于洋 王東方 王欣 白義化 邢曉明 馮靜

摘 要：通過改良酶解工藝和生物膜過濾技術(shù)對分子量的控制和脫鹽的處理，優(yōu)化了人工養(yǎng)殖子二代大鯢中大鯢膠原蛋白肽的提取工藝。結(jié)果表明，傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的大鯢膠原蛋白肽相對分子量小于1 000 D的水解物所占比例為36.2%;工藝改進(jìn)后生產(chǎn)的大鯢膠原蛋白肽中相對分子量<1 000 D的肽段占比達(dá)到95.04%，該研究對我國大鯢膠原蛋白肽資源的產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供技術(shù)思路和理論依據(jù)，具有重要的理論和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

關(guān)鍵詞：大鯢;膠原蛋白;制備工藝;優(yōu)化

Optimization of Preparation Process of Giant Salamander Collagen Peptide

YU Yang， WANG Dongfang， WANG Xin， BAI Yihua， XING Xiaoming， FENG Jing

（Weihai Yuwang Group Marine Biological Engineering Co.， Ltd.， Weihai 264200， China）

Abstract： By improving the enzymatic hydrolysis process and biomembrane filtration technology to control the molecular weight and the desalination process， the extraction process of the collagen peptides of the artificially reared second-generation giant salamander was optimized. The results show that the proportion of hydrolysates with a relative molecular weight of less than 1，000 D of the giant salamander collagen peptide produced by the traditional process is 36.2%; the percentage of peptides with a relative molecular weight less than 1，000 D in the giant salamander collagen peptide produced after the process improvement reaches 95.04 %. This research provides technical ideas and theoretical basis for the industrial development of my country’s giant salamander collagen peptide resources， and has important theoretical and economic value.

Keywords： Giant salamander; collagen; preparation process; optimization

大鯢又稱娃娃魚，是世界上現(xiàn)存兩棲類動(dòng)物中壽命最長的動(dòng)物。野生大鯢作為我國珍稀名貴特產(chǎn)，已被列為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物[1-2]，經(jīng)現(xiàn)代營養(yǎng)成分分析研究結(jié)果表明：其含有18種氨基酸，是人體營養(yǎng)需求的優(yōu)質(zhì)蛋白源，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，被譽(yù)為“水中人參”[3]。大鯢喜棲息于山區(qū)清澈溪流以及山溪的石隙間，洞穴位于水面以下。其是中國特有物種，產(chǎn)于華北華中、華南和西南各省。近年來，由于人為因素，尤其是生存環(huán)境喪失、棲息地破壞以及過度利用，使野生大鯢物種數(shù)量銳減，大鯢的分布區(qū)成倍縮小。其生存地點(diǎn)多為人們難以達(dá)到的石灰?guī)r溶洞或者地下暗河。溶洞或者暗河這些惡劣的環(huán)境下，大鯢生存受到嚴(yán)峻的脅迫?，F(xiàn)因國家批準(zhǔn)許可小部分養(yǎng)殖專業(yè)戶利用人工養(yǎng)殖子二代以下的個(gè)體進(jìn)行科研、加工和利用，故涌現(xiàn)大量人工養(yǎng)殖和馴化大鯢的景象。目前，大鯢主要被粗加工成菜肴，但大鯢的深加工產(chǎn)品寥寥無幾。所以為了充分有效地開發(fā)利用人工養(yǎng)殖子二代大鯢和提高其附加值，其營養(yǎng)價(jià)值等問題的研究非常重要。

膠原蛋白廣泛存在于自然界的動(dòng)物組織中，并且具有重要的作用。因其結(jié)構(gòu)的多樣性和良好的生物相容性，在日常生活中，膠原蛋白被廣泛地應(yīng)用于食品、化妝品、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，而它的生產(chǎn)來源主要依賴于陸地生物（主要為豬和牛）。由于氨基酸組成和交聯(lián)度等方面的差異，使得大鯢所含有的豐富膠原蛋白具有很多牲畜膠原蛋白所沒有的優(yōu)點(diǎn)，例如大鯢膠原蛋白肽具有膠原蛋白含量高、分子量低、生物污染物少和毒素微量、低抗原性、低過敏性等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)大鯢膠原蛋白肽提取工藝是先將大鯢經(jīng)過高溫提取，在最適pH條件下，加入適量的酶解劑，進(jìn)行酶解提取，即成肽，完成后進(jìn)行精細(xì)過濾;濾液進(jìn)入蒸發(fā)濃縮系統(tǒng)濃縮脫水，經(jīng)濃縮后的液體達(dá)到一定濃度后，進(jìn)入噴霧干燥設(shè)備，所得粉末即為大鯢膠原蛋白肽。但是這樣制得的傳統(tǒng)大鯢膠原蛋白肽，過濾傳統(tǒng)工藝有以下缺點(diǎn)：①提取液體積較大，產(chǎn)品的生產(chǎn)周期較長;②酶解液除雜不徹底，影響產(chǎn)品品質(zhì);③所得成品往往具有苦腥味，口感差。基于此，本文以人工養(yǎng)殖子二代大鯢為原料，對大鯢膠原蛋白肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鯢，威海市宇王集團(tuán)海洋生物工程有限公司提供;水解蛋白酶（40萬U/g）、中性蛋白酶（20萬U/g）、風(fēng)味蛋白酶（10萬U/g），諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司。

膠原蛋白肽生產(chǎn)線，威海市宇王集團(tuán)海洋生物工程有限公司;生物膜過濾系統(tǒng)，合肥科佳高分子材料科技有限公司;高效液相色譜儀，日本島津公司;恒溫干燥箱，上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;超聲水浴箱，昆山美美超聲儀器有限公司;超聲波振蕩器，昆山美美超聲儀器有限公司;分析天平，奧豪斯儀器常州有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大鯢膠原蛋白肽制備工藝的優(yōu)化

