柯芷茵 梁愛玲 劉勇軍

肺癌是最常見的診斷癌癥和癌癥死亡的主要原因，其中非小細(xì)胞肺癌（non‐small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌的85%[1]。在男性中，肺癌是最常見的癌癥（占癌癥病例總數(shù)的14.5%），也是癌癥死亡的主要原因（占癌癥死亡總數(shù)的22.0%）。在女性中，肺癌是僅次于乳腺癌的最常見癌癥死亡原因（占癌癥死亡總數(shù)的13.8%）[2]。與大多數(shù)國家相比，中國的肺癌死亡率相對較高。據(jù)預(yù)測，至2030年中國的肺癌死亡率可能增加約40%[3]。近年來，雖然手術(shù)、化療、放療等常規(guī)治療手段取得了很大進(jìn)展，但肺癌整體5年生存率僅為15%。靶向治療的出現(xiàn)給肺癌的治療帶來了革命性的變化，但獲得性耐藥的出現(xiàn)不可避免地阻礙了治療的效果[4]。

腫瘤是一類細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制破壞的疾病，在細(xì)胞周期進(jìn)程的整套監(jiān)督體系中，細(xì)胞周期檢測點(diǎn)發(fā)揮著核心的作用。Chk1和Chk2是細(xì)胞周期檢測點(diǎn)中非常重要的蛋白激酶，它們通過信號傳導(dǎo)和放大，調(diào)節(jié)下游靶蛋白活性與表達(dá)，使細(xì)胞周期出現(xiàn)阻滯[5]。化療藥物耐藥是導(dǎo)致腫瘤患者復(fù)發(fā)、治療難度加大、治療失敗和預(yù)后不良的重要原因，而DNA損傷應(yīng)答（DNA damage response, DDR）是影響腫瘤化療耐藥的一個(gè)重要途徑，靶向DDR成分中DNA修復(fù)相關(guān)激酶或檢測點(diǎn)可以提供新的解決方案。近年來，調(diào)控DDR這一過程中，Chk1及Chk2分子引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，人們期望引發(fā)有絲分裂災(zāi)難從而促進(jìn)細(xì)胞死亡，而Chk1和Chk2正是癌癥治療中有前景的靶點(diǎn)[6]。目前已有Chk抑制劑應(yīng)用于臨床，并在肺癌中取得了成效，其通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期阻滯，從而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞周期失調(diào)引起的獲得性耐藥。

1 Chk概述

Chk1，最初在1993年發(fā)現(xiàn)，是一種絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶，在裂殖酵母菌的DNA損傷反應(yīng)中控制著G2期/M期的轉(zhuǎn)變。人類Chk1基因位于染色體11q22‐23，由476個(gè)氨基酸殘基組成，在進(jìn)化上高度保守。同時(shí)，Chk1也是脊椎動(dòng)物細(xì)胞中DNA損傷和復(fù)制檢查點(diǎn)的主調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和參與DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，并且可以影響細(xì)胞的存活和凋亡[7]。

Chk2，由N端SQ/TQ簇結(jié)構(gòu)域（SQ/TQ cluster domain,SCD）、中心叉頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域（forkhead associated domain,FHA）和C端絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain,KD）構(gòu)成。人類Chk2基因位于染色體 22q12.1，由543個(gè)氨基酸殘基組成。Chk2是DNA損傷反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和腫瘤抑制因子，也是細(xì)胞存活和各種病理生理過程的重要監(jiān)督者，參與促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯、凋亡和DNA修復(fù)[8,9]。

人類基因組DNA常常受到多種因素的威脅，包括來自內(nèi)部和外部因素的影響，如復(fù)制應(yīng)激、電離輻射、X射線暴露和化療藥物等。這些因素的共同作用，使得DNA損傷在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中反復(fù)發(fā)生，觸發(fā)DDR[10]。正常細(xì)胞有完整的G1期、S期和G2期/M期檢測點(diǎn)，細(xì)胞的存活依賴于激活檢測點(diǎn)，引起細(xì)胞周期阻滯而啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，而其中參與DDR途徑的兩種關(guān)鍵檢測點(diǎn)激酶，分別為Chk1和Chk2[6]。Chk1使細(xì)胞周期停滯在S期或G2期/M 期，阻止DNA受損的細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂[11]；Chk2參與細(xì)胞周期G1期，S期或G2期/M期的阻滯，促進(jìn)細(xì)胞對損傷進(jìn)行修復(fù)，維持基因組的穩(wěn)定。P53在控制G1期檢測點(diǎn)方面起著核心作用，而大多數(shù)癌癥由于p53的缺乏導(dǎo)致G1期檢測點(diǎn)調(diào)控缺陷，迫使癌細(xì)胞在DNA損傷后高度依賴于Chk1激活的S期和G2期/M期檢測點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)[12]。

