授，主要從事觀賞園藝新品種繁育及產業(yè)化推廣研究。E-mail：7587633@qq.com。

通信作者：錢劍林，教授，主要從事花卉新品種選育及產業(yè)化示范推廣。E-mail：qianjl03@126.com。

鳳丹牡丹（Paeonia ostii）即楊山牡丹，屬于林下小灌木，是當前油用牡丹的重要品種。目前，鳳丹牡丹和紫斑牡丹（P. rockii）在我國牡丹油用方面表現突出。牡丹籽油中含有豐富的亞麻酸等不飽和脂肪酸[1-2]，以及白藜蘆醇等藥用成分[3-4]，具有抑制癌細胞、降低血脂、改善神經功能等功效[5-6]。油用牡丹種植區(qū)域的擴增與栽植時期的延長，使得植株的生長活力逐年減弱，此外，還會導致植株死亡。如果在種植過牡丹植株的土壤中再次種植牡丹，所種植的牡丹會出現生長緩慢、根系不發(fā)達等現象[7]，可見連作障礙已對油用牡丹產業(yè)發(fā)展產生了嚴重的限制作用。

根際土壤微生物在植物生長發(fā)育階段具有重要作用，可對植物生長和土壤狀況產生影響[8]。其中，植物體內的內生菌在植物生長過程中具有促進作用，同時也改善了某些天然產物的品質[9-10]。內生菌與植株長時間共同進化后，對生態(tài)學功能有所保留，或對子代賦予了某些功能特性[11]。有研究表明，微生物群落結構的改變會影響牡丹的生長和土壤酶活性。例如，郭麗麗等發(fā)現，根際土壤的微生物結構功能的不平衡會引起植物的連作障礙，產生不利的影響[12]。韓繼剛等的研究顯示，根際的多黏類芽孢桿菌可以對鳳丹牡丹的生根發(fā)芽和幼苗的生產發(fā)育起到促進的作用[13]。鄭艷等的研究結果表明，牡丹中的某些藥用成分或許與微生物之間有一定的關聯(lián)[14]。史冬燕等的研究表明，根際微生物活性明顯比非根際土壤微生物的活性高[15]。這些學者的研究大部分集中在藥用、油用以及其他方面，而在自然環(huán)境中，研究鳳丹牡丹微生物的特點相對困難。因此，本試驗利用Illumina高通量測序技術對3個不同種植年限的鳳丹牡丹根際微生物進行研究，探討其組成特征，以根際微生態(tài)角度分析不同種植年限鳳丹牡丹根際狀態(tài)下真菌群落結構及其多樣性變化，從而闡明連作后鳳丹牡丹根際真菌群落結構的變化規(guī)律，為解決鳳丹牡丹連作障礙提供科學依據，并為推動中國油用牡丹產業(yè)化發(fā)展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本試驗于蘇州農業(yè)職業(yè)技術學院（30°52′14. 28″N，118°1′13.39″E）進行，該區(qū)域屬亞熱帶季風型大陸氣候，海拔為 210～230 m，年均氣溫在 15.6? ℃ 左右，年均降水量為 620 mm，主要的土壤為褐土。分別設置不同時期栽培的油用牡丹，長期觀察栽培時間對鳳丹牡丹產生的影響。

1.2 試驗材料

供試土壤取自蘇州農業(yè)職業(yè)技術學院鳳丹牡丹栽培基地。選取種植年限分別為3、6、10年的油用鳳丹牡丹根際土壤作為本試驗的研究對象，在種子收獲期（2020年8月）取樣。依照五點取樣法，以隨機挑選的方式在3個種植年限中各選取3株生長狀況相同的植株（每處理3個重復）。每株植株都以主莖為中心，在半徑長度為30～40 cm的范圍內進行取樣，取樣深度為0～20 cm，用四分法將取出的土壤混勻，去除土壤表面的雜質后，再將該土壤樣品進行分裝，放入標記好的相應無菌牛皮紙袋中，置于冰盒中保存，并迅速帶回實驗室進行后續(xù)處理。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤微生物基因組DNA提取及質量檢測 用FastDNA SPIN Kitfor Soil（USA）試劑盒對3個種植年限的15個土壤樣本提取總DNA;2%瓊脂糖電泳和 Agilent 2100 Bioanalyzer 用于檢測 DNA 樣品的降解程度和樣品中存在的雜質;利用NanoPhotometer（ IMPLEN，德國） 分光光度計對DNA 樣品純度進行測定;Qubit 2.0 Flurometer 用于檢測 DNA 樣品濃度;DNA 樣品置于-20 ℃ 保存，供后續(xù)使用。

