宣富君 王坤 曹佳欣 付龍龍 張建光 潘建林 管衛(wèi)兵 成永旭

摘要：種質退化是當下河蟹產業(yè)健康發(fā)展所面臨的重要課題之一，目前科研單位和養(yǎng)殖戶逐步認識到選用大規(guī)格親本（雄性：≥ 200 g;雌性：≥ 150 g）所育苗種在后續(xù)成蟹養(yǎng)殖上的優(yōu)勢，紛紛推薦和選用大規(guī)格親本苗種，但其潛在的分子機制尚不清楚。本研究首次基于卵巢比較轉錄組（大規(guī)格與一般規(guī)格）探討中華絨螯蟹大規(guī)格親本潛在的分子優(yōu)勢。結果表明：2組共檢測到8 772個差異表達基因（5 307個上調，3 465個下調），其中43個常見差異基因出現在與生殖、免疫和生長相關的15條通路中。經qRT-PCR驗證，對其中9個相關基因（包括TRINITY_DN13931_c0_g1、TRINITY_DN1908_c0_g2和TRINITY_DN6686_c0_g1）開展進一步研究。這些被證實的常見差異表達基因主要富集于細胞凋亡、胰島素信號和mTOR信號等途徑。為進一步探討利用大規(guī)格親本遺傳育種奠定了重要的分子基礎，并在生長、繁殖和免疫方面指出了利用大規(guī)格親本育苗潛在的分子優(yōu)勢，不僅可以豐富甲殼動物繁育生物學的基本理論，而且可為今后河蟹大規(guī)格優(yōu)質苗種的推廣提供必要的理論支撐。

關鍵詞：中華絨螯蟹;大規(guī)格親本;育苗;轉錄組;分子機理

中圖分類號： S968.25? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）23-0166-07

收稿日期：2021-08-01

基金項目：江蘇省種業(yè)振興“揭榜掛師”專項（中華絨螯蟹種質資源）;江蘇現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項（編號：JATS[2020]362）;寧夏自治區(qū)科技廳重點項目（編號：2020ZDYF0860）;江蘇省科技廳省政策引導類計劃-蘇北科技專項（編號：SZ-YC202041）;江蘇省產學研項目（編號：BY2020587）。

作者簡介：宣富君（1981—），男，浙江紹興人，博士，副研究員，主要從事甲殼動物生殖生物學研究。E-mail：swimming_crab@126.com。

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）別稱河蟹、大閘蟹，是我國重要的經濟水產物種。得益于20世紀70年代河蟹人工育苗技術的突破[1]和土池育苗技術的推廣應用[2]，目前河蟹養(yǎng)殖已經遍布全國31個?。ㄊ?、自治區(qū)），包括臺灣[3]和西藏自治區(qū)[4]。河蟹養(yǎng)殖產量從2000年的23萬t增加到2018年的75萬t[5]，產值近500億元，被稱為特種水產養(yǎng)殖業(yè)中的“奇葩”，超過世界其他經濟蟹類養(yǎng)殖和捕撈總和[6-7]。

種質退化是當下河蟹產業(yè)健康發(fā)展所面臨的重要課題之一。育苗單位曾盲目追求經濟利益和降低生產成本，無序引進其他各大水系的苗種及采用小規(guī)格親本用于苗種生產，造成商品蟹形狀退化，規(guī)格小，養(yǎng)殖效益低下[8]。獲取高質量的親本是河蟹育苗成功的關鍵[6]。近幾年在科研單位的積極引導下，越來越多的育苗單位和養(yǎng)殖戶認識到選用大規(guī)格親本（雄性：≥200 g;雌性：≥150 g）苗種在后續(xù)養(yǎng)成優(yōu)質商品蟹上的優(yōu)勢。例如，從不同規(guī)格親本的繁殖性能和育苗效果看，大規(guī)格親本的抱卵量、生殖力和產卵量明顯高于其他規(guī)格。雖然不同規(guī)格親本的胚胎大小無明顯差異，但研究表明大規(guī)格親本所產子代可以遺傳其生長速度快的優(yōu)良性狀，大規(guī)格親本所產大眼幼體的售價也往往高于普通大眼幼體[8-9]。在大眼幼體養(yǎng)成扣蟹階段，大規(guī)格親本苗種明顯生長快，營養(yǎng)狀況好，性能上更適合成蟹養(yǎng)殖[10-11]。更為重要的是，實踐證明大規(guī)格苗種在成蟹養(yǎng)殖階段可以顯著提高河蟹的規(guī)格，產出更高比例的優(yōu)質商品蟹，效益增加明顯[12]。然而，與其他水產經濟物種相比，中華絨螯蟹在種質資源機理方面的研究相對滯后，大規(guī)格親本育苗潛在優(yōu)勢分子機制方面的研究至今尚未見報道。