當(dāng)發(fā)生DNA斷裂時(shí)，Chk1和Chk2分別由共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥和Rad3相關(guān)激酶（ataxia telangiectasia and Rad3 related kinase, ATR）和共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變激酶（ataxia telangiectasia mutated kinase, ATM）磷酸化激活，形成兩條經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，即ATR‐Chk1‐細(xì)胞分裂周期蛋白25（cell division cyclin 25, Cdc25）和ATM‐Chk2‐Cdc25信號通路[13,14]。當(dāng)DNA發(fā)生單鏈斷裂（single‐strand breaks, SSBs）時(shí)，ATR‐Chk1‐Cdc25信號通路被激活，啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)。上游的ATR將DNA的受損信號通過中介因子傳遞至Chk1，Chk1定位聚集在DNA損傷位點(diǎn)，并被ATR在Ser317和Ser345這兩個(gè)位點(diǎn)磷酸化而被激活，然后Chk1磷酸化抑制其下游的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin‐dependent kinase, CDK）激活物Cdc25A，使Cdc25A加速泛素化并降解，從而抑制CDK的激活，促使細(xì)胞周期在S期/G2期或G2期/M期阻滯[15,16]。當(dāng)DNA發(fā)生雙鏈斷裂（double‐strand breaks, DSBs）時(shí)，ATM‐Chk2‐Cdc25信號通路被激活。Chk2基因突變后，其編碼的激酶會喪失活性，無法修復(fù)損傷的DNA，受損傷的DNA不斷復(fù)制，產(chǎn)生大量異常細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致癌變。Chk2作為一個(gè)高度保守的蛋白激酶，在修復(fù)過程中起著重要的作用[17]。其在復(fù)制缺陷、電離輻射及靶向DNA的藥物等時(shí)被激活，活化的Chk2可以磷酸化并且穩(wěn)定20多種底物蛋白，包括細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（E2F transcription factor 1, E2F‐1）、乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1, BRCA1）、P53、Cdc25A、Cdc25C等，使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，同時(shí)激活修復(fù)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞對損傷的修復(fù)[18]。

2 Chk與腫瘤耐藥

大量研究表明，Chk1和Chk2在正常細(xì)胞中均有一定程度的表達(dá)，但在腫瘤細(xì)胞中卻表現(xiàn)為表達(dá)水平的異常。目前認(rèn)為，Chk1在腫瘤細(xì)胞或組織中高表達(dá)，對腫瘤的增殖和生存發(fā)揮重要作用；而Chk2在腫瘤中的表達(dá)尚不一致，其缺失或過表達(dá)都可能會影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力的增強(qiáng)是獲得性化療耐藥的機(jī)制之一。隨著Chk1抑制劑和Chk1/Chk2雙重抑制劑在臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用，Chk1和Chk2在腫瘤耐藥中的重要地位正逐步得到認(rèn)可。

