侯雪峰 柏鑫 高玉海 陳克明,*

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院骨研所，甘肅 蘭州 730050

骨缺損是骨科常見疾病，由于骨的再生能力十分有限，常難以獲得良好的修復(fù)效果。目前臨床中常用自體骨移植來(lái)修復(fù)大面積骨缺損，但骨源少，風(fēng)險(xiǎn)高，導(dǎo)致骨移植在臨床應(yīng)用中具有嚴(yán)重的局限性[1]。隨著對(duì)具有骨再生和骨誘導(dǎo)能力的支架材料的深入研究，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)將種子細(xì)胞或細(xì)胞因子加載到支架材料中，?？墒斋@良好的治療效果。淫羊藿苷(Icariin，ICA)是中草藥淫羊藿的主要有效成分，其可顯著提高堿性磷酸酶、骨鈣素等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子以及促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白等成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨性分化和成骨細(xì)胞的鈣化作用，并抑制破骨細(xì)胞的生成及其骨吸收活性，同時(shí)還具有良好的抗炎活性及促進(jìn)血管生成的作用[2-4]。近年來(lái)眾多研究者將高純度的淫羊藿苷粉末與支架材料制成復(fù)合物，應(yīng)用于骨缺損的修復(fù)研究。由于淫羊藿苷無(wú)異位成骨問(wèn)題，在常溫下不易丟失活性，與支架材料復(fù)合后可達(dá)到控釋效果，故是一種理想的骨生長(zhǎng)因子替代材料，特別適合應(yīng)用于骨組織工程研究。本文對(duì)負(fù)載淫羊藿苷支架材料的相關(guān)研究作一綜述，旨在總結(jié)經(jīng)驗(yàn)以供后續(xù)研究參考。

1 負(fù)載ICA的天然生物衍生材料

天然生物材料指通過(guò)特殊的處理方法獲得的用于骨組織工程的天然生物組織材料，包括異種骨、膠原等。天然生物材料具備良好的細(xì)胞相容性和生物降解性能，部分天然生物材料還含有多種細(xì)胞因子，具有良好的修復(fù)能力。

小腸黏膜下層(small intestine submucosa，SIS)是來(lái)源于豬小腸黏膜下層的天然細(xì)胞外基質(zhì)類衍生生物材料[6]，含有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子等多種細(xì)胞因子，具有優(yōu)異的生物相容性和較低的細(xì)胞毒性等，已被用作多種組織工程的藥物控釋遞送載體[7]。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn)，4層SIS可為ICA提供更多的結(jié)合位點(diǎn)，且具有更高的機(jī)械強(qiáng)度，同時(shí)對(duì)ICA的控釋長(zhǎng)達(dá)30 d。另外，由于SIS具有多種生長(zhǎng)因子，在負(fù)載ICA后血管生成和成骨作用增強(qiáng)，且新生骨與移植部位的原始骨基本相同。進(jìn)一步研究顯示，在負(fù)載ICA的小腸黏膜下層支架(ICA-SIS)上培養(yǎng)成骨細(xì)胞所制備出的藥物衍生細(xì)胞外基質(zhì)修飾支架(ICA-ECM-SIS)比ICA-SIS具備更好的骨傳導(dǎo)性，顯著提高了新骨形成率，發(fā)揮了更強(qiáng)的骨再生作用[9]。

富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)含有豐富的生長(zhǎng)因子，將其冷凍干燥可制成凍干PRP(FD-PRP)。有人將ICA混入FD-PRP中，使其可以持續(xù)將ICA釋放到腱-骨愈合部位，促進(jìn)了新骨的形成、重塑和礦化[10]。

2 負(fù)載ICA的人工材料

2.1 負(fù)載ICA的無(wú)機(jī)材料

納米羥基磷灰石(nano-hydroxyapatite，n-HA)是一種生物相容性、骨傳導(dǎo)性和成骨性優(yōu)越的生物材料，研究表明在n-HA中植入ICA較單純n-HA形成更多新骨，修復(fù)效果良好。而將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞與ICA一同加載于n-HA上，其骨修復(fù)效果則進(jìn)一步增強(qiáng)[11]。同樣作為人工無(wú)機(jī)材料的生物活性玻璃，可刺激新骨和血管的生成，Xing等[12]將ICA和脂肪干細(xì)胞加載于生物玻璃后植入大鼠顱骨缺損部位，發(fā)現(xiàn)其可明顯增強(qiáng)新骨的形成和新生血管的形成。