1.3.2 PCR 擴增細菌 在ITS rRNA 基因ITS1-ITS2可變區(qū)中選取 20 ng 土壤基因組 DNA 作為模板，使用TaKaRa EX-tag酶，ITS rRNA 基因ITS1可變區(qū)ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2 （5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）作為引物，擴增ITS rRNA基因序列ITS1高變區(qū)，富集目的片段。

1.3.3 ITS rRNA 文庫質檢及測序 文庫構建結束后，Qubit 2. 0被用來對完成的文庫進行初步的定量分析;文庫被稀釋到1 ng/μL，然后用Agilent 2100檢測庫的片段大小。如果片段大小與預期結果一致，則用Bio-RAD CFX 96熒光定量PCR儀進行實時熒光定量（qPCR），以準確量化文庫的有效濃度，從而確保文庫的質量。檢測合格的文庫運用 Illumina MiSeq 對 ITS rRNA 基因序列的ITS1區(qū)進行高通量測序。

1.3.4 信息分析流程 在測序序列中，低質量的堿基和拼接污染序列被清除，并對數據進行過濾以獲得可信的目標序列;針對會出現末尾重疊的狀況，運用算法PEAR對雙端測序序列拼合連接;得到的標簽和分類操作單元（OTUs）序列進行比較，把相似度高于97% 的序列當作同一種類型的 OTUs，隨后進行物種識別。運用軟件QIIME 1. 8. 0對拼接后的序列進行 OTUs 交疊分析、聚類分析、系統(tǒng)發(fā)生樹構建、α多樣性、β多樣性等相關分析。

2 結果與分析

2.1 土壤樣品測序深度評估

油用鳳丹牡丹根際真菌ITS rRNA 測序共獲得5 102 600條序列，最終轉化為1 020 520 條原始測序序列，共 230.20 Mb 原始序列片段，對原始序列片段進行過濾，即除去接頭污染、劣質序列和N含量高于5%的序列，過濾結束后得到180 Mb有效序列（Clean reads），其中各個樣品中平均有40 200條，數量范圍為36 825～42 663 條。運用Q30 堿基百分比的統(tǒng)計方式對有效序列的質量進行統(tǒng)計，統(tǒng)計結果的指標越高則表明測序堿基中錯誤率低于0.1%的堿基所占的比例越大。全部樣本的統(tǒng)計Q30堿基百分比的指標結果都在90%附近，即測序有效序列錯誤率都低于0.1%，用以建庫質量較高。此外，Q30堿基在每個樣本中所占的比例都相差不大，說明過濾后的樣本所具有的均一性效果好。對序列雙末端重疊連接后進行測序，測序后出現 331 252 條序列（tags），平均大小為425 bp。

2.2 不同種植年限油用鳳丹牡丹根際土壤真菌OTUs

OTU 是便于分析的假定分類單位，本試驗將相似性高于97%的有效序列歸為一類，9個樣本共獲得891個OTUs，其中移栽后3年生牡丹根際土壤樣本中有629 個OTUs，6年生牡丹根際土壤樣本中有678 個OTUs，10 年生牡丹根際土壤樣本中有731個OTUs （圖1）。從韋恩圖（圖1）可以看出，不同年限共有OTU 357個，占總數的40.1%;Y3獨有的OTU數量為20個，占總數的2.2%;Y6獨有的OTU數量為40個，占總數的4.5%;Y10獨有的OTU數量為52個，占總數的5.8%。

2.3 不同種植年限油用鳳丹牡丹根際土壤真菌物種豐度聚類

依照所有樣本在科級的物種注釋和豐度信息，選取每個樣本中豐度最高的25科及其豐度信息來繪制熱圖。依據分類信息以及各樣本間的差異程度來聚類，并找出樣本中聚集性更強的物種（圖2）。研究結果顯示，在同一種植年限內，鳳丹和牡丹的根際真菌樣品幾乎都匯集一塊，由此可見樣品間的重復性較好。其中，10年生鳳牡丹的3個樣本集中到一個分支，與其他年份的分支距離較遠，表明它們之間的菌群豐度存在顯著差異。此外，從整體上來看，土壤真菌菌群豐度隨種植年限的增加而減少，可見不同種植年限的鳳丹牡丹根際真菌菌群多樣性之間存在差異。

