蒙衛(wèi)東，劉時(shí)璋

(1.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710068；2.陜西省人民醫(yī)院骨科，陜西 西安 710068)

0 引言

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是最常見的退行性關(guān)節(jié)疾病，影響一個(gè)或幾個(gè)關(guān)節(jié)，包括小關(guān)節(jié)(如手部關(guān)節(jié))和大關(guān)節(jié)(如膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié))[1]。OA是一項(xiàng)重大的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。在全球范圍內(nèi)，2017年OA的年齡標(biāo)準(zhǔn)化點(diǎn)患病率和年發(fā)病率分別為3754.2/10萬人和181.2/ 10萬人，分別比1990年增加了9.3%和8.2%。雖然由于OA導(dǎo)致的患病率、發(fā)病率和殘疾年數(shù)存在顯著的國際差異，但大多數(shù)國家的負(fù)擔(dān)正在增加，隨著預(yù)期壽命的延長和全球人口的老齡化，預(yù)計(jì)OA的負(fù)擔(dān)會越來越重[2]。

在基于細(xì)胞的軟骨再生療法中，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)治療引發(fā)了多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，同時(shí)提供了有希望的初步療效。實(shí)驗(yàn)表明，MSCs可以在體內(nèi)和體外分化為軟骨細(xì)胞(以SOX9、蛋白聚糖(ACAN)、Ⅱ型膠原(Col2A1)為標(biāo)志)。然而，在MSCs用于體內(nèi)軟骨修復(fù)的應(yīng)用中，觀察到向成骨譜系的肥大性分化。預(yù)防肥大對MSCs在軟骨組織工程中的臨床應(yīng)用越來越重要[3]。而且，在軟骨退變的過程中，健康的軟骨細(xì)胞表型向肥大表型轉(zhuǎn)變，這也是OA軟骨的一個(gè)重要病理變化[4]。OA也出現(xiàn)軟骨細(xì)胞增殖、軟骨細(xì)胞肥大分化、細(xì)胞外基質(zhì)重塑和礦化、血管浸潤和軟骨細(xì)胞凋亡死亡等現(xiàn)象。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠模型表明，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的去調(diào)節(jié)肥大分化可能是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病和進(jìn)展的驅(qū)動因素。因此，控制肥大分化可作為軟骨修復(fù)的有效策略，并用于骨再生，其中肥大軟骨可作為軟骨內(nèi)骨形成的模板。然而，肥大分化的確切分子機(jī)制尚不明確。盡管對肥大中單一信號通路的功能進(jìn)行了大量研究，但對于探索MSCs和軟骨細(xì)胞肥大分化中綜合信號通路的研究很少。該文討論了信號通路如何參與MSCs和軟骨細(xì)胞的肥大，這些信號通路如何相互作用，以及信號因子如何在骨關(guān)節(jié)炎疾病中改變。

1 MSCs軟骨分化過程中及OA進(jìn)展過程中軟骨細(xì)胞的肥大

MSCs是軟骨組織工程的有前途的候選細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儚V泛存在于骨髓、脂肪組織、牙齦組織、臍帶[5]、羊膜、絨毛膜、蛻膜[6]、滑膜和軟骨[7]中，并且可以在不喪失軟骨形成分化能力的情況下擴(kuò)增多次。然而，軟骨修復(fù)中MSCs的表型并不穩(wěn)定。經(jīng)歷軟骨形成的MSCs表達(dá)軟骨肥大標(biāo)記物(如X型膠原)，引起了對MSCs組織工程應(yīng)用的關(guān)注，因?yàn)樵谛萝浌侵熊浌羌?xì)胞的肥大最終會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和骨化[8]。

雖然軟骨細(xì)胞的肥大是骨骼生長和發(fā)育的一個(gè)短暫階段。但也是OA軟骨的一個(gè)重要病理變化，軟骨細(xì)胞失去了穩(wěn)定的表型，并檢測到RUNX2、X型膠原(ColX)、基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)、Indian hedgehog (IHH)和堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)。健康的關(guān)節(jié)軟骨是一種穩(wěn)定的組織，具有通過未知機(jī)制抵抗肥大分化和維持正常表型的潛力。多種信號通路的相互作用調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的命運(yùn)，即保留在軟骨內(nèi)或經(jīng)歷肥大分化[4]。

