王嘉明，郭麗敏，郭艷娟，程國良

急性心力衰竭等心血管疾病是臨床常見疾病，其發(fā)病率高且患者預后較差，已嚴重影響患者生活質(zhì)量，研究表明心肌細胞凋亡是引發(fā)心血管疾病發(fā)生的主要原因之一[1,2]。因而尋找心肌細胞凋亡相關基因或蛋白有助于提高心血管疾病治療效果及改善患者預后。微小RNA（miRNA）屬于內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，其可通過靶向調(diào)控下游靶基因表達從而影響細胞增殖、凋亡等生物學行為，研究表明miRNA在心肌細胞中異常表達并可能調(diào)控細胞增殖及凋亡等生物學過程[3]。相關報道指出微小RNA-148b-3p（miR-148b-3p）在缺氧/復氧誘導的心肌細胞中表達上調(diào)并可能參與心肌細胞損傷過程[4]。通過生物信息學分析顯示細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B（CDKN1B）可能是miR-148b-3p的靶基因，研究表明CDKN1B表達下調(diào)并可能參與成纖維細胞增殖過程[5]。但miR-148b-3p是否可通過調(diào)控CDKN1B表達從而影響心肌細胞增殖及凋亡過程尚未可知。既往研究顯示脂多糖（LPS）可誘導心肌細胞凋亡并可造成心肌細胞損傷從而促進心血管疾病的發(fā)生[6]。因此，本研究采用LPS處理心肌細胞，探討miR-148b-3p對LPS誘導的心肌細胞增殖及凋亡的影響，分析其對CDKN1B的靶向調(diào)控作用，旨在為闡明miR-148b-3p在心肌損傷中的作用機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑大鼠心肌細胞H9c2購自美國ATCC細胞庫。杜氏改良培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清購自美國Gibco公司；LPS購自北京百奧萊博科技有限公司；Trizol試劑、Lipofectamine2000、pcDNA3.1購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；miR-148b-3p特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-148b-3p）及其陰性對照（anti-miR-NC）、miR-148b-3p寡核苷酸模擬物（miR-148b-3p mimics）及陰性對照mimic NC序列（miR-NC）、CDKN1B小分子干擾RNA（si-CDKN1B）、亂序無意義陰性序列（si-NC）購自上海吉瑪制藥技術有限公司；甲基噻唑基四唑（MTT）購自美國Sigma公司；膜聯(lián)蛋白V（annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡試劑盒購自上海朗智生物科技有限公司；RIPA裂解液與二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司；兔抗鼠CDKN1B抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；兔抗鼠細胞周期蛋白1（CyclinD1）、P21、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白（Bax）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗購自美國Abcam公司。

1.2 LPS處理與實驗分組心肌細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：37 ℃、體積分數(shù)5%CO2，待細胞生長至80%融合度時進行傳代培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期心肌細胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基終止消化，制備細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×105個/ml，接種于96孔板（100 μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用含有10 μg/ml的LPS處理H9c2細胞24 h，記作LPS組[7]。同時將正常培養(yǎng)的心肌細胞作為Con組。分別將antimiR-NC、anti-miR-148b-3p、pcDNA、pcDNACDKN1B、anti-miR-NC與si-NC、anti-miR-148b-3p與si-CDKN1B轉(zhuǎn)染至心肌細胞48 h，使用含有10 μg/ml的LPS處理H9c2細胞24 h，分別記作LPS+anti-miR-NC組、LPS+anti-miR-148b-3p組、LPS+pcDNA組、LPS+pcDNA-CDKN1B組、LPS+anti-miR-NC+si-NC組、LPS+anti-miR-148b-3p+si-CDKN1B組。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine2000試劑說明書進行操作。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測細胞中miR-148b-3p、CDKN1B mRNA的表達水平采用Trizol法提取各組心肌細胞中的總RNA，應用紫外分光光度計測定RNA濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，miR-148b-3p正向引物5’-GCGTCAGTGCATCACAGAA CTTTGT-3’，

反向引物5’-CGAATTCTAGAGCTCGAGGCA GGCGACA-3’；

CDKN1B正向引物5’-CAGACCCGGGAGAA AGATGT-3’，

反向引物5’-CCAAGTCCCGGGTTAACTCT-3’；

U6正向引物5’-ATTGGAACGATA CAGAGAAGATT-3’，

反向引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’；

GAPDH正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTA TTG-3’，

反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μl，MgSO4 2.5 μl，dNTPs 2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，RNase-Free ddH2O補足體系至25 μl；反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共40次循環(huán)。miR-148b-3p以U6為內(nèi)參，CDKN1B以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-148b-3p、CDKN1B mRNA的相對表達量。