2.4 不同種植年限油用鳳丹牡丹根際土壤真菌群落結構組成

15 個不同種植年限油用牡丹根際土壤樣本的真菌群落微生物多樣性的整體分布結果顯示： 3年生鳳丹牡丹的優(yōu)勢真菌群落主要由球囊菌門（Glomeromycota）、木耳科（Auriculariales）、盤菌科（Pezizaceae）、球腔菌科（Mycosphaerellaceae） 等門類構成（圖3）;6年生鳳丹牡丹的優(yōu)勢真菌群落主要有肉座菌目（Hypocreales）、鬼傘屬（Coprinopsis）、巢菌科（Nidulariaceae）、黑蛋巢菌屬（Cyathus）、銀耳目（Tremellales）;10年生鳳丹牡丹的優(yōu)勢真菌群落主要有絲膜菌屬（Cortinarius）、蠟殼菌（Helvellosebacina）、座革菌屬（Thelephora）。這說明不同栽培年限的鳳丹牡丹真菌的優(yōu)勢群落差異顯著，長期栽培會導致土壤真菌組成發(fā)生顯著改變。

由圖4可知，中心優(yōu)勢菌種以擔子菌門（45.8%）、子囊菌門（35.5%）、被孢霉門（12.4%）、球囊菌門（9.5%）為主。其中，3、6年生鳳丹土壤真菌門主要以子囊菌門和提子菌門為主，而10年生土壤真菌門主要以擔子菌門為主，另外3年生土壤真菌的球囊菌門要顯著高于種植6、10年生期鳳丹土壤。

3個種植年限鳳丹牡丹根際真菌群落在屬水平上的組成和優(yōu)勢菌屬所占比例差異顯著，去除未分類的真菌屬，所占比例較高的主要隸屬于10個真菌屬，所占比例達到40%以上。其中絲蓋傘屬（Inocybe）、被孢霉屬（Mortierella）、裂殼屬（Schizothecium）、Tausonia、鐮刀菌屬（Fusarium）、赤霉菌屬（Gibberella）為屬水平上的優(yōu)勢菌（圖5）。

2.5 不同種植年限油用鳳丹牡丹根際土壤真菌群落多樣性

α多樣性是反映豐富度和均勻度的綜合指標，其中，香農指數（Shannon指數）可對群落物種組成的均勻度進行評價，物種數（Sobs）和趙氏指數 （Chao1指數）可以很好地反映群落物種的豐富度。3個種植年限的油用鳳丹牡丹根際土壤樣本中的α多樣性指數均出現顯著差異。其中，從圖6可以看出，土壤真菌Ace、Chao1、Sobs豐富度指數均表現為6年生與10年生之間差異顯著，而土壤真菌Shannon多樣性指數表現為3年生與10年生、6年生與10年生差異顯著。10年生的鳳丹土壤真菌Ace、Chao1、Sobs豐富度指數最小，而6年生最高;Shannon多樣性指數則表現為3年生最高、10年生最低（圖6）。

由圖7的主成分分析可看出，PC1和PC2分別解釋方差為土壤真菌群落組成的52.65%和12.54%，共解釋65.19%。Adonis分析顯示，不同種植年限土壤真菌群落結構差異顯著（R2=0.882 5，P<0.05）。在PC1軸上可以看出，3年生和6年生土壤真菌群落結構相似度較高，而與10年生的土壤真菌差異顯著。

3 討論

連作障礙通常指某一植物或近緣植物在相同的地域上連續(xù)種植多年后，表現為生長狀況差、病蟲害嚴重、減產、品質差的現象[16]。連作障礙引起產量下降的重要原因是隨著種植年限的增加，植物根際分泌物和植物殘體逐年積累，導致土壤微生物區(qū)系紊亂[17]。根際微生態(tài)系統(tǒng)失衡會刺激土傳病原菌大量繁殖，還會對有益拮抗劑的生長起抑制作用，導致植物生長狀況差，從而對產量和品質的形成產生影響[18]。

根際是指植物根系周圍的土壤區(qū)域，該部分土壤受到根系分泌物的施加作用較小，其理化性質和生物活性與原土體有顯著差異[19]。在根系分泌物的影響下，該區(qū)域微生物的功能結構也會有所變化，引起牡丹連作障礙形成的主要是由于根際微生物群落的結構失調[20]。牡丹根系所分泌出的物質會影響微生物的生長代謝，從而影響根系土壤的理化性質，對根系微生物種群結構產生影響[15]。