本研究擬通過對發(fā)育成熟的大規(guī)格雌性親本（約 250 g）與一般規(guī)格（約100 g）的卵巢組織進行轉錄水平的高通量測序，并從生長發(fā)育、繁殖及免疫性能等方面進行相關基因的差異表達分析，進而探討大規(guī)格親本育苗潛在的分子優(yōu)勢。本工作不僅可以豐富甲殼動物繁育生物學的基本理論，而且可以為今后開展中華絨螯蟹的遺傳育種及河蟹育苗產業(yè)推廣普及大規(guī)格親本提供必要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣本獲取

2020年11月30日，從江蘇大仁水產良種有限公司鹽城射陽育苗基地（120.455°E、33.886°N）獲取大規(guī)格雌性親本3只[（248.60±3.12） g，F-O-D 組]，一般規(guī)格3只[（102.87±1.52） g，F-O-Z組]，分別暫養(yǎng)于鹽城師范學院濕地學院配備的從大連匯新公司定制室內可控養(yǎng)殖系統(tǒng)的水桶內。3 d 后，待河蟹適應環(huán)境，個體經冰浴麻痹后迅速解剖;取出的卵巢組織分別放入2 mL凍存管，經液氮冷卻，最終儲存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2 RNA提取及測序

使用TRIzol 試劑盒（TaKaRa公司）提取不同卵巢樣本中的總RNA，之后通過Agilent 2100 Bioanalyzer （美國）（D260 nm/D280 nm為1.8～2.2）和 15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳進行質檢（28S rRNA/18S rRNA>1.0）。樣品質檢合格后，用干冰保護并送往上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司測序。過程簡述如下：使用用于Illumina（美國馬薩諸塞州新英格蘭生物實驗室）的TruSeqTM RNA樣品制備試劑盒構建總RNA（5 μg/樣品）的逆轉錄cDNA文庫。然后，經修復末端修飾處理后，通過15個修復鏈式反應周期擴增cDNA。最后，采用配對末端法的Illumina HiSeq 4000平臺用于cDNA簇測序[13]。

1.3 RNA-seq數據的預處理

Raw reads的質量控制是根據FastqStat.jar工具軟件（1.0版本）實現的：（1）去除5′端含有非AGCT的條形碼序列和堿基;（2）消除N>10%的成對讀數;（3）排除Q<20的堿基的低質量讀數;（4）排除長度小于25 bp的讀數。Clean reads的質量控制是參照FastQC（0.11.4版本）軟件執(zhí)行的[14]。

1.4 轉錄組組裝與基因表達分析

Trinity是一種基于Illumina短片段序列（Clean reads）的無參考基因組的從頭組裝軟件[15]。在本研究中，利用Trinity Assembler（2.6.6版本）軟件完成從Illumina平臺獲取序列的de novo組裝，并在Trinity中使用ORF方法進行基因預測。然后，基于RNA-seq數據量化軟件Kallisto（0.43.1版本），對不同樣本中的基因表達水平進行定量分析[16]。

1.5 樣品間的關聯(lián)分析

為調查不同樣本，尤其是重復樣本之間的相關性，本研究進行了樣本間的關聯(lián)分析。此外，利用主成分分析（PCA）根據樣本聚類的表達情況進一步識別大樣本的影響。

1.6 差異表達基因（DEGs）分析

使用edgeR（3.24版本）對2組之間的基因進行差異表達分析[17]。選擇錯誤發(fā)現率（FDR）<0.05和| log2差異倍數（FD）|>1作為DEGs調查的截止閾值。結果通過火山圖和散點圖可視化。然后，利用plot_cluster_exp（1.1.0版本）軟件中的距離算法（樣本間：Spearman相關系數;基因間：Pearson相關系數）進行DEGs的聚類分析，揭示具有相同或相似表達模式的基因。聚類結果通過熱圖可視化。