2.1 Chk1與腫瘤耐藥 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Chk1在多種人類腫瘤中過表達(dá)，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、肝癌、胃癌和鼻咽癌[19]。值得注意的是，它的表達(dá)往往與腫瘤分級和疾病復(fù)發(fā)呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Chk1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞更能耐受放療、化療或其他腫瘤治療方法引起的DNA損傷反應(yīng)，促進(jìn)產(chǎn)生惡性程度更高的腫瘤細(xì)胞，并可導(dǎo)致耐藥現(xiàn)象的發(fā)生及腫瘤的頻繁復(fù)發(fā)。Nieto等[20]研究發(fā)現(xiàn)，抑制Chk1可以克服基底樣乳腺癌對順鉑的獲得性耐藥。Fan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，沉默Chk1抑制了慢性髓系白血?。╟hronic myeloid leukemia, CML）細(xì)胞的增殖，且增強(qiáng)了依托泊苷（etoposide,VP16）的細(xì)胞毒性作用。其通過降低BRCA1的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，削弱同源重組（homologous recombination,HR）修復(fù)。Nair等[22]研究發(fā)現(xiàn)一種治療高級別漿液性卵巢癌的新機(jī)制，在Chk1抑制劑的作用下抑制HR，使腫瘤耐藥細(xì)胞對脫氧核糖核酸損傷劑如吉西他濱或羥基脲敏感，從而導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難和細(xì)胞死亡。由此可見，抑制Chk1或其抑制劑與產(chǎn)生DNA損傷的藥物（如鉑化合物、吉西他濱和PARP抑制劑奧拉帕尼）可以在體外對腫瘤遷移、侵襲能力和細(xì)胞凋亡有協(xié)同作用。靶向DNA修復(fù)機(jī)制已經(jīng)在臨床得到應(yīng)用，Chk1抑制劑聯(lián)合一線抗腫瘤藥物，比單獨(dú)或雙聯(lián)用具有更高的活性，導(dǎo)致更高的凋亡效應(yīng)。

2.2 Chk2與腫瘤耐藥 研究[23‐25]發(fā)現(xiàn)，在多種癌癥的細(xì)胞系中也存在Chk2的改變。Chk2已被證實(shí)是一種腫瘤抑制因子，并且在一些癌癥中發(fā)生突變或減少，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、卵巢癌和前列腺癌。Chk2的低表達(dá)或缺失對腫瘤有保護(hù)作用，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Luo等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在三陰乳腺癌Chk2 Y390C突變型MDA‐MB‐231細(xì)胞系中，通過激活P53和Chk2‐P53凋亡通路，調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，可以誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞對化療藥物耐藥。Yao等[27]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制ATM‐Chk2‐P53信號通路可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致5‐氟尿嘧啶（5‐fluorouracil, 5‐FU）耐藥。Ta等[28]研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者樣本中Chk2的表達(dá)下降，認(rèn)為Chk2是前列腺癌生長的負(fù)調(diào)控因子，且干擾Chk2信號可能成為治療前列腺癌的一種新方法。由此可見，Chk2的活化和Chk2的低表達(dá)都可能與腫瘤有關(guān)，其有助于增加腫瘤的侵襲性，且與部分腫瘤的發(fā)生發(fā)展、耐藥也存在一定的相關(guān)性。然而，另有相關(guān)研究[29]發(fā)現(xiàn)，Chk2在食管癌、肝癌、胃癌、高級別漿液性卵巢癌等腫瘤中卻存在高表達(dá)。因此，對于Chk2和腫瘤之間的調(diào)控機(jī)制，還需進(jìn)一步的研究和探討。

3 Chk與肺癌耐藥

隨著肺癌治療藥物在臨床的廣泛使用，其耐藥性問題越來越突出，已經(jīng)成為臨床治療的主要障礙。當(dāng)發(fā)生DNA受損時(shí)，Chk可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期延遲或阻滯，為DNA損傷修復(fù)提供時(shí)間。近年來，關(guān)于Chk表達(dá)及其抑制劑與肺癌耐藥的研究越來越多，通過解除S期和G2期檢測點(diǎn)可提高DNA損傷試劑對癌細(xì)胞的靈敏度并提高其選擇性。有研究[30]表明，不僅可以通過應(yīng)用Chk抑制劑聯(lián)合化療或放療來逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥，也可以通過單獨(dú)使用Chk抑制劑終止癌細(xì)胞的增殖。

3.1 Chk1與肺癌耐藥 正常細(xì)胞中Chk1的表達(dá)極低，而在肺癌組織中，約90%存在Chk1的表達(dá)，其基因和蛋白的異常表達(dá)能誘導(dǎo)細(xì)胞惡性增殖，進(jìn)而促使腫瘤的進(jìn)展。研究認(rèn)為，當(dāng)Chk1被抑制時(shí)癌細(xì)胞會失去對DNA損傷的反應(yīng)和修復(fù)能力，從而增強(qiáng)放化療對細(xì)胞的殺傷力。Cai等[31]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)‐box蛋白成員Fbxo6，可以通過降低NSCLC中Chk1的表達(dá)和磷酸化，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高對順鉑（cisplatin, DDP）的敏感性。由此可見，F(xiàn)bxo6可能是一種有效的治療靶點(diǎn)，可以克服鉑類化療藥物在NSCLC患者中的化療耐藥性。Duan等[32]研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)組蛋白去甲基酶家族JMJD2s，其化學(xué)抑制劑使順鉑耐藥NSCLC細(xì)胞敏感化。抑制JMJD2降低了ATR和Chk1的染色質(zhì)關(guān)聯(lián)，并抑制了ATR‐Chk1復(fù)制檢測點(diǎn)，結(jié)果表明，JMJD2去甲基化酶是克服順鉑耐藥的潛在治療靶點(diǎn)。