在種植多年的牡丹區(qū)域中再栽培牡丹植株時，牡丹種苗在生長發(fā)育階段會出現生長效率逐年減慢，根系和植株生長狀況不好、病蟲害嚴重等連作障礙所引起的現象。如今連作障礙對牡丹產業(yè)的成長和進化影響重大，具有極其復雜的形成過程和加重機制，尤其在根際微生物群落結構方面最為重要[21]。

隨著分子生態(tài)學技術的蓬勃發(fā)展，對植物根際真菌區(qū)系結構的研究技術也隨之發(fā)展，如克隆測序技術、變性梯度電泳、溫度梯度電泳、高通量測序技術和擴增18S rDNA 限制性分析。在本研究中共得到1 020 520條優(yōu)質序列，這些序列足以代表樣本中的鳳丹牡丹根際土壤菌群，從而有效地反映出其微生物種類和結構。對本試驗中的數據分析后可得到891個OTUs，涵蓋了5 門、115綱、15目、175 科、230屬、320種菌群。對不同種植年限鳳丹牡丹根際菌群群落豐度對比分析可看出，根際效應在不同的真菌中有明顯的差異。隨著土壤中的有益微生物數量的不斷減少，某些病原菌數量也因此逐年增加，則導致連作狀態(tài)下的鳳丹牡丹生長發(fā)育速度逐漸減慢。

物種多樣性為群落的一個重要特征，而對比2個群落中的某物種的豐富度指數是比較群落物種多樣性最便捷的方法。但是，物種多樣性具有二元性，物種豐富度可能會產生誤導，因此常用綜合指標——多樣性指數來衡量物種多樣性。多樣性指數常由多種計算方式所得出，其中物種豐富度、香農指數、辛普森多樣性均是計算多樣性指數最常使用的方法。目前，牡丹根際微生物的相關研究結果均顯示，牡丹根際真菌多樣性會由于種植年限的過長而降低。在本研究中，4種指標的結果都呈現拋物線的變化趨勢，即隨著種植年限的增加，根際菌群多樣性先升高后降低，其中在連作10年時的多樣性水平最高 （圖7），4種指標的結果趨勢與OTUs 一致。由此可見，連作會影響鳳丹牡丹植株和其根際微生物之間的作用效果，改變有益菌和病原菌在土壤中占比，從而引起失衡。

本試驗運用Illumina 高通量測序技術，對3個種植年限的鳳丹牡丹根際真菌群落結構及相對豐度的變化規(guī)律進行探討。結果表明，在連作狀態(tài)下，鳳丹牡丹根際土壤中菌群群落會發(fā)生改變，其中真菌數量和群落多樣性指數均隨著種植年限的延長呈現先升高后降低的趨勢;根際土壤中的菌群結構出現變化，不同種植年限鳳丹牡丹土壤中的微生物菌群都擁有高特異性，但關鍵優(yōu)質菌群幾乎沒有變化;在不同分類群中發(fā)現了不同種植年限的優(yōu)勢菌群，但這些菌株的大量存在引起的根際微環(huán)境的變化仍需進一步探討。

4 結論

鳳丹牡丹長期的連作種植會導致土壤真菌豐富度和均勻度發(fā)生顯著改變，特別是在種植10年的土壤中真菌豐富度和均勻度均顯著下降，這說明鳳丹的長期連作會對土壤真菌α多樣性產生不利的影響。而連作10年以上會造成土壤真菌β多樣性也發(fā)生顯著改變。

油用牡丹根際土壤樣本的真菌群落主要包括球囊菌門（Glomeromycota）、木耳科（Auriculariales）、盤菌科（Pezizaceae）、球腔菌科（Mycosphaerellaceae）、肉座菌目（Hypocreales）、鬼傘屬（Coprinopsis）、巢菌科（Nidulariaceae）、黑蛋巢菌（Cyathus）、銀耳目（Tremellales）、絲膜菌屬（Cortinarius）、蠟皮馬鞍蠟殼菌（Helvellosebacina）、革菌屬（Thelephora）。這說明不同栽培年限的鳳丹牡丹真菌的優(yōu)勢群落差異顯著，長期的栽培會導致土壤真菌組成發(fā)生顯著改變。

可見，油用鳳丹牡丹根際微生物對土壤根際微環(huán)境十分重要。根際真菌的多樣性和根際分泌物對根際微生物所產生的影響有待探討。本研究結果可為解決牡丹連作障礙提供一定的數據支撐。

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