2 肥大的信號通路

在MSCs和軟骨細(xì)胞的軟骨形成中，多種信號通路參與了肥大樣變化的調(diào)節(jié)。根據(jù)最近的文獻(xiàn)，最重要的是WNT、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)/轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)、甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrP)、Indian Hedgehog (IHH)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、HIPPO、AMP依賴蛋白激酶(AMPK)和缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)等信號通路。

2.1 WNT信號通路

WNT信號通路是進(jìn)化中高度保守的通路，在胚胎發(fā)育、人體結(jié)構(gòu)、組織穩(wěn)態(tài)、生長以及多種疾病的發(fā)病和進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用。它控制著肢體發(fā)育期間生長板中軟骨細(xì)胞肥大和軟骨內(nèi)骨化。它由一個(gè)復(fù)雜的途徑網(wǎng)絡(luò)組成，包括典型的WNT/β-catenin信號通路，以及獨(dú)立于β-連環(huán)蛋白的非典型途徑：JNK信號通路和WNT/Ca2+信號通路[8]。典型的WNT/β-catenin途徑是研究最多的通路，由核內(nèi)β-catenin積聚介導(dǎo)，與軟骨細(xì)胞肥大密切相關(guān)。在大多數(shù)情況下，與WNT受體Frizzled結(jié)合的WNTs的存在導(dǎo)致大腸腺瘤性息肉病蛋白(APC)、糖原合成酶激酶3β (GSK3β)和軸抑制劑(AXIN)的形成復(fù)合物，從而導(dǎo)致β-catenin從復(fù)合物中釋放，隨后β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中[9]。β-catenin與T細(xì)胞特異性因子(TCF)/淋巴增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(LEF)轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄。然而，在缺乏WNT配體的情況下，β-catenin被破壞復(fù)合物磷酸化，隨后泛素化并靶向蛋白酶體降解。

大量研究揭示了WNT信號在軟骨穩(wěn)態(tài)中的核心作用。在軟骨中，適度的WNT活性對于軟骨細(xì)胞增殖和維持其典型特征是必不可少的，但是過度的活性會增加軟骨細(xì)胞肥大和軟骨降解金屬蛋白酶的表達(dá)。例如，成年小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中β-catenin基因的條件性激活導(dǎo)致軟骨細(xì)胞過早分化發(fā)展為X型膠原表達(dá)和骨關(guān)節(jié)炎樣表型[10]。SOX9轉(zhuǎn)錄因子是軟骨細(xì)胞的典型標(biāo)志，而RUNX2通常在肥大的軟骨細(xì)胞中高表達(dá)[3]。許多研究表明，SOX9和RUNX2表達(dá)之間的轉(zhuǎn)換決定了成熟軟骨細(xì)胞通過典型WNT信號而向肥大表型發(fā)展。

有幾種類型的WNT配體，它們在軟骨形成分化和軟骨發(fā)育中發(fā)揮不同的作用。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)錯(cuò)表達(dá)和體外過表達(dá)方法的實(shí)驗(yàn)表明，不同WNTs在控制軟骨形成分化和肥大中具有不同的作用。WNT3a和WNT5b促進(jìn)軟骨分化，但延遲肥大[11,12]。軟骨分化過程中WNT5a、WNT11在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的過度表達(dá)促進(jìn)軟骨肥大，并促進(jìn)BMP和IHH表達(dá)[8]。WNT16通過非典型WNT通路激活PCP/JNK和mTORC1-PTHrP通路來抑制軟骨細(xì)胞肥大。

在Dickkopf (DKK1)的存在下，MSCs軟骨形成中肥大相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)減少，DKK1通過軟骨保護(hù)機(jī)制與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP5/6)結(jié)合，充當(dāng)WNT信號抑制劑。實(shí)際上，WNT通路拮抗劑Dkk1和卷曲相關(guān)蛋白(FRZB)是阻斷MSCs肥大分化的關(guān)鍵因素。首先，Dkk1和FRZB是MSCs向軟骨分化的初始階段所必需的，其次是軟骨細(xì)胞再分化所必需的，最后是阻止關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞肥大分化所必需的[13]。研究還發(fā)現(xiàn)，在MSCs軟骨形成過程中，在缺乏WNT抑制劑DKK1和FRZB的情況下，肥大分化和礦化增加，軟骨細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)減少。在MSCs顆粒培養(yǎng)中，DKK1和FRZB對典型WNT的抑制增加了Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)，但不影響X型膠原的表達(dá)[14]。