磷酸鈣是常用的骨組織工程支架材料之一。 Yu等[13]將ICA植入磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)支架上，并應(yīng)用于去卵巢大鼠的顱骨骨缺損，結(jié)果表明骨生成量和新生血管數(shù)明顯大于單純CPC，同時(shí)發(fā)現(xiàn)ICA呈緩慢的線性釋放。對(duì)于嚴(yán)重感染的骨缺損，同時(shí)修復(fù)骨缺損和控制感染是臨床治療中棘手的問(wèn)題。Huang等[14]通過(guò)使用萬(wàn)古霉素(VA)、ICA、可注射CPC組成雙重藥物釋放支架系統(tǒng)ICA-VA-CPC，該系統(tǒng)有著抗炎和骨誘導(dǎo)雙重特性，對(duì)藥物的控釋時(shí)間約為30 d，可明顯改善板層骨的形成和骨髓腔的再通。仿生磷酸鈣(biomimetic calcium phosphate，BioCaP)作為搭載ICA的載體也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)ICA的持續(xù)釋放，并且可以增強(qiáng)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的增殖以及成骨性分化[15]。3D打印技術(shù)制備的聚磷酸鈣/淫羊藿苷支架和β-磷酸鈣/淫羊藿苷支架，對(duì)骨缺損的修復(fù)亦有明顯促進(jìn)作用，同時(shí)支架具有良好的骨誘導(dǎo)性和生物相容性，其降解產(chǎn)物多為鈣、磷離子和鈣鹽、磷酸鹽，不引起局部反應(yīng)[16-17]。

2.2 負(fù)載ICA的有機(jī)高分子材料

聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯[poly(hydroxybutyrate-hydroxypentanoate)，PHBV]作為一種由大分子聚合物合成的可降解生物支架材料，具有良好的藥物輸送特性和藥物控釋能力，Xia等[18]將ICA與PHBV復(fù)合制成新型ICA多孔PHBV支架(IDPPSs)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)ICA的控釋，同時(shí)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，IDPPSs可顯著促進(jìn)MG-63成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。鐘秀霞等[19]指出，聚已內(nèi)酯支架作為一種細(xì)胞支架，具有穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)及良好的生物相容性和降解性，ICA/骨膜細(xì)胞/聚已內(nèi)酯支架材料完整地保留了ICA的生物活性，因其同時(shí)攜帶骨膜細(xì)胞和ICA，故有良好的骨缺損修復(fù)效果。

3 負(fù)載ICA人工復(fù)合材料

隨著對(duì)骨組織工程支架材料研究的日趨深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)單一的支架材料很難滿足支架材料的所有理想特性，而復(fù)合支架由幾種支架材料復(fù)合而成，各種材料特性互補(bǔ)，確保了支架材料整體的優(yōu)越性能。目前復(fù)合材料主要包括有機(jī)材料與無(wú)機(jī)材料組成的復(fù)合材料、天然生物材料與無(wú)機(jī)材料組成的復(fù)合材料等。

3.1 ICA復(fù)合有機(jī)-無(wú)機(jī)材料

聚乳酸-羥基乙酸/磷酸鈣/淫羊藿苷(PLGA/TCP/ICA，PTI)支架是具有仿生結(jié)構(gòu)的一種支架材料，PTI支架的結(jié)構(gòu)類似于松質(zhì)骨，具有良好的骨傳導(dǎo)性，其生物相容性和降解率適合細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活，植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)其可以明顯加快骨缺損修復(fù)[20]。Liu等[21]在通過(guò)硅質(zhì)介孔泡沫/聚3-羥基丁酸-co-3-羥基己酸酯/ICA/骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)復(fù)合支架修復(fù)大鼠顱骨骨缺損的研究發(fā)現(xiàn)，該復(fù)合體可顯著延長(zhǎng)ICA釋放時(shí)間，與未加載ICA的復(fù)合體相比，該復(fù)合體的BMSCs數(shù)量更多，骨再生效果更顯著。Yuan等[22]首先將ICA固定于Mg/MgCO3顆粒，然后將顆粒植入聚丙交酯-乙醇酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide)，PLGA]中而制得PMI微球支架，并指出該支架具有中藥活性成分和生物活性離子雙重控釋的效果， ICA與Mg2+表現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)，且中等劑量的ICA和Mg2+對(duì)骨形成的作用最強(qiáng)。

