薛昌越， 譚 洋， 王亞靜

1南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔種植科，南京 2100292中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院病理科，深圳 5181073貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，貴陽 550000

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一種螺旋形、微厭氧、對生長條件要求十分苛刻的革蘭陰性桿菌，與胃炎、十二指腸潰瘍等消化道疾病密切相關(guān)[1]。1989年，Krajden等[2]從胃炎患者的牙菌斑中分離出H.pylori，并推測口腔可能也是H.pylori的“蓄水池”。同年，Shames等[3]利用DNA限制性內(nèi)切酶分析，確定胃與牙菌斑中的H.pylori是同一株?？谇会t(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)W者已經(jīng)開始更多關(guān)注H.pylori和口腔疾病的關(guān)聯(lián)性。一些口腔慢性病，如牙周炎等已被證實(shí)與H.pylori感染具有相關(guān)性[4-6]。也有研究在種植牙的齦下菌斑中檢出了H.pylori[7-8]。

目前認(rèn)為，菌斑生物膜是種植體周圍炎的主要致病因素，種植體周圍菌群失調(diào)引發(fā)了宿主炎癥反應(yīng)[9]。健康的種植體周圍菌落主要包括變形鏈球菌等革蘭陽性菌，而革蘭陰性菌所占比例相對較小。在種植體周圍炎位點(diǎn)，革蘭陰性厭氧菌成為了細(xì)菌群落的主要組成部分。其中，有18.6%的種植體周圍感染是由革蘭陰性需氧菌引起的，其余大多數(shù)病例是由革蘭陰性厭氧菌引起[10]?？谇籋.pylori作為口腔中常見的革蘭陰性微厭氧菌，是否是種植體周圍炎的危險(xiǎn)因素尚未得到深入研究。

因此，在本研究中，我們調(diào)查了南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科常規(guī)隨訪的患者中，H.pylori檢出情況與發(fā)生種植體周圍炎的關(guān)系，并進(jìn)一步研究了種植體周圍炎的典型臨床指標(biāo)與口腔H.pylori感染的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

本研究得到了南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，共有130位在口腔種植科隨訪復(fù)查的患者參與。所有納入患者均對本研究知情同意，并簽訂知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)為：無全身系統(tǒng)性疾病，非吸煙者或戒煙超過6個(gè)月。牙周炎患者需進(jìn)行系統(tǒng)的牙周治療，待牙周炎癥控制穩(wěn)定后再行種植治療。無服用抗生素或免疫抑制劑史。女性患者未處于孕期或哺乳期。所有受試者至少有1個(gè)種植體位于磨牙區(qū)，并且至少行使功能1年。納入患者全口天然牙不少于20顆，無咬合創(chuàng)傷，無正畸裝置或口腔黏膜病變，能配合調(diào)查和取樣程序。將患者分為兩組：種植體周圍炎組和非種植體周圍炎組(對照組)。

在種植周圍炎組，每個(gè)患者選擇一個(gè)未經(jīng)治療的磨牙區(qū)種植牙進(jìn)行檢測，該種植牙必須達(dá)到Lang教授[11]支持療法的D級，即探診深度(PD)≥5 mm，探診出血(BOP)(+)，骨喪失≥3 mm。對照組患者被檢測的磨牙區(qū)種植牙需為BOP(-)，PD<5 mm，無溢膿癥狀。

1.2 臨床檢查

使用North Carolina牙周探針(PCPNU-15，Hu-Friedy，美國)在每個(gè)牙種植體的6個(gè)位點(diǎn)(近頰、頰、遠(yuǎn)頰、遠(yuǎn)舌、舌和近舌)進(jìn)行PD測量，并記錄最大值，同時(shí)記錄位點(diǎn)的BOP和溢膿情況。所有臨床檢查都是由同一位經(jīng)過訓(xùn)練的醫(yī)師進(jìn)行。

1.3 樣本采集

每例患者PD最深的位點(diǎn)用于取樣。在記錄臨床參數(shù)后，清除齦上菌斑，并用單獨(dú)的無菌Gracey刮匙收集種植牙齦下的生物膜樣本。將每個(gè)生物膜樣品立即放入一個(gè)單獨(dú)的、含有緩沖液(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 7.6)的Eppendorf管中(Sarstedt，Nümbrecht，德國)，密封、編碼并儲存在-4℃下，以待聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析。

