張 越 孫洪亮 王成祥 種海玲 李清春

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，山東濱州 256600

隨著卵泡生長，雌性哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞首先發(fā)育為初級卵母細(xì)胞，進(jìn)入生發(fā)泡期（germinal vesicle，GV），并暫時(shí)停留在GV 期；減數(shù)分裂恢復(fù)的標(biāo)志是生發(fā)泡破裂（germinal vesicle breakdown，GVBD），隨后微管蛋白開始組裝成微管，染色體開始形成，進(jìn)入第一次減數(shù)分裂前期，此時(shí)同源染色體聯(lián)會(huì)，四分體形成；當(dāng)所有四分體排列在赤道板上時(shí)，即到達(dá)第一次減數(shù)分裂中期（MⅠ期），隨后進(jìn)入第一次減數(shù)分裂后期（AⅠ期），同源染色體分離，此時(shí)稱為第一次減數(shù)分裂末期（TⅠ期），同時(shí)排出第一極體；隨后卵母細(xì)胞第二次減數(shù)分裂的紡錘體迅速形成，卵細(xì)胞停留在第二次減數(shù)分裂中期（MⅡ期）等待受精完成[1-2]。在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂整個(gè)過程中，紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)（spindle assembly checkpoint，SAC）在分裂中后期發(fā)揮著重要作用，保證雙極紡錘體形成、完成染色體與微管的連接以及在進(jìn)入后期之前完成染色體在赤道板上的排列[3]。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，最終準(zhǔn)確完成二倍體的親代細(xì)胞產(chǎn)生單倍體的配子。

然而，SAC 在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的功能研究仍存在很大的爭議。酵母和蒼蠅在沒有功能性SAC的情況下仍可以有效地完成染色體排列[4]。而SAC 對高等生物的生存繁育至關(guān)重要[5]。研究證明[3]，SAC 系統(tǒng)參與雌性哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的調(diào)控，防止胚胎非整倍體的發(fā)生。本文為了更好地認(rèn)識(shí)SAC 蛋白在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的調(diào)控機(jī)制，分別探討了四種SAC 蛋白在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的定位及對非整倍體發(fā)生的作用機(jī)制。

1 激酶B

激酶（Aurora）為絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白家族亞類，包括Aurora A、Aurora B、Aurora C；Aurora B 是染色體乘客復(fù)合體（chromosomal passenger complex，CPC）的一員，是對正確調(diào)節(jié)染色體排列、胞質(zhì)分裂和動(dòng)粒-微管相互作用所必需的，被認(rèn)為參與了SAC 信號的維持[6-7]。Aurora B 在細(xì)胞周期中是動(dòng)態(tài)定位的，有絲分裂中期集中在內(nèi)部著絲粒染色質(zhì)，后期定位于紡錘體中間帶[8]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Aurora B 功能喪失會(huì)影響TERF1/TRF1（端粒保護(hù)蛋白復(fù)合物的一個(gè)組成部分），進(jìn)而導(dǎo)致端粒結(jié)構(gòu)異常[9]。而Aurora B 的擴(kuò)增或表達(dá)增加已被證明與各種人類惡性腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)[10]。

