李培勇 曾崎岡 戴勇 魏成功 老昌輝

c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路在腫瘤細胞增殖分化、衰老凋亡等多樣生物學活性方面起著樞紐作用，可作為惡性腫瘤分子治療的前衛(wèi)靶點[1]。絲裂原活化蛋白激酶-7（mitogen-activated protein kinase kinase-7，MKK-7）參與細胞炎癥因子和應激刺激等信號通路介導的細胞應答，通過磷酸化JNK結構域而特異性激活JNK活性[2]，MKK-7/JNK通路直接影響腫瘤細胞的功能狀態(tài)，但MKK-7作用復雜，其雙向調控機制仍有待進一步闡述[3]。中醫(yī)藥防治非小細胞肺癌，特別是在疾病的終末期，可起到明顯改善臨床癥狀、緩解并發(fā)癥等作用[4]。本課題組前期研究顯示補腎培元膠囊臨床治療多種惡性腫瘤性疾病療效顯著，其藥效機制與JNK信號通路有關[5]。本研究旨在從血清藥理學維度探索補腎培元膠囊對非小細胞肺癌A549細胞抗增殖特性調控機制，為藥物進一步開發(fā)提供實驗結論支持。

1 材料與方法

1.1 細胞與動物 非小細胞肺癌細胞系A549細胞株，由廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院細胞庫惠贈。實驗動物：SPF級SD雄性大鼠，（200±20）g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，質量合格證編號：No44007200048391。

1.2 藥品試劑 補腎培元膠囊（簡稱BSPY，廣東省中西醫(yī)結合醫(yī)院制劑室，批號：粵Z20070308）。5-氟尿嘧啶（5-FU，上海麥克林公司）；GlutaMAX?培 養(yǎng) 基、0.25% Trypsin-EDTA、胎牛血清（美國賽默飛公司）；JNK、MKK-7 Rabbit Polyclonal antidody（美國Proteintech公司）；JNK、MKK-7 Primer均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 主要儀器 Leica DMi8高速成像平臺[徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿易有限公司]；SmartSpec plus核酸蛋白測定儀、IQTM5型熒光定量PCR儀、電泳儀、半干轉膜儀（美國伯樂公司）；低溫離心機（美國IEC公司）；超凈工作臺（蘇州中亞凈化設備有限公司）；GUIGO-99-IID型超聲波細胞粉碎機（上海桂戈科學儀器有限公司）。

1.4 細胞培養(yǎng) 非小細胞肺癌A549細胞以臺盼藍計數法顯微鏡下計數，加入含有10%胎牛血清和1%鏈霉素的GlutaMAX? 培養(yǎng)基中，調整細胞數后于5%CO2、37 ℃、100%濕度下培養(yǎng)傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.5 含藥血清的制備 含藥血清制備方法參照課題組已完成的補腎培元膠囊含藥血清相關動物實驗方法[5-6]：健康大鼠10只，每天禁食10～12 h后，依據人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表方法，人與大鼠等效轉換系數為0.018，補腎培元膠囊每日口服劑量3.6 g計算，3.6 g×0.018=0.064 8 g/d，根據每只大鼠每天灌胃2 mL，得出藥物濃度為0.032 4 g/mL。藥物于每日灌胃前配制，連續(xù)給藥14 d，灌胃2次/d，第14天晚上開始禁食不禁水，最后一次給藥1 h后，予采用20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉，無菌條件下從腹主動脈采血，分離除菌后血清-20 ℃保存?zhèn)溆?。另取健康大?0只，按上述給藥操作方法給予等量生理鹽水灌胃，余處理方法同上。

1.6 CCK8法檢測補腎培元膠囊含藥血清對體外培養(yǎng)肺癌A549細胞增殖的抑制作用 取對數生長期的A549細胞采用GlutaMAX?培養(yǎng)基于96孔板中調整終濃度至5×105/mL，采取190 μL細胞/孔，分為空白對照組、陽性對照組和補腎培元膠囊含藥血清組，均培養(yǎng)24 h?？瞻讓φ战M加普通血清10 μL，陽性對照組加入50 μmol/L的5-FU 10 μL。補腎培元膠囊血清組分別加入10%、20%、30%的含藥血清（均為10 μL），各組分別設3個復孔，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃溫育1 h后于酶標儀450 nm單波長處測定各孔吸光度（OD）值，并計算細胞生長的抑制率（IR）。重復實驗3次，取平均值。

1.7 實時熒光定量PCR測定補腎培元膠囊含藥血清對體外培養(yǎng)肺癌A549細胞JNK、MKK-7核酸表達影響 各組細胞培養(yǎng)72 h后，取胰酶消化后A549細胞，采用Trizol一步法試劑盒提取細胞總RNA，使用核酸蛋白儀測定RNA的濃度和純度，將RNA反轉錄成cDNA，經聚合酶鏈反應，以GAPDH為內參，采用圖像分析儀分析數據，運用公式2-△△Ct計算基因相對表達量。見表1。

表1 RT-qPCR檢測基因引物序列

1.8 Western blotting測定補腎培元膠囊含藥血清對體外培養(yǎng)肺癌A549細胞JNK、MKK-7蛋白表達影響 常規(guī)培養(yǎng)A549細胞，按實驗分組干預72 h，提取蛋白，BCA法調整蛋白濃度，取50 μg總蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳、轉印后轉移到PVDF膜上。將膜取出經封閉后一抗4 ℃過夜，二抗搖床恒溫孵育后，ECL暗室曝光，經顯影定影后采用E-Gel Imager Software采集圖像。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理，實驗數據以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 空白對照組A549細胞體外生長情況