1.4 PCR技術(shù)檢測H.pylori

根據(jù)制造商的說明，通過QIgen DNA微型試劑盒(51306，QIAGEN，德國)對提取樣本中的H.pylori進(jìn)行鑒定。使用Ismail等[12]描述的引物和方法檢測，每組PCR均采用陽性和陰性對照。在260/280 nm吸光度和1%瓊脂糖凝膠電泳條件下，用分光光度法測定DNA的含量和純度。

1.5 特異性免疫組化染色

從3個(gè)種植體周圍炎組樣本中提取的種植體周圍肉芽組織用甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片。石蠟切片脫蠟洗滌。將800 mL檸檬酸鹽抗原修復(fù)工作液(MVS-0100，邁新生物，中國)加熱至沸騰。將切片放在染色架上，然后放入沸騰的工作液中2 min。待制劑冷卻至室溫后，取出切片，然后用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗3 min。根據(jù)幽門螺桿菌檢測試劑盒(IHP-3041，邁新生物，中國)提供的說明，使用幽門螺桿菌抗體(MAB-0692，邁新生物，中國)對切片進(jìn)行染色，并在顯微鏡下檢查。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析。用卡方檢驗(yàn)和Fisher精確概率法檢驗(yàn)分析種植體周圍炎的發(fā)生與口腔H.pylori的關(guān)系。采用比值比(OR)和95%可信區(qū)間(95%CI)評估口腔H.pylori感染與種植體周圍炎臨床指標(biāo)間的相關(guān)性。用t檢驗(yàn)比較H.pylori陽性位點(diǎn)和陰性位點(diǎn)探診深度的差異。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本中口腔H.pylori檢測情況

種植體周圍炎組和對照組中，均有位點(diǎn)能夠檢測到口腔H.pylori。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，H.pylori陽性條帶位于295 bp處。

M：相對分子質(zhì)量Marker，A：H.pylori陽性對照，B：陰性對照(變形鏈球菌DNA)，C：空白對照(無菌雙蒸水)，D：H.pylori陽性樣本，E：H.pylori陰性樣本圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of the PCR amplification products

H.pylori特異性免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，在所提取的3個(gè)種植體周圍炎位點(diǎn)肉芽組織樣本中均檢測到了H.pylori菌株。染色圖像中H.pylori菌株呈棕黃色，背景為藍(lán)色。特異性染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了種植體周圍軟組織中H.pylori的存在(圖2)。

圖2 種植體周圍肉芽組織中H.pylori特異性免疫組化染色Fig.2 Immunohistochemical staining of Helicobacter pylori in granulation tissue around the implant

2.2 種植體周圍炎組和對照組H.pylori的陽性率

130例患者中，對照組(n=63)納入了女性36例，男性27例，平均年齡(45.7±13.3)歲；種植體周圍炎組(n=67)納入34例女性患者和33例男性患者，平均年齡為(52.0±10.3)歲。

在130例患者中，66例(50.8%)患者的66個(gè)種植牙位點(diǎn)齦下菌斑中檢測出了H.pylori。對照組H.pylori陽性率為41.27%(26/63)，種植體周圍炎組為59.70%(40/67)。種植體周圍炎組的H.pylori感染率高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示H.pylori陽性可能增加種植體周圍炎的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。此外，OR值為2.11(95%CI：1.047～4.245)，進(jìn)一步表明H.pylori陽性與種植體周圍炎的相關(guān)性。

2.3 H.pylori陽性與各臨床指標(biāo)的關(guān)系

種植體周圍炎組(n=67)的所有檢測位點(diǎn)均表現(xiàn)為BOP(+)和PD≥5 mm，有32個(gè)部位出現(xiàn)溢膿癥狀。在這32個(gè)部位中，14個(gè)位點(diǎn)(43.75%)呈H.pylori陽性。在3項(xiàng)臨床指標(biāo)中，溢膿位點(diǎn)的陽性率最低，但與對照組健康位點(diǎn)相比，陽性率差異依然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 H.pylori感染與種植體周圍炎臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 1 Correlation between Helicobacter pyloriand indicators of peri-implantitis

比值比結(jié)果表明，位點(diǎn)中H.pylori的存在與BOP(+)(OR：2.11，95%CI：1.047～4.245)、溢膿(OR：1.11，95%CI：0.468～2.615)和PD≥5 mm(OR：2.11，95%CI：1.047～4.245)這3項(xiàng)臨床指標(biāo)均具有相關(guān)性。