Aurora B 控制動(dòng)粒-微管的附著，調(diào)節(jié)有絲分裂和減數(shù)分裂中的關(guān)鍵事件，如凝聚蛋白結(jié)合和染色體凝聚、染色體定向、中央紡錘體的形成、染色體臂及端粒的分離等[11]，是影響染色體分離和動(dòng)粒微管結(jié)合的關(guān)鍵因子。Aurora B 在染色體正確分離和維持基因組的完整性中起著十分重要的作用，在動(dòng)粒正確地附著在微管之前，始終保持其活性[12]。Aurora B 主要是通過磷酸化修飾激活底物發(fā)揮生物學(xué)功能，它負(fù)責(zé)細(xì)胞有絲分裂過程中組蛋白H3 絲氨酸Ser10 的磷酸化（H3S10P），H3S10P 已被證明是Aurora B 活性激活的標(biāo)志[13]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，H3S10P 參與豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程，并影響豬胚胎有絲分裂的細(xì)胞周期進(jìn)程[14]。Chen 等[15]研究顯示，小鼠胚胎的第一次分裂過程中，抑制Aurora B 影響了早期胚胎的發(fā)育，表明Aurora B是SAC 成分[如有絲分裂阻滯缺陷蛋白2（mitotic arrest deficiency 2，Mad2）]定位到動(dòng)粒所必需的，可能通過參與SAC 來調(diào)節(jié)染色體分離及防止第一次卵裂相關(guān)的非整倍性事件的發(fā)生。Aurora B 通過破壞不正確的動(dòng)粒-微管連接影響有絲分裂檢查點(diǎn)功能，是胚胎發(fā)育過程中調(diào)節(jié)染色體異常關(guān)鍵的有絲分裂調(diào)節(jié)因子，它在防止體外受精胚胎染色體非整倍性的發(fā)生和降低植入前失敗率方面起著重要作用[6]。

2 紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白E

紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白E（centromere-associated protein E，CENP-E）是有絲分裂動(dòng)粒纖維層的組成部分，它包含一個(gè)ATP 水解運(yùn)動(dòng)域，促進(jìn)微管末端定向運(yùn)動(dòng)[16]。人類CENP-E 由2701 個(gè)殘基組成，CENP-E 的動(dòng)粒靶向結(jié)構(gòu)域包含殘基2126-2476，其后是微管結(jié)合區(qū)；人類CENP-E 結(jié)構(gòu)域包含四個(gè)半胱氨酸殘基，每個(gè)半胱氨酸殘基都是其馬達(dá)結(jié)構(gòu)域運(yùn)動(dòng)所必需的[17]。分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示，人類CENP-E 的Y63H突變體降低了其ATP 結(jié)合親和力，破壞了CENP-E 馬達(dá)結(jié)構(gòu)域的ATP 結(jié)合區(qū)的構(gòu)象，并與癌癥進(jìn)展相關(guān)[18]。CENP-E是一種紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白，參與其他檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白與動(dòng)粒結(jié)合，如有絲分裂檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白BubR1 抗體（mitotic test point protein BubR1 antibody，BubR1）、 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1 （budding uninhibited by benzimidazole 1，Bub1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3（budding uninhi bited by benzimidazole 3，Bub3）、有絲分裂阻滯缺陷蛋白1（mitotic arrest deficiency 1，Mad1）和Mad2。CENP-E 在核膜破裂后不久就與動(dòng)粒結(jié)合，在中期到后期轉(zhuǎn)換過程中，CENP-E 表現(xiàn)出從動(dòng)粒到中央紡錘體中部的動(dòng)態(tài)分布，在分裂的后期或末期，它被重新定位到紡錘體微管[19-20]。研究表明[21]，小鼠卵母細(xì)胞中注射抗CENP-E 抗體后完全阻止了卵母細(xì)胞進(jìn)入AⅠ期，所有卵母細(xì)胞在MⅠ期被阻斷，這表明CENPE 參與減數(shù)分裂過程的染色體運(yùn)動(dòng)。CENP-E 的抑制或耗竭導(dǎo)致嚴(yán)重和持久的染色體排列缺陷，許多染色體無法向紡錘體赤道板方向排列，并停留在紡錘體極點(diǎn)附近，導(dǎo)致SAC 逐漸地激活[16，22]。Tovini 等[23]采用CENP-E 抑制劑抑制體細(xì)胞后，導(dǎo)致染色體排列錯(cuò)亂。