1.7 基于文獻檢索的常見差異表達基因（co-DEGs）探索

通過文獻數據庫檢索篩選與生殖、生長和免疫相關的途徑和富集基因。本研究檢索的電子文獻數據庫，包括Embase、PubMed和Cochrane。此外，在本研究中，這些途徑中富集的基因與DEGs交叉，可獲得與生殖、生長和免疫反應相關的co-DEGs。

1.8 qRT-PCR驗證

為了篩選與測序結果趨勢相同的DEG，對9個FC較高的co-DEG進行基于qRT-PCR的定量驗證。過程簡述如下：使用TRIzol試劑（Invitrogen 公司，美國）從每組樣品中提取并定量總RNA（10 μL），并使用SYBR Green PCR Mastermix（Applied Biosystems公司，美國）進行反轉錄。然后，在ABi PrisMR 7500序列檢測系統(tǒng)（Applied Biosystemg公司，美國）協(xié)助下進行qRT-PCR驗證。以ACTB基因為參考。擴增-轉錄反應條件如下：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，40個循環(huán)，60 ℃下 34 s;在每個延長周期的終點，獲得信號，然后研究放大曲線。表1列出了引物序列，而目標基因的相對表達計算過程則參考2-ΔΔCT方法[18]。

1.9 通路富集分析

本研究利用go_enrichment（2.1.0版本）軟件，進一步對已得到驗證的co-DEG開展京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析[19-20]。其中，P<0.05被認為是KEGG通路顯著富集的截止值。

2 結果與分析

2.1 樣本間關聯(lián)分析

在質量控制和數據預處理后，將測序數據納入F-O-D組和 F-O-Z 組之間進行關聯(lián)分析，以檢驗試驗的可靠性和樣本選擇的合理性。PCA分析表明，2組間的樣本以分散的方式分布，而組內的樣本則聚集在一起（圖1）。相關聚類熱圖顯示，參與本研究的樣本的相關性很高（圖2）。

2.2 差異表達基因（DEGs）分析

根據DEGs測序數據，在F-O-D組和 F-O-Z 組之間共發(fā)現5 307個上調基因和3 465個下調基因。DEGs分析結果的火山圖如圖3-A所示，它直接指示了不同組中樣本之間基因的相對表達值。所有這些DEGs的散點圖如圖3-B所示。此外，對樣本中的基因表達模式進行聚類分析顯示，樣本中的基因表達模式存在明顯差異（圖4）。

2.3 常見差異表達基因（co-DEGs）調查及qRT-PCR驗證

根據文獻檢索，共有7條生殖相關途徑（視黃醇代謝、細胞周期、mTOR信號通路、Wnt信號通路、胰島素信號通路、卵巢類固醇生成和孕酮介導的卵母細胞成熟），4條生長相關途徑（mTOR信號通路、PI3K-Akt信號通路、Wnt信號通路、TGF-β信號通路）和7條免疫相關途徑[細胞周期、溶酶體、內吞、吞噬體、凋亡、細胞粘附分子（CAMs）和自然殺傷細胞介導的細胞毒性]被篩選出來。這15條途徑（去除重疊途徑后）中共富集338個基因，結合本研究調查的DEGs，找到43個與這些生殖、免疫和生長途徑相關的co-DEGs。最后， qRT-PCR驗證了其中9個co-DEG（TRINITY_DN6686_c0_g1、TRINITY_DN6296_c2_g1、 TRINITY_DN2026_c1_g1、TRINITY_DN1908_c0_g2、TRINITY_DN605_c0_g2、TRINITY_DN2717_c0_g1、TRINITY_DN608_c5_g1、TRINITY_DN13931_c0_ g1和TRINITY_DN35647_c0_ g1），結果顯示其均與測序結果趨勢一致（圖5）。

2.4 驗證co-DEGs的富集分析

對上述9個經qRT-PCR驗證的co-DEGs開展KEGG富集分析（表2），結果表明，這些DEGs主要富集于細胞凋亡（ko04210，基因：TRINITY_DN13931_c0_g1、TRINITY_DN1908_c0_g2和TRINITY_DN6686_c0_g1）、胰島素信號通路（ko04910，基因：TRINITY_DN13931_c0_g1、TRINITY_DN2717_c0_g1和TRINITY_DN608_c5_g1）和mTOR信號通路（ko04150，基因：TRINITY_DN13931_c0_g1和TRINITY_DN2717_c0_g1）。