2.2 轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號通路

TGF-β超家族包括多組多功能蛋白，形成兩大亞家族，即TGF-β亞家族和BMP亞家族。對這兩個(gè)亞家族分別通過典型的(分別為Smad2/3和Smad1/5/8)和非典型的信號通路激活，在不同的環(huán)境條件和細(xì)胞類型下是不同的。近年來的大量研究數(shù)據(jù)表明，這兩個(gè)亞家族之間的相互作用在許多細(xì)胞過程中發(fā)揮著核心作用，這些過程包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化，以及轉(zhuǎn)導(dǎo)不同組織和器官的發(fā)育和維持的信號級聯(lián)反應(yīng)[15]。

TGF-β可在體外誘導(dǎo)軟骨形成，通過TGF-β/Cdc42/Pak/Akt/Sox9信號通路促進(jìn)成軟骨細(xì)胞分化[16]。同時(shí)，在BMCs軟骨形成過程中，通過TGF-β/Smad1信號通路促進(jìn)軟骨形成，抑制軟骨細(xì)胞肥大[17]。盡管TGF-β在抑制BMCs軟骨細(xì)胞肥大方面顯然至關(guān)重要，但在MSCs的培養(yǎng)過程中將其加入軟骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基不足以抑制肥大表型的發(fā)生。

BMP信號主要通過軟骨細(xì)胞中典型的BMP/Smad途徑介導(dǎo)。當(dāng)BMP結(jié)合受體BMPR時(shí)，該通路將被激活，這些受體磷酸化Sma和Mad相關(guān)蛋白Smad1、Smad5和Smad8。R-Smads與Smad4形成復(fù)合物，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，在那里它們與靶基因的調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合以調(diào)節(jié)它們的表達(dá)。BMP在胚胎骨骼發(fā)育過程中有多種作用，除了MSCs的間充質(zhì)濃縮和軟骨形成分化外，BMP還誘導(dǎo)早期軟骨形成，是軟骨細(xì)胞增殖和軟骨內(nèi)骨化成熟的關(guān)鍵局部因素[18]。雖然BMP對關(guān)節(jié)軟骨有保護(hù)作用，但它們也參與軟骨細(xì)胞肥大和基質(zhì)降解。有研究篩選了兩種BMP I型受體激酶抑制劑，研究它們對hMSC軟骨形成的時(shí)間和劑量依賴效應(yīng)，受試抑制劑不同的受體選擇性表明，暫時(shí)阻斷ALK2和ALK3受體，雖然可調(diào)節(jié)hMSC形成軟骨，但對于維持穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞表型是必要的[19]。BMP2、BMP 4、BMP 7、BMP9選擇性地誘導(dǎo)ColX的表達(dá)，它被認(rèn)為是細(xì)胞肥大的早期標(biāo)志[8,20-22]。而BMP7誘導(dǎo)大鼠OA模型中肥大前期軟骨細(xì)胞向肥大表型方向分化[23]。體內(nèi)研究表明，BMP4在轉(zhuǎn)基因小鼠軟骨中的過度表達(dá)導(dǎo)致肥大區(qū)增加，表明肥大軟骨細(xì)胞的分化增加。由于BMP也在骨骼發(fā)育中發(fā)揮作用，因此BMP可能在骨化后驅(qū)動軟骨細(xì)胞形成骨骼，而不是作為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞保留下來[18]。因此，BMP可以保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，但可能通過誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞終末分化和促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展而對關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生有害影響。之前的研究表明，BMP抑制劑Noggin可以通過抑制MSCs軟骨形成過程中的BMP4來阻斷甲狀腺誘導(dǎo)的肥大[21]，同時(shí)，一種BMPR1A/ACVR1特異性靶向抑制劑LDN193189，可通過抑制小鼠OA模型中的肥大和MMP-13來抑制軟骨退化[24]。Pfeifer等認(rèn)為，MSCs通過生長板軟骨細(xì)胞途徑向軟骨細(xì)胞分化中，肥大表型改變是促肥厚性BMP信號的激活和抗肥厚性TGF信號的減少共同作用的結(jié)果[25]。