CENP-E 是一種末端定向的驅(qū)動(dòng)馬達(dá)蛋白，是中期染色體組裝所必需的，它在動(dòng)粒外層累積，并介導(dǎo)動(dòng)粒-微管的捕獲，沿著紡錘體微管向赤道板運(yùn)輸染色體；CENP-E 在動(dòng)粒-微管連接過程中與BubR1、Aurora B 和核心動(dòng)粒成分相互作用，它參與有絲分裂和減數(shù)分裂過程中的動(dòng)粒-微管捕獲、 中期染色體組裝和排列、紡錘體組裝檢查點(diǎn)的調(diào)節(jié)[24]。染色體排列過程中微管捕獲和結(jié)構(gòu)維持需要CENPs[25]。此外，CENP-E 通過姐妹染色單體的橫向滑動(dòng)介導(dǎo)染色體分離，在缺乏CENP-E 的情況下，Aurora B 保留在著絲粒處，并表現(xiàn)出高度Aurora B 激酶活性，這導(dǎo)致紡錘體組裝檢查點(diǎn)的激活；Aurora B 與CENP-E 相互作用，通過減少近極端動(dòng)粒-微管的穩(wěn)定附著來調(diào)節(jié)單向極性染色體組裝[26]。

3 Mad1

Mad1 是有絲分裂檢查點(diǎn)蛋白中進(jìn)化上較保守的核心蛋白之一，人Mad1 是一種由718 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，Mad1 的全長結(jié)構(gòu)尚未破解，主要是由于重組Mad1 的溶解度低[27]。Mad1 的N 端結(jié)構(gòu)域（1～485 個(gè)殘基，Mad1NTD）被認(rèn)為是將蛋白質(zhì)靶向結(jié)合到核膜或動(dòng)粒所必需的，并與許多其他蛋白質(zhì)相互作用[28]。Mad1 通過其中間區(qū)域的Mad2 相互作用基序（Mad2-interacting motif，MIM）與Mad2 形成獨(dú)立的細(xì)胞周期復(fù)合物，這種復(fù)合物富含未附著的動(dòng)粒，構(gòu)成有絲分裂檢查點(diǎn)的信號放大機(jī)制；Mad1 作為最重要的檢查點(diǎn)蛋白之一，還可以形成一個(gè)細(xì)胞周期獨(dú)立的Mad1:CMad2 復(fù)合物，以催化Mad2 O-C（open-closed）在未附著動(dòng)粒上的轉(zhuǎn)化，從而放大有絲分裂檢查點(diǎn)的信號[27]。

近年來，國內(nèi)外文獻(xiàn)對Mad1 與Mad2 比率（Mad1∶Mad2）在減數(shù)分裂紡錘體檢查點(diǎn)中的作用進(jìn)行了研究報(bào)道。不論Mad1 和Mad2 蛋白的總量是否只有正常水平的一半，染色體丟失方面的缺陷可以通過恢復(fù)Mad1∶Mad2 的補(bǔ)償性變化來逆轉(zhuǎn)[29]。由此得出，在檢查點(diǎn)功能的某些方面，Mad1∶Mad2 比Mad 蛋白質(zhì)總量更具有代表意義。

4 Bub1

Bub1 為Bub 家族成員之一，在減數(shù)分裂紡錘體檢查點(diǎn)功能中起著重要的作用，在小鼠卵母細(xì)胞GVBD 期到AⅠ早期Bub1 定位于動(dòng)粒上，并于AⅠ晚期在動(dòng)粒上消失，而在MⅡ期重新定位于動(dòng)粒上[30]。Bub1 決定許多靶標(biāo)的動(dòng)粒募集，包括CENP-E、CENP-F、Bub3、Mad3/BubR1、有絲分裂著絲粒相關(guān)驅(qū)動(dòng)蛋白、Mad1 和Mad2[31]。