3 討論

目前河蟹育苗使用大規(guī)格親本已成為行業(yè)發(fā)展的新趨勢，但其潛在的分子優(yōu)勢仍不清楚。本研究首次基于卵巢比較轉錄組分析，共檢測到8 772個DEGs（其中5 307個上調，3 465個下調），而所有這些DEGs與文獻報道的15條跟生殖、生長和免疫相關通路中的338個基因整合時，共檢索出43個co-DEGs。經過qRT-PCR驗證，最終對其中9個co-DEGs，包括TRINITY_DN13931_c0_g1、TRINITY_DN1908_c0_g2和TRINITY_DN6686_c0_g1進行了富集通路分析，結果表明這些co-DEGs主要富集在胰島素信號通路（生殖相關）、mTOR信號通路（生長相關）和細胞凋亡（免疫相關）等途徑中。

胰島素信號與生殖之間的密切關系已在蠕蟲和昆蟲的身體發(fā)育中得到揭示[21-22]，而控制個體規(guī)格大小涉及包括胰島素在內的多條生長調節(jié)通路[23]。先前的一項研究表明，類胰島素性腺激素基因廣泛參與雌性青蟹（Scylla paramamosain）的生殖過程[24]。通過轉錄組測序，目前已在甲殼動物物種中鑒定出多個參與胰島素信號通路的類胰島素肽[25]。重要的是，雌性蟹已被認為是研究蟹類胰島素肽生物學功能的重要載體[26]。例如，胰島素在雌性青蟹卵黃發(fā)生和卵母細胞成熟中的抑制作用是通過某些信號途徑實現的，如自分泌和旁分泌[21]。有趣的是，刺激卵黃蛋白原的表達則是通過蟹體內的胰島素實現的[25]。這些胰島素相關蛋白，包括類胰島素肽，不僅參與卵巢發(fā)育[26]，還逆向調節(jié)葡萄糖代謝并參與中華絨螯蟹的抗病原體感染過程[27]。

mTOR是磷脂酰肌醇3-激酶相關激酶家族的成員，調節(jié)包括生長控制在內的各種生物過程[28]。其中，mTOR通路在動物發(fā)育、壽命和幼蟲發(fā)育的調節(jié)過程中，與胰島素信號通路直接相關[29]。由于甲殼類動物必須定期脫落外骨骼才能發(fā)育和生長，因此調節(jié)生長和蛻皮的mTOR信號通路已被人們廣泛研究[30]。已經證明，mTOR信號通路相關基因的表達有助于地蟹（Gecarcinus lateralis）的生長，參與幼體熱適應過程中的蛻皮調節(jié)[31]。此外，mTOR通過整合內在信號（蛻皮激素）和外在信號（熱應激）來調節(jié)十足甲殼動物的蛻皮和生長。蛻皮腺是十足目甲殼動物類固醇激素產生和蛻皮周期調節(jié)的來源，對蟹的外部環(huán)境和內部生理信號都有反應[30]。在蟹等甲殼類動物中，mTOR的活性直接或間接控制著蛻皮腺驅動相關基因的轉錄[32]。

凋亡通路已被證明參與免疫過程[33]。最近，在青蟹中發(fā)現了效應caspase，如Sp-caspase，它表現出免疫反應和細胞凋亡[34]。在蟹類中，細胞凋亡可以誘導血細胞的活性，而血細胞在受到病原菌刺激后，在抵御病原菌入侵方面起著至關重要的作用[35]。對于中華絨螯蟹之前的一項研究表明，通過某些蛋白（如Es IAP1）減少凋亡，可以調節(jié)細胞在生長過程中的活性[36]。最近的轉錄組分析發(fā)現，中華絨螯蟹在生長過程中，由于各種因素（如肝胰腺壞死疾?。?引起的生長抑制和存活率降低均與細胞凋亡顯著相關[37]。重要的是，凋亡通路中的nm23和caspase等基因參與了中華絨螯蟹個體生長過程中對不利環(huán)境的抵抗[38-39]。因此，中華絨螯蟹大規(guī)格親本可能通過細胞凋亡的基因表達表現出較強的環(huán)境抗逆性，進而有利于自身及繁育后代在養(yǎng)殖過程中表現出優(yōu)勢。在本研究中該通路共涉及3個已驗證的co-DEGs，分別為TRINITY_DN13931_c0_g1、TRINITY_DN1908_c0_g2和TRINITY_DN6686_c0_g1。這些co-DEGs在細胞凋亡、胰島素信號和mTOR信號通路中亦有富集。因此進一步推測，TRINITY_DN13931_c0_g1、TRINITY_DN1908_c0_g2和TRINITY_DN6686_c0_g1富集的細胞凋亡、胰島素信號通路和mTOR信號通路可能與大規(guī)格親本繁育優(yōu)勢有關。