2.3 甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrP)和Indian Hedgehog (IHH)信號通路

PTHrP是甲狀旁腺激素(PTH)家族的一員，通過刺激NK3同源盒2和抑制RUNX2表達(dá)來阻斷肥大[26]。IHH是軟骨細(xì)胞分化和軟骨內(nèi)成骨所必需的，在PTHrP在負(fù)反饋環(huán)中作用，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞早期分化和進(jìn)入肥大分化[27]。在特異性缺失IHH基因敲除小鼠的OA模型中，僅觀察到輕微的OA改變，而對照組小鼠表現(xiàn)出明顯的軟骨損傷[28]。在軟骨內(nèi)成骨過程中，隨著血清甲狀腺激素(TH)水平的升高，骨骺中表達(dá)SOX9和COL2的未成熟軟骨細(xì)胞在出生后7-10天轉(zhuǎn)變?yōu)榉蚀笄捌诘能浌羌?xì)胞，最后轉(zhuǎn)化為表達(dá)COL1和BSP的成骨細(xì)胞，TH通過激活TRβ1來增加IHH的表達(dá)，IHH促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大[29]。IHH和PTHrP信號在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞肥大的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。Erickson等人發(fā)現(xiàn)，IHH刺激增殖的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生PTHrP，進(jìn)而加速關(guān)節(jié)周圍細(xì)胞的增殖，防止軟骨細(xì)胞肥大，從而使軟骨細(xì)胞保持增殖狀態(tài)。這種負(fù)反饋回路調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和成熟之間的平衡，確保有序的骨形成。另一方面，與體內(nèi)觀察結(jié)果一致，外源性PTHrP刺激細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞肥大，而IHH信號則刺激軟骨細(xì)胞肥大[26]。PTHrP可抑制心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(MEF2)的作用，而MEF2作用于軟骨細(xì)胞肥大所需的Runx2的表達(dá)。PTHrP通過允許HDAC4和HDAC5阻斷MEF2/Runx2信號級聯(lián)來抑制體內(nèi)軟骨細(xì)胞肥大和隨后的骨形成[30]。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)IHH誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中Runx2的表達(dá)，而不上調(diào)其他軟骨細(xì)胞成熟調(diào)節(jié)因子，如MEF2C、Foxa2和Foxa3。Runx2與IHH協(xié)同促進(jìn)COL10α1的表達(dá)。且IHH可以通過下游轉(zhuǎn)錄因子Gli 1/2的Runx2/Smad相互作用調(diào)節(jié)X型膠原的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[27]。在MSCs顆粒研究中也觀察到了類似的現(xiàn)象，表明PTHrP治療可抑制肥大，從軟骨分化的早期給予PTHrP，MSCs分化過程中的肥大標(biāo)志物較少，軟骨細(xì)胞質(zhì)量較好[31]。

2.4 其他信號通路

FGF信號在控制軟骨細(xì)胞分化中起著關(guān)鍵作用。其中，F(xiàn)GF2參與細(xì)胞增殖和軟骨形成過程的啟動； FGF9及FGF18通過提前改變軟骨形成程序刺激早期軟骨分化且增加細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，以及延遲MSCs軟骨形成中的終末肥大[32]。IGF-1已被確定為骨骼發(fā)育的重要生長因子。IGF-1通過1型IGF-1受體(IGF1R)傳遞信號，IGF1R在生長板的增殖和高營養(yǎng)區(qū)前軟骨細(xì)胞中表達(dá)[33]。轉(zhuǎn)導(dǎo)TGFB1基因可誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的MSCs向軟骨細(xì)胞分化，降低軟骨細(xì)胞肥大程度[34]。健康的關(guān)節(jié)軟骨是典型的無血管組織，軟骨細(xì)胞能夠在低氧環(huán)境中存活。低氧被認(rèn)為是對健康軟骨細(xì)胞表型和軟骨基質(zhì)形成的積極影響。通過從MSCs海藻酸鹽水凝膠中釋放Dmog，可以穩(wěn)定HIF-1α并增強(qiáng)其核定位，從而促進(jìn)MSCs的軟骨生成，并抑制了與軟骨細(xì)胞肥大相關(guān)的標(biāo)志物[35]。在大鼠OA模型中，CHM-1抑制HIF-2α核轉(zhuǎn)位，降低HIF-2α在膠原Ⅹα1、血管內(nèi)皮生長因子A和MMP-13上的轉(zhuǎn)錄活性，緩解OA發(fā)展進(jìn)程[36]。YAP1是Hippo信號通路的下游基因，控制細(xì)胞的增殖和分化，可抑制ATDC5細(xì)胞的肥大分化[37]。此外，AMPK激動劑可靶向AMPK/PI3K/AKT信號通路，減少關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的肥大和纖維化分化，維持軟骨細(xì)胞的成軟骨表型[38]。