敲除細(xì)胞Bub1 基因顯示染色體組裝缺陷，導(dǎo)致染色體分離錯(cuò)誤[4]。Bub1 保守的C-末端尾部在調(diào)節(jié)染色體組裝中起作用，且負(fù)責(zé)CENP-F 的募集，獨(dú)立于激酶活性。根據(jù)最近在HeLa 細(xì)胞中的另一項(xiàng)研究[32]，Bub1 的C 末端可能會(huì)招募更多的下游靶點(diǎn)，因?yàn)锽ub1 與許多動(dòng)粒蛋白的招募有關(guān)。在人類細(xì)胞中，通過RNA 干擾（RNA interference，RNAi）敲除Bub1 也會(huì)導(dǎo)致染色體排列錯(cuò)誤及導(dǎo)致明顯的SAC 缺陷[33]。

5 小結(jié)

細(xì)胞分裂是一種由多種蛋白質(zhì)調(diào)控通路參與的復(fù)雜的生命活動(dòng)，各種蛋白的功能、作用途徑、調(diào)控方式相互作用，確保細(xì)胞分裂正確進(jìn)行。紡錘體檢查點(diǎn)通過暫時(shí)停止染色體分離和隨后的細(xì)胞分裂來確?；蚪M的保真度，直到所有動(dòng)粒有效地附著到紡錘體上；SAC 對動(dòng)粒-微管連接狀態(tài)的反應(yīng)被精細(xì)調(diào)節(jié)，使得未連接的動(dòng)粒產(chǎn)生足夠的“等待后期”信號來阻止細(xì)胞分裂；一旦完成染色體的配對，紡錘體蛋白便從動(dòng)粒上釋放，SAC 被滅活，使細(xì)胞進(jìn)入后期[3]。除了本文介 紹 的SAC 蛋 白Aurora B、CENP-E、Mad1、Bub1四種SAC 蛋白之外，還有另外一些檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白，比如BubR1、Mps1、Dynein 等，它們都在減數(shù)分裂及有絲分裂的紡錘體組裝及染色體排列中發(fā)揮了重要作用。影響減數(shù)分裂過程因素的不僅僅有SAC 蛋白，還有其他作用機(jī)制，比如環(huán)境、年齡、類泛素蛋白修飾分子（small ubiquitin-like modifier，SUMO）修飾[34]等。相關(guān)文獻(xiàn)表明[35]，年齡對卵母細(xì)胞質(zhì)量有很大影響，高齡婦女發(fā)生染色體非整倍體的比率較高，與紡錘體微管的偏移和錯(cuò)配密切相關(guān)。SUMO 化修飾是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾途徑，參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及周期調(diào)控等眾多生理調(diào)控過程[36]。SUMO-1 可能在促進(jìn)胞質(zhì)分裂和維持第二次減數(shù)分裂紡錘體組裝檢查點(diǎn)方面發(fā)揮重要作用[34]。關(guān)于SUMO 修飾對減數(shù)分裂過程的影響、甚至導(dǎo)致非整倍體的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究?？傊?，減數(shù)分裂這一過程需要多方面協(xié)同作用，正確認(rèn)識(shí)及研究SAC 蛋白的檢測機(jī)制，對防止減數(shù)分裂染色體排列或分離異常及防止非整倍體的發(fā)生具有重要的意義。

目前，關(guān)于紡錘體檢查點(diǎn)蛋白在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程的作用研究取得了一定的進(jìn)展，但是關(guān)于紡錘體裝配機(jī)理及途徑，SAC 是如何準(zhǔn)確監(jiān)測及調(diào)節(jié)染色體運(yùn)動(dòng)、 各種SAC 蛋白又是如何協(xié)同作用來保證減數(shù)分裂正常進(jìn)行的證據(jù)仍比較有限，有待于更進(jìn)一步的研究。相信隨著生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，上述未能準(zhǔn)確闡述的過程和機(jī)制定會(huì)得到完善，從而為減數(shù)分裂異常導(dǎo)致的非整體的發(fā)生及治療提供理論依據(jù)。