4 結論

本研究為進一步探索大規(guī)格親本在中華絨螯蟹育種中的優(yōu)勢奠定了重要的分子基礎，相關數據已上傳NCBI（登入號：PRJNA669606）。通過基于卵巢比較轉錄組差異表達基因分析，首次探討了利用大規(guī)格親本在生長、繁殖、免疫等方面潛在的分子優(yōu)勢。其中，凋亡通路、胰島素信號通路和mTOR信號通路可能在中華絨螯蟹大規(guī)格親本的優(yōu)勢育種中發(fā)揮重要作用。

參考文獻：

[1]趙乃剛. 河蟹育苗工廠化的進展[J]. 漁業(yè)現代化，1979，6（1）：34-35.

[2]韓炳炎. 河蟹養(yǎng)殖高產技術問答[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，1996.

[3]虞麗娟，楊勁松，凌培亮，等. 基于物聯(lián)網智慧服務的中華絨螯蟹蟹種質量動態(tài)追溯系統(tǒng)研究[J]. 水產學報，2013，37（8）：1262-1269.

[4]陳 偉，王 春，楊印蹼，等. 中華絨螯蟹在西藏高原條件下越冬期生化組分的變化[J]. 上海海洋大學學報，2014，23（5）：733-740.

[5]張顯良. 中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，2019.

[6]Cheng Y X，Wu X G，Yang X Z，et al. Current trends in hatchery techniques and stock enhancement for Chinese mitten crab，Eriocheir japonica sinensis[J]. Reviews in Fisheries Science，2008，16（1/2/3）：377-384.

[7]Wang Q D，Liu J S，Zhang S Y，et al. Sustainable farming practices of the Chinese mitten crab （Eriocheir sinensis） around Hongze Lake，Lower Yangtze River Basin，China[J]. Ambio，2016，45（3）：361-373.

[8]王少兵，劉乃更，姜曉東，等. 三種親本規(guī)格河蟹土池育苗的試驗總結[J]. 科學養(yǎng)魚，2019（6）：12-13.

[9]茅海成，王高龍，楊永超，等. 中華絨螯蟹不同規(guī)格親蟹池塘生態(tài)育苗效果的生產性評估[J]. 水產科技情報，2014，41（5）：233-236.

[10]陳軍偉，馬旭洲，王 武，等. 不同規(guī)格中華絨螯蟹母本子代的生長特性比較[J]. 動物學雜志，2016，51（5）：895-906.

[11]何先林，姜曉東，王海寧，等. 池塘養(yǎng)殖不同規(guī)格中華絨螯蟹扣蟹生化組成的比較研究[J]. 水產科技情報，2019，46（6）：316-319，323.

[12]張紅水. 大親本蟹苗養(yǎng)殖試驗研究[J]. 鄉(xiāng)村科技，2018（4）：110-111.

[13]Ran M L，Chen B，Li Z，et al. Systematic identification of long noncoding RNAs in immature and mature porcine testes[J]. Biology of Reproduction，2016，94（4）：77，1-9.

[14]Andrews S. Babraham bioinformatics-FastQC a quality control tool for high-throughput sequence data[EB/OL]. [2021-06-20]. https：//www. bioinformatics. babraham.ac.uk/projects/fastqc/.

[15]Bankar K G，Todur V N，Shukla R N，et al. Ameliorated de novo transcriptome assembly using Illumina paired end sequence data with Trinity Assembler[J]. Genomics Data，2015，5：352-359.

[16]Du Y H，Huang Q H，Arisdakessian C，et al. Evaluation of STAR and kallisto on single cell RNA-seq data alignment[J]. Genes，Genomes，Genetics，2020，10（5）：1775-1783.

[17]Robinson M D，McCarthy D J，Smyth G K.edgeR：a bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data[J]. Bioinformatics，2009，26（1）：139-140.

[18]Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[19]Consortium G O.The Gene Ontology （GO） database and informatics resource[J]. Nucleic Acids Research，2004，32（S1）：D258-D261.

[20]Kanehisa M，Goto S. KEGG：kyoto encyclopedia of genes and genomes[J]. Nucleic Acids Research，2000，28（1）：27-30.

