史菲菲 劉紅彥

鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 河南大學(xué)人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳所，河南鄭州 450003

Duchenne 型肌營養(yǎng)不良癥（Duchennemusculardystrophy，DMD）是由DMD 基因突變引起的一種X 連鎖隱性遺傳病，在活產(chǎn)男嬰中的發(fā)病率為1/3500[1]。DMD基因位于X 染色體上，包含79 個(gè)外顯子，編碼肌營養(yǎng)不良蛋白。DMD 患者的特點(diǎn)為進(jìn)行性肌無力，多在3～5 歲前發(fā)病，由于肌肉功能持續(xù)退化，最終于20～30 歲死于呼吸或循環(huán)功能衰竭[2]。

肌營養(yǎng)不良蛋白在心肌和骨骼肌中表達(dá)，是抗肌營養(yǎng)不良糖蛋白復(fù)合物（dystrophin-glycoprotein complex，DGC）的重要組成部分。DGC 可以將肌動蛋白細(xì)胞骨架與肌肉纖維的細(xì)胞外基質(zhì)連接起來，參與調(diào)節(jié)肌肉纖維的正常功能。當(dāng)肌營養(yǎng)不良蛋白缺乏時(shí)，DGC 組裝受損，肌膜的穩(wěn)定性受到破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，從而激活鈣依賴蛋白酶，進(jìn)一步引起炎癥和纖維化的積累，最終導(dǎo)致肌肉功能不斷退化[2]。

隨著對DMD 發(fā)病機(jī)制的研究不斷深入，各種治療方法層出不窮，如糖皮質(zhì)激素、外顯子跳躍、無義突變通讀治療、Myostatin 抑制劑、上調(diào)Utrophin、CRISPR/Cas9 等，本文將對上述治療方法進(jìn)行綜述。

1 糖皮質(zhì)激素

糖皮質(zhì)激素是目前唯一被循證醫(yī)學(xué)證實(shí)有效的藥物。它可以刺激成肌細(xì)胞增殖，抑制肌肉蛋白分解，進(jìn)而改善肌肉的功能和力量[3]。與未經(jīng)治療的患者比較，糖皮質(zhì)激素的使用可使患者行走能力平均延長2～5 年[4]。目前指南[5]推薦的最佳劑量為潑尼松0.75 mg/（kg·d）或地夫可特0.9 mg/（kg·d）。但激素的各種不良反應(yīng)，如體重增加、骨質(zhì)疏松、肥胖、多毛等限制了其長期應(yīng)用。Vamorolone（VBP15）是一種新型類固醇，與糖皮質(zhì)激素作用相同，但副作用卻明顯減少。最近一項(xiàng)納入48 例患兒采用Vamorolone治療24 周的研究結(jié)果顯示[6]，肌肉炎癥反應(yīng)明顯減少，同時(shí)無嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生。

2 外顯子跳躍治療

DMD 外顯子跳躍治療的原理是基于閱讀框規(guī)則，即如果閱讀框發(fā)生移碼突變，則不能產(chǎn)生功能性肌營養(yǎng)不良蛋白，導(dǎo)致表型嚴(yán)重的DMD；如果發(fā)生整碼突變，可產(chǎn)生具有部分功能的肌營養(yǎng)不良蛋白，造成表型較輕的Becker 型肌營養(yǎng)不良癥（Becker muscular dystrophy，BMD）[1]外顯子跳躍治療通過反義寡核苷酸選擇性剪接pre-mRNA，引起相應(yīng)外顯子跳躍，使閱讀框得以恢復(fù)，產(chǎn)生截短但仍有部分功能的肌營養(yǎng)不良蛋白，從而使DMD 轉(zhuǎn)變?yōu)锽MD[7]。

Drisapersen 是一種2-O-甲基磷硫酰反義寡核苷酸，可促進(jìn)51 號外顯子跳躍。有研究表明[8]該藥可以改善DMD 患者6 min 步行試驗(yàn)距離（6 minute walking test，6MWT），但一項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[9]6MWT 的改善無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）拒絕批準(zhǔn)Drisapersen上市。

Eteplirsen 是一種磷酸二胺嗎啉低聚物，促進(jìn)51 號外顯子跳躍。一項(xiàng)研究表明[10]，服用Eteplirsen 治療3 年后DMD 患者的6MWT 下降速度比安慰劑組慢。在另一項(xiàng)為期48 周的Eteplirsen 治療中[11]，DMD 患者的肌營養(yǎng)不良蛋白含量從0.16%增加到0.44%，且安全性好，據(jù)此Eteplirsen 有條件地獲得了FDA 的批準(zhǔn)。

Golodirsen 用于外顯子53 的跳躍治療，一項(xiàng)納入25 例DMD 患者的為期168 周的Ⅱ期臨床試驗(yàn)表明[12]，該藥可使DMD 患者肌營養(yǎng)不良蛋白含量從0.095%增加到1.109%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2019 年12 月，Golodirsen 獲得FDA 批準(zhǔn)上市[13]。

Viltolarsen 是一種磷酸二酰嗎啉反義寡核苷酸，可促進(jìn)53 號外顯子跳躍。在一項(xiàng)納入16 例患者為期20 周的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中[14]，治療組產(chǎn)生的肌營養(yǎng)不良蛋白含量明顯增加。Viltolarsen 于2020 年相繼在日本和美國獲得批準(zhǔn)上市[15]。