與此同時(shí)，通過解除Chk1對細(xì)胞周期檢測點(diǎn)的阻滯作用進(jìn)而促使腫瘤細(xì)胞凋亡，這一機(jī)制成為了目前腫瘤研究的新熱點(diǎn)，同時(shí)也是眾多學(xué)者尋找潛在的Chk1抑制劑的研究基礎(chǔ)。目前已有多種Chk1抑制劑應(yīng)用于臨床，或進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。

AZD7762是一種強(qiáng)效的Chk1/2雙抑制劑，也是一種ATP競爭性藥物，能夠抑制Chk1介導(dǎo)的Cdc25C磷酸化[33]。Grabauskiene等[34]研究發(fā)現(xiàn)，與低Chk1表達(dá)的H1993細(xì)胞相比，AZD7762抑制Chk1會優(yōu)先使高Chk1表達(dá)的細(xì)胞H1299對抗代謝藥物化療敏感。其對于Chk1蛋白表達(dá)水平較高的腫瘤亞群有更強(qiáng)的治療效果。AZD7762聯(lián)合化療藥物可降低腫瘤生長，尤其是p53突變或缺失的腫瘤。Hsu等[35]研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合AZD7762與DDP可以通過激活caspase‐2和下調(diào)E2F‐1，協(xié)同誘導(dǎo)p53缺失的小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）細(xì)胞有絲分裂死亡，抑制Chk1增強(qiáng)了DDP的抗腫瘤活性，并克服了SCLC對DDP的耐藥性。

LY2606368（Prexasertib）是一種Chk1/2雙重抑制劑，在體外優(yōu)先結(jié)合并抑制Chk1[36]。Zhao等[37]研究發(fā)現(xiàn)在SCLC中，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子Wee1的DNA拷貝數(shù)、mRNA和蛋白水平與細(xì)胞耐Prexasertib的程度呈正相關(guān)。Wee1 siRNA或Wee1抑制劑可逆轉(zhuǎn)SCLC細(xì)胞對Prexasertib的耐藥；而Wee1轉(zhuǎn)染可誘導(dǎo)細(xì)胞中的Prexasertib耐藥性。聯(lián)合應(yīng)用Chk1和Wee1抑制劑可能為SCLC的治療提供一種新的治療策略。

MK‐8776是一種選擇性Chk1抑制劑，在異種移植模型中與DNA抗代謝物羥基脲、吉西他濱或培美曲塞聯(lián)合使用時(shí)，可誘導(dǎo)DSBs和細(xì)胞死亡[38]。Dai等[39]研究發(fā)現(xiàn)，減少范可尼貧血互補(bǔ)群基因D2（Fanconi anemia complementation group D2, FANCD2）聯(lián)合MK‐8776顯著增強(qiáng)了吉西他濱對兩株肺癌細(xì)胞SK‐MES‐1和KLN205的細(xì)胞毒性。吉西他濱作用的增強(qiáng)伴隨著DNA修復(fù)功能的喪失和DNA單鏈斷裂和雙鏈斷裂的積累，同時(shí)caspase‐3依賴性凋亡明顯增加。

由此可見，抑制Chk1或使用Chk1抑制劑可能在肺癌耐藥治療中發(fā)揮著對藥物增敏的作用。然而，也有研究表明，Chk1可能并不是腫瘤抑制因子，相反，它促進(jìn)腫瘤生長，對抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥。研究[40]還發(fā)現(xiàn)過度激活Chk1對腫瘤細(xì)胞的生長反而有害，因此認(rèn)為通過激活而不是抑制Chk1可以達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的，其可能發(fā)展成為癌癥治療的一種創(chuàng)新方法。