[21]Bao C C，Yang Y N，Huang H Y，et al. Inhibitory role of the mud crab short neuropeptide F in vitellogenesis and oocyte maturation via autocrine/paracrine signaling[J]. Frontiers in Endocrinology，2018，9：390.

[22]Dissous C.Venus kinase receptors at the crossroads of insulin signaling：their role in reproduction for helminths and insects[J]. Frontiers in Endocrinology，2015，6：118.

[23]Nijhout H F，Riddiford L M，Mirth C，et al. The developmental control of size in insects[J]. Wiley Interdisciplinary Reviews：Developmental Biology，2014，3（1）：113-134.

[24]Huang X S，Ye H H，Huang H Y，et al. An insulin-like androgenic gland hormone gene in the mud crab，Scylla paramamosain，extensively expressed and involved in the processes of growth and female reproduction[J]. General and Comparative Endocrinology，2014，204：229-238.

[25]Huang X S，Feng B Y，Huang H Y，et al. In vitro stimulation of vitellogenin expression by insulin in the mud crab，Scylla paramamosain，mediated through PI3K/Akt/TOR pathway[J]. General and Comparative Endocrinology，2017，250：175-180.

[26]Huang X S，Ye H H，Feng B Y，et al. Insights into insulin-like peptide system in invertebrates from studies on IGF binding domain-containing proteins in the female mud crab，Scylla paramamosain[J]. Molecular and Cellular Endocrinology，2015，416：36-45.

[27]Wang L，Chen H，Wang L L，et al. An insulin-like peptide serves as a regulator of glucose metabolism in the immune response of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis[J]. Developmental & Comparative Immunology，2020，108：103686.

[28]Sarbassov D D，Ali S M，Sabatini D M. Growing roles for the mTOR pathway[J]. Current Opinion in Cell Biology，2005，17（6）：596-603.

[29]Jia K L，Chen D，Riddle D L.The TOR pathway interacts with the insulin signaling pathway to regulate C. elegans larval development，metabolism and life span[J]. Development，2004，131（16）：3897-3906.

[30]Das S，Pitts N L，Mudron M R，et al. Transcriptome analysis of the molting gland （Y-organ） from the blackback land crab，Gecarcinus lateralis[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part D：Genomics & Proteomics，2016，17：26-40.

[31]Cosenza K S. Role of ecdysteroids on Myostatin and mTOR signaling gene expression in molt-dependent growth and atrophy of skeletal muscle in Gecarcinus lateralis and Carcinus maenas[D]. The Colorado State University Libraries，2016.

[32]Shyamal S，Das S，Guruacharya A，et al. Transcriptomic analysis of crustacean molting gland （Y-organ） regulation via the mTOR signaling pathway[J]. Scientific Reports，2018，8（1）：7307.

[33]Lum J J，Bauer D E，Kong M，et al. Growth factor regulation of autophagy and cell survival in the absence of apoptosis[J]. Cell，2005，120（2）：237-248.

[34]Li J S，Dong L X，Zhu D P，et al. An effector caspase Sp-caspase first identified in mud crab Scylla paramamosain exhibiting immune response and cell apoptosis[J]. Fish & Shellfish Immunology，2020，103：442-453.

[35]Johansson M W，Keyser P，Sritunyalucksana K，et al. Crustacean haemocytes and haematopoiesis[J]. Aquaculture，2000，191（1/2/3）：45-52.

[36]Qu C，Sun J J，Xu Q S，et al. An inhibitor of apoptosis protein （EsIAP1） from Chinese mitten crab Eriocheir sinensis regulates apoptosis through inhibiting the activity of EsCaspase-3/7-1[J]. Scientific Reports，2019，9（1）：20421.

[37]Yan B Y，Liu X M，Zhou Y Q，et al. Transcriptomic analysis reveals that hepatopancreatic necrosis disease in Eriocheir sinensis （Chinese mitten crabs） may be the result of autophagy and apoptosis[J]. Aquaculture，2020，515：734579.

[38]Jin X K，Li W W，He L，et al. Molecular cloning，characterization and expression analysis of two apoptosis genes，caspase and nm23，involved in the antibacterial response in Chinese mitten crab，Eriocheir sinensis[J]. Fish & Shellfish Immunology，2011，30（1）：263-272.

[39]Jin X K，Li W W，Wang Q.Caspase and nm23：apoptosis genes linked to the antibacterial response of the Chinese mitten crab[J]. Bioengineered Bugs，2011，2（3）：174-177.