圖3的結(jié)果表明，在種植體周圍炎組中，H.pylori的檢出隨著PD的增加總體呈現(xiàn)略微降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，我們還分別統(tǒng)計(jì)了所有130名患者H.pylori陽性位點(diǎn)和陰性位點(diǎn)的平均探診深度，結(jié)果表明，H.pylori陽性部位的平均PD為(5.00±1.96)mm，H.pylori陰性部位的平均PD為(4.69±2.03)mm，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 H.pylori陽性率與探診深度的關(guān)系Fig.3 Correlation between positive rate of Helicobacter pylori and probing depth

3 討論

在發(fā)達(dá)國家，H.pylori的感染率為25%～28%[13]，發(fā)展中國家的感染率則高達(dá)70%[14]。中國人飲食習(xí)慣不采取分餐制，受此文化影響，我國H.pylori感染者的數(shù)量約為7.68億，占總?cè)丝诘?0%左右[15-16]。國內(nèi)已有多項(xiàng)關(guān)于口腔中的H.pylori與牙周炎的相關(guān)性研究[17-18]，結(jié)果表明，慢性牙周炎位點(diǎn)中H.pylori的陽性率約為60%～70%，略高于本研究中種植體周圍炎患者的陽性率。牙周健康患者的陽性率為35%～40%，略低于本研究中健康種植體的陽性率。

目前還沒有明確的檢測口腔內(nèi)H.pylori的金標(biāo)準(zhǔn)，PCR是現(xiàn)在最為精確的檢測技術(shù)，其高靈敏度可檢測低數(shù)量的H.pylori并可鑒定其毒力基因[19-20]。而免疫組化檢測采用高純度抗H.pylori的IgG，具有較高的敏感性，能特異性地檢測組織中的H.pylori及其片段。在顯微鏡下，H.pylori的存在、數(shù)量、分布和侵襲深度都能被清楚地識別出來，比許多其他鑒定方法更為直觀。本研究對種植體周圍炎肉芽組織的特異性免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了種植體周圍存在H.pylori。

在本研究中，種植體周圍炎位點(diǎn)H.pylori陽性率(59.70%)顯著高于對照組(41.27%)。而對照組的部分健康位點(diǎn)也能檢測到H.pylori的存在，提示種植體周圍炎的發(fā)生發(fā)展不僅與某一種細(xì)菌的存在與否有關(guān)，還與宿主的易感性，致病菌的毒力，定植細(xì)菌的數(shù)量，細(xì)菌與細(xì)菌之間、細(xì)菌與宿主間相互作用等因素有關(guān)。

種植體周圍炎有4個(gè)主要臨床特征：探診出血、溢膿、探診深度增加和影像學(xué)的骨喪失?？紤]到影像學(xué)根尖片投照技術(shù)存在的失真和誤差，本研究未納入“影像學(xué)的骨喪失”這一臨床指標(biāo)。研究中我們發(fā)現(xiàn)，H.pylori陽性部位更容易發(fā)生探診出血，這是由于種植牙周袋內(nèi)的潰瘍造成的。H.pylori引起種植牙周袋內(nèi)潰瘍的機(jī)制可能與H.pylori引起胃潰瘍的機(jī)制相類似。

溢膿為組織被病菌感染所引發(fā)的病理變化，而種植體周圍溢膿位點(diǎn)的H.pylori陽性率遠(yuǎn)低于BOP(+)和PD≥5 mm位點(diǎn)的H.pylori陽性率，這可能與H.pylori生長的苛刻條件有關(guān)，存在膿液的微環(huán)境或不利于H.pylori的增殖。此外，作為一種微厭氧菌，H.pylori不能在大氣或無氧環(huán)境中生存[21]。在種植體周圍炎組中，盡管結(jié)果沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但隨著PD的增加，H.pylori的檢出率大致呈略微下降的趨勢，這一現(xiàn)象可能是由于過深的種植體周圍齦袋對H.pylori來說含氧量過低，而具體原因和機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。此外，未能對種植牙周圍軟組織中的口腔H.pylori進(jìn)行定量分析評估是本研究存在的另一個(gè)局限。

綜上，本研究證實(shí)了口腔種植位點(diǎn)H.pylori的感染與種植體周圍炎及其重要的臨床指標(biāo)具有相關(guān)性。本研究結(jié)果為種植體周圍炎的病因提供了新的觀點(diǎn)，并為其治療提供了新思路。今后，針對幽門螺桿菌的感染，應(yīng)加強(qiáng)消化科、口腔牙周科、口腔種植科醫(yī)生之間的臨床合作。