3.2 Chk2與肺癌耐藥 Chk2在腫瘤中的表達(dá)水平與腫瘤相關(guān)性的研究尚不十分清楚，到目前為止，只有少數(shù)研究報(bào)道了Chk2在原發(fā)性患者組織中的表達(dá)。與正常組織相比，Chk2在肺癌中表達(dá)缺失或下調(diào)，低水平的Chk2在肺癌中被認(rèn)為是導(dǎo)致化療耐藥的原因[41]。Wu等[42]研究發(fā)現(xiàn)泛素特異肽酶39（ubiquitin specific peptidase39, USP39）是Chk2的一個(gè)新的調(diào)節(jié)分子。它是一種去泛素化酶，可將泛素化的Chk2去泛素化并穩(wěn)定Chk2，從而提高Chk2的穩(wěn)定性。此外，敲除USP39可以導(dǎo)致Chk2蛋白水平顯著降低，進(jìn)而調(diào)節(jié)G2期/M期檢測點(diǎn)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞對化療藥物和放療的耐藥。Luo等[43]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑MG132可選擇性地上調(diào)A549細(xì)胞中主要組織相容性復(fù)合體I類多肽相關(guān)序列B（major histocompatibility complex class I polypeptide related sequence B, MICB）的表達(dá)，并增加自然殺傷（natural killer, NK）細(xì)胞的細(xì)胞毒性。MG132的調(diào)控作用可能與Chk2的激活有關(guān)，MG132聯(lián)合NK細(xì)胞免疫治療可能有協(xié)同作用，提高肺癌治療效果。Lin等[44]研究發(fā)現(xiàn)，11‐脫氫水杉內(nèi)酯是一種具有抗腫瘤生物學(xué)特性的軟珊瑚化合物，其通過上調(diào)P53和Bax，激活A(yù)TM和Chk2，激活caspase‐3和caspase‐7，誘導(dǎo)G2期/M期細(xì)胞周期阻滯和凋亡，從而抑制Akt通路。由此表明11‐脫氫白藜蘆醇內(nèi)酯可能是一種有前途的治療SCLC的化療藥物。

此外，目前已有學(xué)者以Chk2為治療靶點(diǎn)開發(fā)Chk2抑制劑，但研究發(fā)現(xiàn)其普遍對Chk1也存在抑制作用，在臨床前評估中缺乏特異性。其他臨床前數(shù)據(jù)和早期臨床研究表明，Chk1/2雙重抑制劑在實(shí)體腫瘤中取得了良好的抗腫瘤效果。因此，針對Chk1與Chk2在肺癌的聯(lián)合研究可能對肺癌耐藥的治療有更重要的意義。

4 總結(jié)與展望

肺癌是全球最常見的診斷癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的最主要原因。目前臨床腫瘤治療藥物均有不同程度的毒副作用，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對正常的組織細(xì)胞也有損傷作用，且腫瘤細(xì)胞幾乎都會產(chǎn)生耐藥性，尤其是多藥耐藥性（multidrug resistance, MDR）[45]。因此，開發(fā)針對肺癌耐藥作用機(jī)制的治療靶點(diǎn)和治療方法，逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥，可以為臨床針對肺癌的治療提供新的策略和思路。

Chk在DDR及細(xì)胞周期調(diào)控中具有重要作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)、耐藥及預(yù)后相關(guān)，可能是一個(gè)潛在的抗腫瘤治療靶點(diǎn)。目前越來越多針對Chk特異性的抑制劑被開發(fā)，使得它的作用在臨床前環(huán)境中得到了廣泛的探索。研究證實(shí)，Chk的表達(dá)及其抑制劑的應(yīng)用對逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥有一定的效果，但是能否僅通過調(diào)控Chk，從而直接抑制腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展尚不是非常的明確。此外，除了與化療藥物聯(lián)合，Chk抑制劑與其他靶向S期和G2期/M期檢測點(diǎn)的抑制劑組合能否在肺癌耐藥治療中取得滿意療效，還需進(jìn)一步探究。雖然Chk抑制劑在化療增加藥物敏感性方面的前景可期，但部分抑制劑的穩(wěn)定性和安全性還有待進(jìn)一步的證實(shí)。未來，深入了解Chk1和Chk2在肺癌耐藥中的作用，將有望提高肺癌的治療效果，為肺癌患者帶來更好的生存及預(yù)后。