3 信號通路在調(diào)節(jié)肥大中的相互作用

在一項(xiàng)非典型WNT5A以及WNT11和LEF1對MSC的軟骨形成和軟骨細(xì)胞的再分化的研究中。小分子IWP-2抑制WNT可通過蛋白多糖沉積增加支持MSC的軟骨形成，減少軟骨內(nèi)分化過程中觀察到的BMP4、BMP7及其靶ID1、IHH及其靶GLI1的特征性上調(diào)。與促肥大轉(zhuǎn)錄因子MEF2C一起，IWP-2還降低了包括IBSP和堿性磷酸酶活性在內(nèi)的多個(gè)肥大下游靶基因的活性，表明WNT活性促使BMP和IHH表達(dá)上調(diào)，并導(dǎo)致MSC肥大[8]。只有BMP2，而不是BMP-4，可以驅(qū)動低密度脂蛋白受體5(LRP5)的表達(dá)，這是WNT信號傳導(dǎo)的最重要的共受體之一，導(dǎo)致β-catenin的穩(wěn)定、積累、核易位和靶基因的激活?？梢缘贸鼋Y(jié)論，BMP-2通過LRP-5誘導(dǎo)的WNT/β-連環(huán)蛋白信號通路激活誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分解代謝作用和肥大[39]。WNT16通過激活PTHrP通路抑制軟骨細(xì)胞肥大[40]。體外研究表明，F(xiàn)GF2與PTHrP結(jié)合抑制TGFβ導(dǎo)致的COL2A1和COL10A1的表達(dá)和ALPL誘導(dǎo)[41]。此外，Wnt通路可通過抑制PTHrP信號活性來促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大。因此，PTHrP抑制肥大軟骨分化，而WNT和IHH促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大。因此，信號通路間的良好平衡是軟骨細(xì)胞正常表型的要求。此外，TGFβ-1通過HIPPO信號途徑降低肥大標(biāo)志物基因表達(dá)，從而抑制軟骨細(xì)胞肥大[42]。

4 結(jié)論

軟骨細(xì)胞分化受多種信號通路的調(diào)節(jié)，維持正常的軟骨細(xì)胞表型和避免肥大化對軟骨修復(fù)很重要。SOX9和RUNX2是軟骨細(xì)胞發(fā)育的兩個(gè)典型標(biāo)志。SOX9在軟骨細(xì)胞中表達(dá)，而RUNX2在肥大軟骨細(xì)胞中高表達(dá)。在大多數(shù)情況下，肥大表型伴隨著通過激活WNT、BMP、IHH、FGF和HIF信號通路中的任一個(gè)而高表達(dá)RUNX2。同時(shí)，TGFβ、IGF-1和PTHrP能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。但是，正常軟骨細(xì)胞保持著低代謝狀態(tài)，隨著對代謝相關(guān)信號通路如AMPK的深入研究，細(xì)胞代謝以及離子水平的改變，也促進(jìn)了軟骨細(xì)胞肥大。這些信號通路的平衡通過SOX9和RUNX2轉(zhuǎn)錄活性之間的轉(zhuǎn)移來調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖或肥大的狀態(tài)，它們之間的良好平衡是正常軟骨細(xì)胞分化和軟骨發(fā)育需具有的條件。