納米羥基磷灰石/聚乳酸(nHA/PLGA)復(fù)合支架是一種高分子支架材料，具有優(yōu)良的生物相容性、降解性以及超強(qiáng)的吸附與滲透能力(nHA/PLGA)。王德欣等[23]將不同濃度的ICA加載于nHA/PLGA上，發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)BMSCs增殖和分化活性具有濃度依賴性。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)ICA/nHA/PLGA復(fù)合支架對(duì)成骨細(xì)胞的增殖無(wú)顯著影響，但可以提高堿性磷酸酶活性和促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨性分化[24]。亦有研究報(bào)道指出，ICA/HA/PLGA復(fù)合支架具有良好的機(jī)械性能，可為細(xì)胞黏附提供一定支持，同時(shí)具有良好的成骨作用和生物相容性[25]。PLGA/磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)也是復(fù)合支架材料中較為常見的一種，研究顯示ICA/PLGA/TCP可完整保留ICA的活性成分，其結(jié)構(gòu)中的微孔隙供成骨相關(guān)細(xì)胞及因子通過(guò)，同時(shí)該支架的骨整合性能十分優(yōu)越[26]。

3.2 ICA復(fù)合天然-無(wú)機(jī)材料

ICA/HA/藻酸鹽(IC/HAA)多孔復(fù)合支架作為藥物緩釋支架，具有高孔隙率。研究發(fā)現(xiàn)負(fù)載ICA后支架的宏觀/微觀結(jié)構(gòu)以及力學(xué)性能未發(fā)生改變，且無(wú)細(xì)胞毒性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明IC/HAA可顯著上調(diào)成骨基因和Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)水平，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活性，并促進(jìn)原位骨再生[27]。絲素蛋白(silk fibroin，SF)與介孔分子篩(SBA15)組成的微/細(xì)觀多孔支架(SF/SBA15)同樣被應(yīng)用于骨再生，SF/SBA15支架具有良好的生物活性和生物相容性，對(duì)ICA和BMP2的局部緩慢遞送促進(jìn)了骨組織再生。研究還發(fā)現(xiàn)，ICA和BMP只有在合適的釋放速率和多個(gè)遞送條件下才能更大程度地發(fā)揮成骨系統(tǒng)作用[28]。殼聚糖(chitosan，CS)與HA組成三維支架體系(CSHA)具有高孔隙率和力學(xué)性能優(yōu)越的特點(diǎn)，負(fù)載ICA后對(duì)ICA的物理和生物性質(zhì)完全保留，同時(shí)引入ICA也沒(méi)有顯著改變CSHA的形態(tài)、孔隙率和機(jī)械強(qiáng)度，同時(shí)CSHA對(duì)ICA具有良好的控釋性能，ICA的續(xù)釋放時(shí)間長(zhǎng)達(dá)90 d以上，可持續(xù)有效地促進(jìn)BMSCs的成骨分化以及進(jìn)一步的鈣化[29-30]。