1.4 MTT檢測細胞存活率收集各組對數(shù)期心肌細胞接種于96孔板（3×104個/孔），每孔中加入20 μl MTT，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，4 ℃條件下經(jīng)3000 r/min離心15 min，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），應用酶標儀檢測各孔在波長為490 nm處的相對吸光度值（OD），計算細胞存活率（%）=（各實驗組OD值-空白對照組OD值）/（正常對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率收集各組對數(shù)期心肌細胞，預冷PBS洗滌，4 ℃條件下經(jīng)3000 r/min離心15 min，棄上清，PBS再次洗滌，相同條件下離心，棄上清，加入5 μl Annexin V-FITC，充分混勻，加入5 μl PI，充分混勻，室溫避光孵育10 min，應用FACS Calibur流式細胞儀及Cellauest軟件檢測各組細胞凋亡率。

1.6 雙熒光素酶報告基因檢測miR-148b-3p的靶基因TarBase v.8預測顯示miR-148b-3p與CDKN1B的3’UTR區(qū)存在結(jié)合位點，利用基因技術將結(jié)合位點進行突變，分別將含有結(jié)合位點及突變位點的CDKN1B的3’UTR插入熒光素酶報告基因載體構(gòu)建野生型載體WT-CDKN1B、突變型載體MUT-CDKN1B，分別將miR-NC、miR-148b-3p mimics與WT-CDKN1B、MUT-CDKN1B共轉(zhuǎn)染至心肌細胞，參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，按照熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測各組熒光素酶活性。

1.7 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測CDKN1B、CyclinD1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表達收集各組對數(shù)期心肌細胞，加入400 μl RIPA，冰上裂解30 min，4 ℃條件下經(jīng)12 000 r/min離心10 min，提取細胞總蛋白。采用BCA法檢測蛋白濃度，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。蛋白樣品中加入上樣緩沖液，沸水煮10 min，蛋白變性。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫條件下使用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入目的蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白一抗稀釋液（1:1000），4 ℃孵育24 h，加入二抗稀釋液（1:5000），TBST洗膜，滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，應用Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細胞中miR-148b-3p與CDKN1B的表達量比較與Con組比較，LPS組心肌細胞中miR-148b-3p的表達水平顯著升高（P＜0.05），CDKN1B mRNA及蛋白水平顯著降低（P＜0.05）（圖1、表1）。

2.2 抑制miR-148b-3p表達對心肌細胞增殖及凋亡的影響與Con組比較，LPS組心肌細胞存活率顯著降低（P＜0.05），細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05），P21、Bax蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS+anti-miR-NC組比較，LPS+anti-miR-148b-3p組心肌細胞存活率顯著升高（P＜0.05），細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2蛋白水平顯著升高（P＜0.05），P21、Bax蛋白水平顯著降低（P＜0.05）（圖2、表2）。

圖1 Western blot法檢測心肌細胞中CDKN1B蛋白表達

表1 心肌細胞中miR-148b-3p與CDKN1B的表達量比較（，n=9）

表1 心肌細胞中miR-148b-3p與CDKN1B的表達量比較（，n=9）

注：CDKN1B：細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B

指標 Con組 LPS組 P值miR-148b-3p 1.00±0.12 2.58±0.23* ＜0.001 CDKN1B mRNA 1.02±0.16 0.35±0.08* ＜0.001 CDKN1B蛋白 0.85±0.10 0.42±0.11* ＜0.001

2.3 CDKN1B過表達對心肌細胞增殖及凋亡的影響與LPS+pcDNA組比較，LPS+pcDNA-CDKN1B組心肌細胞存活率顯著升高（P＜0.05），細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2蛋白水平顯著升高（P＜0.05），P21、Bax蛋白水平顯著降低（P＜0.05）（圖3、表3）。

圖2 抑制miR-148b-3p表達對心肌細胞增殖及凋亡的影響（A：流式細胞術檢測細胞凋亡率；B：Western blot法檢測細胞增殖及凋亡相關蛋白表達

2.4 miR-148b-3p靶向調(diào)控CDKN1B的表達TarBase v.8預測顯示CDKN1B的3’UTR中含有與miR-148b-3p互補的核苷酸序列（圖4）。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型載體WT-CDKN1B的細胞實驗中，與miR-NC組比較，miR-148b-3p組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-CDKN1B的細胞實驗中，miR-148b-3p組熒光素酶活性與miRNC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表4）。與miR-NC組比較，miR-148b-3p組細胞中CDKN1B蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與antimiR-NC組比較，anti-miR-148b-3p組細胞中CDKN1B蛋白水平顯著升高（P＜0.05）（圖5、表5）。