3 無義突變通讀治療

無義突變可導(dǎo)致mRNA 提前出現(xiàn)終止密碼子，從而使翻譯終止。無義突變通讀療法利用小分子與核糖體結(jié)合，跳過提前出現(xiàn)的終止密碼子，可繼續(xù)產(chǎn)生有功能的肌營養(yǎng)不良蛋白[16]。慶大霉素可以與核糖體結(jié)合，從而發(fā)揮無義突變通讀的作用。一項(xiàng)動物研究中[17]，MDX 小鼠（外顯子23 存在無義突變）給予慶大霉素治療后，肌營養(yǎng)不良蛋白表達(dá)大約恢復(fù)到正常水平的20%。然而小鼠試驗(yàn)結(jié)果與人體試驗(yàn)不一致，一項(xiàng)人體試驗(yàn)并沒有檢測到肌營養(yǎng)不良蛋白表達(dá)的增加[16]。

為了克服抗生素類藥物的副作用及通讀能力差等缺點(diǎn)，PTC Treateutics 發(fā)現(xiàn)了一種名為Ataluren 的分子，它能夠誘導(dǎo)終止密碼子通讀[18]。一項(xiàng)為期48 周的Ⅱa 期臨床試驗(yàn)表明[19]，Ataluren 總體上安全性良好，可以顯著延緩無義突變DMD 患者的疾病進(jìn)展。然而2018 年的一項(xiàng)3 期臨床試驗(yàn)表明[20]，Ataluren 和安慰劑對照組患者的6MWT 比較無顯著差異。

4 基因替代

基因替代是將外源性正?；?qū)隓MD 患者體內(nèi)，從而表達(dá)正常遺傳物質(zhì)。1990 年英國報(bào)道了1 例61 歲仍具有行走能力的DMD 患者[21]，這表明即使有較大的DMD 基因缺失，表型也可能非常輕微。因此，具備功能但內(nèi)部結(jié)構(gòu)缺失的mini-dystrophin 和microdystrophin 為基因替代治療創(chuàng)造了機(jī)會。

腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）是基因替代治療最常用的載體，它具備高效轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞與骨骼肌細(xì)胞的能力。一項(xiàng)DMD 犬模型試驗(yàn)表明[22]，AAV micro-dystrophin 治療可以使肌營養(yǎng)不良蛋白在肌肉中持續(xù)、穩(wěn)定的表達(dá)，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)動物的肌肉力量。

5 上調(diào)Utrophin

Utrophin 是肌營養(yǎng)不良蛋白結(jié)構(gòu)和功能的類似物，表達(dá)于發(fā)育中肌肉的肌膜上。動物實(shí)驗(yàn)表明[23]，雙dystrophin-Utrophin 基因敲除小鼠比dystrophin 基因突變的MDX 小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的肌肉無力和心臟異常，預(yù)期壽命更短。SMTC1100/Ezutromid 是一種新型口服Utrophin 小分子刺激物，1b 期臨床試驗(yàn)結(jié)果較為理想[24]，明顯提高了肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)水平。

6 離子的調(diào)節(jié)

在營養(yǎng)不良的肌肉中，Ca2+濃度失衡是一個(gè)重要的致病環(huán)節(jié)。因此，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量可以增強(qiáng)肌肉的功能。ARM210 是一種蘭尼堿受體（ryanodine receptors，RyR）通道穩(wěn)定劑，可以防止骨骼肌、心肌的Ca2+滲漏，其改善肌肉力量的作用在動物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[25]。

7 Myostatin 抑制劑

Myostatin 是一種肌肉生長的負(fù)向調(diào)控因子，通過抑制Myostatin 可以使肌肉明顯增生和肥大。在MDX小鼠中，Myostatin 的丟失降低了肌營養(yǎng)不良的嚴(yán)重程度[26]。組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑能降低Myostatin 的表達(dá)水平，Givinostat 是一種HDAC 抑制劑，一項(xiàng)納入20 例DMD 患兒的研究顯示[27]，Givinostat 治療后，患兒活檢組織中肌肉組織的比例和纖維組織的數(shù)量顯著增加。

8 基因編輯

2013 年人類發(fā)現(xiàn)了一種強(qiáng)大的基因編輯工具：成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）及其相關(guān)的核酸酶[28]。Cas9 核酸內(nèi)切酶可以在sgRNA 上靶向編輯，使DNA 雙鏈裂解，隨后通過非同源末端連接使外顯子跳越；而同源定向修復(fù)可以用正確的序列替換DMD 突變并產(chǎn)生正常的肌營養(yǎng)不良蛋白。Long 等[29]通過基因編輯糾正了MDX 小鼠生殖細(xì)胞外顯子23 的無義突變，最終80%MDX 小鼠的肌肉功能得到改善。另一項(xiàng)50 號外顯子缺失的實(shí)驗(yàn)鼠，通過基因編輯實(shí)現(xiàn)了51 號外顯子的跳躍，也取得了良好的治療效果[30]。

隨著對DMD 發(fā)病機(jī)制研究的深入，各種新興治療方法也不斷出現(xiàn)，為疾病的治療提供了更廣闊的思路。但我們也應(yīng)清楚地認(rèn)識到DMD 治療面臨著諸多挑戰(zhàn)。臨床醫(yī)師仍需把目前的工作重心放在攜帶者篩查及產(chǎn)前診斷上，從根本上阻斷DMD 突變基因的傳遞。