3.3 新型負(fù)載ICA相關(guān)復(fù)合材料

ICA/凹凸棒石/Ⅰ型膠原/聚已內(nèi)酯(ICA/ATP/ColⅠ/PCL)通過(guò)一定比例交聯(lián)形成復(fù)合支架，較高的孔隙率可以攜帶較多的ICA，ICA/ATP/ColⅠ/PCL具有良好的生物相容性和成骨活性，可發(fā)揮良好的骨再生和骨修復(fù)效果[31]。Luo[32]將ICA加載于中間層含有聚多巴胺(polydopamine，PDA)的靜電紡絲聚丙交酯(PLLA)纖維膜中，然后將成骨細(xì)胞接種于纖維膜上，發(fā)現(xiàn)纖維膜對(duì)成骨細(xì)胞的黏附、增殖以及成骨性分化更為有利。同時(shí)發(fā)現(xiàn)低濃度ICA更有利于成骨細(xì)胞的黏附和增殖，而高濃度的ICA可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，增加堿性磷酸酶活性以及鈣沉積。李根等[33-34]將ICA改性得到ICA-NH2，然后將ICA-NH2與CS進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，之后采用兩相混合急速冷凍干燥成型技術(shù)將結(jié)合產(chǎn)物與PHBV結(jié)合形成ICA-NH2-CS/PHBV支架，結(jié)果表明這種以共價(jià)結(jié)合的方式對(duì)ICA的緩釋作用良好，能夠有效誘導(dǎo)新骨形成。

4 結(jié)語(yǔ)

如何修復(fù)大面積骨缺損一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究重點(diǎn)，在此過(guò)程中大量的生物材料相繼被開發(fā)與應(yīng)用，由于單純的生物材料在治療骨缺損中很難獲得滿意效果，故近年來(lái)多數(shù)研究指向復(fù)合生物材料，包括將種子細(xì)胞、細(xì)胞因子或中藥有效活性成分加載于生物材料中，以更好地促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。ICA目前已經(jīng)被證明可以通過(guò)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞的增殖與成骨性分化來(lái)促進(jìn)骨折愈合及骨缺損的修復(fù)，故將ICA加載于生物材料中或含種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子的生物材料中以應(yīng)用于骨缺損的治療是一種很好的研究策略，但同時(shí)另一個(gè)挑戰(zhàn)是如何開發(fā)性能優(yōu)良的生物材料。根據(jù)本文對(duì)負(fù)載ICA的骨組織工程支架材料的歸納發(fā)現(xiàn)，天然生物材料具有良好的生物相容性和生物降解率，但其生物力學(xué)性能和孔隙率不如人工材料，而人工材料的降解率和生物相容性亦不如天然生物材料。而人工復(fù)合材料通過(guò)性能互補(bǔ)對(duì)多種材料進(jìn)行組合，優(yōu)化了支架材料的各方面特性，同時(shí)對(duì)ICA的控釋達(dá)到相對(duì)理想的狀態(tài)，其可能成為未來(lái)研究的最佳選擇。

目前，雖然對(duì)負(fù)載ICA的支架材料在實(shí)驗(yàn)研究中已取得一些成果，但其臨床療效尚不能確定。對(duì)于研發(fā)負(fù)載ICA的支架材料，首先考慮支架材料本身的生物物理性能，理想的支架材料必須具有與骨重建速度相對(duì)應(yīng)的受控的生物降解速率，并且需要足夠的機(jī)械應(yīng)力為重建提供一定的支持，同時(shí)具備良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性以及可塑性等優(yōu)勢(shì)。此外，支架材料降解產(chǎn)物應(yīng)既可參與或促進(jìn)骨組織再生，又可減輕降解產(chǎn)物的細(xì)胞毒效應(yīng)。負(fù)載ICA后則需要考慮其所能負(fù)載ICA的量-效關(guān)系以及ICA釋放的時(shí)效差異與骨代謝之間的動(dòng)態(tài)平衡。此外，還應(yīng)關(guān)注負(fù)載ICA支架材料與植入?yún)^(qū)新生宿主組織重塑過(guò)程中強(qiáng)度的差異性，及其降解產(chǎn)物對(duì)組織局部環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響?？傊?，負(fù)載ICA支架材料具備局部控釋效應(yīng)、機(jī)械性能穩(wěn)定、安全性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，完全避免了傳統(tǒng)口服ICA首過(guò)消除效應(yīng)、低生物利用度等缺陷，同時(shí)促進(jìn)了中藥有效活性成分輔助支架材料在骨缺損中的深入研發(fā)與應(yīng)用，提高了骨愈合速率，有效縮短了骨愈合周期，值得臨床進(jìn)一步推廣使用。