2.5 沉默CDKN1B可減弱抑制miR-148b-3p表達對心肌細胞增殖及凋亡的作用與LPS+anti-miRNC+si-NC組比較，LPS+anti-miR-148b-3p+si-CDKN1B組細胞存活率顯著降低（P＜0.05），細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05），P21、Bax蛋白水平顯著升高（P＜0.05）（圖6、表6）。

3 討論

心血管疾病、癌癥等多種疾病發(fā)生及發(fā)展均可能受到miRNA的調(diào)控，研究表明miRNA可參與調(diào)控心血管疾病氧化損傷過程，還可影響心肌細胞凋亡[8-10]。但仍有部分miRNA在心肌細胞損傷過程中的調(diào)控機制尚未闡明。因而本研究積極探尋新型miRNA并分析其在心肌細胞損傷過程中的作用機制。

miR-148b-3p表達上調(diào)可通過抑制靶基因DNMT1表達從而影響關節(jié)炎的發(fā)生[11]。研究表明miR-148b-3p可能作為診斷急性缺血性卒中、心力衰竭等心血管疾病的潛在生物標志物[12,13]。本研究結(jié)果顯示LPS處理后心肌細胞中miR-148b-3p的表達水平顯著升高，提示miR-148b-3p在心肌細胞損傷過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。細胞增殖與凋亡失衡可引發(fā)多種疾病發(fā)生及發(fā)展，研究表明細胞增殖與細胞周期密切相關，CyclinD1可正向調(diào)控細胞周期，促進細胞增殖，而P21可負向調(diào)控細胞周期，抑制細胞增殖[14]。細胞凋亡過程受到細胞內(nèi)抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白的調(diào)控，Bcl-2屬于抗細胞凋亡蛋白，Bax屬于促細胞凋亡蛋白，并可通過線粒體途徑從而誘導細胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示LPS處理后心肌細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，CyclinD1、Bcl-2表達下調(diào)，P21、Bax表達上調(diào)，而抑制miR-148b-3p表達后可明顯減弱LPS對心肌細胞增殖及凋亡的作用。提示抑制miR-148b-3p表達可抑制LPS誘導的心肌細胞凋亡并促進細胞存活。

表2 抑制miR-148b-3p表達對心肌細胞增殖及凋亡的影響（，n=9）

表2 抑制miR-148b-3p表達對心肌細胞增殖及凋亡的影響（，n=9）

注：CyclinD1：細胞周期蛋白1；Bax：B淋巴細胞瘤-2相關蛋白；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2；與Con組比較，aP＜0.05；與LPS+anti-miR-NC組比較，bP＜0.05

項目 Con組 LPS組 LPS+anti-miR-NC組 LPS+anti-miR-148b-3p組 P值miR-148b-3p 1.01±0.13 2.57±0.16a 2.53±0.18 1.13±0.11b ＜0.001細胞存活率（%） 100.32±13.25 56.48±6.57a 57.65±8.54 87.65±10.03b ＜0.001細胞凋亡率（%） 7.79±0.25 25.64±1.25a 26.54±3.21 10.03±2.15b ＜0.001 CyclinD1 0.87±0.11 0.45±0.08a 0.43±0.10 0.75±0.13b ＜0.001 P21 0.40±0.09 0.89±0.13a 0.90±0.16 0.52±0.11b ＜0.001 Bax 0.46±0.11 0.95±0.18a 0.92±0.17 0.53±0.12b ＜0.001 Bcl-2 0.92±0.16 0.40±0.11a 0.41±0.13 0.82±0.15b ＜0.001

表3 CDKN1B過表達對心肌細胞增殖及凋亡的影響（，n=9）

表3 CDKN1B過表達對心肌細胞增殖及凋亡的影響（，n=9）

注：CyclinD1：細胞周期蛋白1；Bax：B淋巴細胞瘤-2相關蛋白；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2