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，針對大鯢膠原蛋白肽質(zhì)量不高、純度低、異味重、過敏原難去除以及分子量分布不均等許多共性問題和難題，精確研究分子量均一可控的酶解關(guān)鍵技術(shù)，以及生物膜過濾純化核心配套技術(shù)，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)高純度、高效率、低能耗、分子量均一可控的大鯢膠原蛋白肽產(chǎn)品自主創(chuàng)新技術(shù)。大鯢膠原蛋白肽提取優(yōu)化工藝為人工養(yǎng)殖子二代大鯢→宰殺去膽囊和脂肪組織→預(yù)處理→脫脂→絞碎→提取→酶解催化→脫腥脫味→多級(jí)生物膜過濾分離技術(shù)→濃縮→噴霧干燥。

1.2.2 試驗(yàn)步驟

①樣品處理：將活的人工養(yǎng)殖子二代大鯢停食數(shù)天使其排空腸道，再宰殺，去膽囊和部分脂肪組織。②預(yù)處理：將大鯢清洗干凈，并切成1～3 cm大鯢塊，備用。③脫脂：用氫氧化鈉溶液對大鯢塊進(jìn)行脫脂處理，脫脂溫度為20～25 ℃，時(shí)間1 h。④絞碎：將脫脂后的大鯢塊投入絞肉機(jī)中，絞成肉糜。⑤提取：將脫脂處理后的大鯢塊加水提取，提取過程中控制溫度95～100 ℃，熬煮時(shí)間1 h。⑥酶解催化：待提取液冷卻后，加入水解蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成的復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解。酶解溫度為50～55 ℃，酶解時(shí)的pH控制在7.5～8.5左右，酶解時(shí)間4 h。⑦滅活：酶解完成后將酶解液升溫滅活，滅火溫度為90～100 ℃，滅火時(shí)間20～30 min。⑧脫腥脫味：將酶解液經(jīng)過多級(jí)過濾后，加入活性炭和助濾劑進(jìn)行脫炭處理30 min，得到澄清透亮的大鯢酶解液。⑨多級(jí)生物膜過濾分離技術(shù)：在常溫下對物料進(jìn)行有效的過濾，分離時(shí)不發(fā)生相變化，適用對膠原蛋白肽進(jìn)行分離，去除雜質(zhì)、菌絲。對于大鯢酶解液中分子量為150～1 000 Dalton小分子肽有分離性能;對于無機(jī)鹽的分離則存在Donnan效應(yīng)。⑩濃縮：利用雙效濃縮器對大鯢膠原蛋白肽液進(jìn)行濃縮。?離心噴霧：離心噴霧干燥得到大鯢膠原蛋白肽粉。

2 結(jié)果與分析

工藝改進(jìn)前后生產(chǎn)的大鯢膠原蛋白肽的分子量如圖1、圖2所示。傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的大鯢膠原蛋白肽相對分子量小于1 000 D的水解物所占比例為36.2%;而水解物中≥80%的肽段相對分子質(zhì)量為643.7，如表1所示。工藝改進(jìn)后生產(chǎn)的大鯢膠原蛋白肽中相對分子量<1 000 D的肽段占比達(dá)到95.04%，≥80%肽段的相對分子質(zhì)量為317.14，如表2所示。因此，通過多級(jí)逆流萃取技術(shù)和納濾膜分離技術(shù)的共同改進(jìn)，生產(chǎn)出的大鯢膠原蛋白肽粉的分子量由原來的1 000 D～2 000 D變成現(xiàn)在均一穩(wěn)定、易于人體吸收且低于1 000 D的低聚肽。高溫催化、風(fēng)味酶的添加、管膜、納濾膜過濾等方法避免了膠原蛋白肽在酶解過程中產(chǎn)生的苦味肽，使得現(xiàn)在生產(chǎn)的大鯢膠原蛋白肽的口感更優(yōu)，并且無明顯的腥苦味，為以后以大鯢膠原蛋白肽為基礎(chǔ)生產(chǎn)不同劑型的保健品、飲品、糖果等提供了保障，可滿足不同客戶人群的需求。

3 結(jié)論

本研究采用堿處理對大鯢進(jìn)行脫脂預(yù)處理，通過三重生物酶復(fù)合酶解和多級(jí)逆流固液萃取技術(shù)以及生物濾膜過濾技術(shù)，將原來分子量大部分為1 000～2 000 D的大鯢膠原蛋白肽更新為分子量在1 000 D以下的低分子量的產(chǎn)品，獲得了高純度、無異味、易于人體吸收的低分子量的大鯢膠原蛋白肽，為不同人群、不同需求供應(yīng)不同產(chǎn)品提供了技術(shù)支持。并且有文獻(xiàn)記載，小分子量多肽更有利于人體吸收和抗氧化活性的增強(qiáng)[4-5]，這表明大鯢活性肽作為保健食品具有潛在的優(yōu)勢。

經(jīng)過提取工藝的改進(jìn)和采用多級(jí)生物膜過濾分離技術(shù)，大鯢膠原蛋白肽的分子量由原來小于1 000 D的蛋白質(zhì)水解物所占比例為36.2%轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)在95.04%。解決了大鯢膠原蛋白肽產(chǎn)品質(zhì)量不高、純度低、異味重、過敏原難去除以及分子量分布不均等許多共性問題和難題，實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化生產(chǎn)高純度、高效率、低能耗、分子量均一可控的大鯢膠原蛋白肽產(chǎn)品自主創(chuàng)新技術(shù)。

參考文獻(xiàn)

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