項目 LPS+pcDNA組 LPS+pcDNA-CDKN1B組 P值CDKN1B蛋白 0.45±0.13 0.96±0.15* ＜0.001細胞存活率（%） 58.67±10.36 89.67±11.32* ＜0.001細胞凋亡率（%） 25.47±3.16 8.95±1.13* ＜0.001 CyclinD1 0.46±0.11 0.80±0.20* ＜0.001 P21 0.91±0.18 0.42±0.09* ＜0.001 Bax 0.90±0.13 0.42±0.08* ＜0.001 Bcl-2 0.43±0.15 0.85±0.17* ＜0.001

圖3 Western blot法檢測細胞增殖及凋亡相關蛋白表達

圖4 TarBase v.8預測miR-148b-3p與CDKN1B結(jié)合示意圖

表4 雙熒光素酶報告實驗（，n=9）

表4 雙熒光素酶報告實驗（，n=9）

注： WT-CDKN1B：野生型載體，MUT-CDKN1B：突變型載體

項目 miR-NC組 miR-148b-3p組 P值WT-CDKN1B 1.02±0.13 0.43±0.10* ＜0.001 MUT-CDKN1B 1.08±0.16 1.10±0.18 0.806

圖5 Western blot法檢測CDKN1B蛋白表達

CDKN1B在肝細胞癌、骨肉瘤等多種癌癥中表達異常并可參與腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲等生物學過程[16-18]。本研究結(jié)果顯示LPS誘導的心肌細胞中CDKN1B的表達下調(diào)，進一步分析顯示CDKN1B過表達后可明顯抑制LPS誘導的心肌細胞凋亡，并可提高細胞存活率，提示CDKN1B過表達可促進心肌細胞存活及抑制細胞凋亡。本研究通過雙熒光素酶報告實驗與Western blot實驗證實miR-148b-3p可靶向結(jié)合CDKN1B并可負向調(diào)控CDKN1B的表達，提示miR-148b-3p可能通過靶向CDKN1B促進心肌細胞凋亡及抑制細胞增殖。為探討miR-148b-3p是否可通過調(diào)控CDKN1B表達從而影響心肌細胞增殖及凋亡，本研究將anti-miR-148b-3p與si-CDKN1B共轉(zhuǎn)染至心肌細胞，結(jié)果顯示細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，CyclinD1、Bcl-2蛋白水平降低，P21、Bax蛋白水平升高，提示抑制miR-148b-3p表達可能通過上調(diào)CDKN1B表達從而促進心肌細胞增殖及抑制細胞凋亡。

表5 miR-148b-3p調(diào)控CDKN1B的表達（，n=9）

表5 miR-148b-3p調(diào)控CDKN1B的表達（，n=9）

注：CDKN1B：細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B；與miR-NC組比較，aP＜0.05；與anti-miR-NC組比較，bP＜0.05

項目 miR-NC組 miR-148b-3p組 anti-miR-NC組 anti-miR-148b-3p組 P值CDKN1B蛋白 0.75±0.16 0.32±0.05a 0.71±0.11 0.98±0.10b ＜0.001

圖6 Western blot法檢測細胞增殖及凋亡相關蛋白表達

表6 沉默CDKN1B可減弱抑制miR-148b-3p表達對心肌細胞增殖及凋亡的作用（，n=9）

表6 沉默CDKN1B可減弱抑制miR-148b-3p表達對心肌細胞增殖及凋亡的作用（，n=9）

注：CyclinD1：細胞周期蛋白1；Bax：B淋巴細胞瘤-2相關蛋白；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2

項目 LPS+anti-miRNC+si-NC組LPS+anti-miR-148b-3p+si-CDKN1B組P值CDKN1B蛋白 0.97±0.12 0.41±0.10* ＜0.001細胞存活率（%） 86.65±11.25 43.25±10.03* ＜0.001細胞凋亡率（%） 10.16±1.58 26.57±2.16* ＜0.001 CyclinD1 0.83±0.16 0.44±0.12* ＜0.001 P21 0.52±0.11 0.97±0.13* ＜0.001 Bax 0.53±0.12 0.96±0.18* ＜0.001 Bcl-2 0.78±0.15 0.42±0.11* ＜0.001

綜上所述，LPS誘導的心肌細胞中miR-148b-3p呈高表達，CDKN1B呈低表達，抑制miR-148b-3p表達可能上調(diào)CDKN1B表達從而抑制LPS誘導的心肌細胞凋亡，促進細胞增殖，其作用機制可能與調(diào)控CyclinD1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表達有關，miR-148b-3p可能成為診斷及治療心血管疾病的潛在靶點。