圖2 陽性對照組A549細胞體外生長情況

2 結果

2.1 細胞增殖抑制測定 補腎培元膠囊含藥血清干預體外培養(yǎng)的肺癌A549細胞72 h后，隨著藥物血清濃度的增加，對A549細胞抗增殖作用呈現時間-濃度依賴改變，以30%BSPY組作用72 h時A549細胞形態(tài)變化最明顯，此時鏡下觀察腫瘤細胞受損明顯，細胞不規(guī)則樣聚集，細胞間隙增大，活細胞數量降低，懸浮細胞增多，見圖1～5。

圖3 10%BSPY組A549細胞體外生長情況（給藥72 h，100×）

圖4 20%BSPY組A549細胞體外生長情況（給藥72 h，100×）

圖5 30%BSPY組A549細胞體外生長情況（給藥72 h，100×）

2.2 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率 單因素方差分析結果顯示，各給藥組24、48、72 h細胞增殖抑制率與空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中以給藥72 h后最為顯著。10%BSPY組24、48、72 h細胞增殖抑制率均低于陽性對照組（P<0.05）；20%BSPY組、30%BSPY組24、48、72 h細胞增殖抑制率均高于陽性對照組（P<0.05）。見表2。

表2 不同濃度補腎培元膠囊含藥血清對A549細胞體外生長不同時間細胞增殖抑制率的影響[%，（）]

表2 不同濃度補腎培元膠囊含藥血清對A549細胞體外生長不同時間細胞增殖抑制率的影響[%，（）]

*與空白對照組相比，P<0.05；△與陽性對照組相比，P<0.05。

2.3 JNK、MKK-7 mRNA表達測定 單因素方差分析結果顯示，各給藥組JNK mRNA表達與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與陽性對照組比較，各給藥組JNK mRNA表達水平均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與空白對照組相比，除陽性對照組外，其余各給藥組MKK-7 mRNA表達均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與陽性對照組比較，各給藥組MKK-7 mRNA表達水平均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 JNK、MKK-7蛋白表達測定 單因素方差分析結果顯示，各給藥組JNK蛋白表達與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；各給藥組JNK蛋白表達水平與陽性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。除陽性對照組外，其余各給藥組MKK-7蛋白表達與空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4。

表3 不同濃度補腎培元膠囊含藥血清對A549細胞JNK、MKK-7 mRNA相對表達量的影響（）

表3 不同濃度補腎培元膠囊含藥血清對A549細胞JNK、MKK-7 mRNA相對表達量的影響（）

*與空白對照組相比，P<0.05；△與陽性對照組相比，P<0.05。

表4 不同濃度補腎培元膠囊含藥血清對A549細胞JNK、MKK-7蛋白表達的影響（）

表4 不同濃度補腎培元膠囊含藥血清對A549細胞JNK、MKK-7蛋白表達的影響（）

*與空白對照組相比，P<0.05；△與陽性對照組相比，P<0.05。

3 討論

MKK-7在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用重要，但其機制極為復雜，經原位雜交技術顯示MKK-7主要分布于腦、肺和消化系統(tǒng)中，尤以肺上皮部分表達最高[7-9]。MKK-7特異性靶標JNK激酶而產生生物學效應，各種致癌因子往往通過MKK-7/JNK信號轉導通路影響腫瘤細胞增殖、遷移特性，致使細胞周期受阻，進而使腫瘤細胞增殖分化功能受損[10]。目前研究認為MKK-7在肺癌模型中扮演的主要是腫瘤抑制因子的角色，因而MKK-7是抗癌屏障中至關重要的感應靶點之一[11]。MKK-7穩(wěn)定表達時，癌基因c-myc、血管生成素等腫瘤細胞中呈高表達的癌性基因表達明顯下調，表明MKK-7負性調節(jié)癌細胞增殖[12-13]。盡管如此，仍有研究結果認為MKK-7還同時具有致癌作用。在鱗癌患者肺組織中MKK-7的mRNA表達較正常肺組織上調顯著，抑制MKK-7的表達可顯著抑制腫瘤轉移改變，其機制可能與阻礙下游JNK的磷酸化有關[14]。以上研究結論的不一致性結果提示MKK-7復雜的生物反應可能與JNK信號通路復雜性有關，其信號通路作用機制仍有待進一步闡述。

中醫(yī)學認為肺癌屬于“肺積”“痞癖”“咯血”等范疇，“邪積胸中，阻塞氣道……邪既勝，正不得而制之，遂結成形而有塊”，《雜病源流犀燭》中的這段病因病機的描述，極佳地闡釋了肺癌的發(fā)生、發(fā)展與人身正氣虧耗、邪毒搏結有關[15-16]。肺癌初起邪毒瘀滯，實證蜂起，虛損之候可較隱晦，若至肺癌晚期，邪毒毀正，肺脾腎多臟虛損，遏邪乏權，此時虛證凸顯，耗氣傷血，陰陽俱損，假如患者采取手術方法切除腫瘤，則術后肺癌患者也可由于手術致陽氣虛弱，陽損及陰而陰陽俱損于后，肺脾腎三臟之氣陰兩虛、陰陽并損的見證則隨之而至。課題組針對肺癌的病因病機特點，認為肺癌腎陽虛寒毒內盛的主要特點，以“熱病屬陽，陽邪易散易治，不死；冷病屬陰，陰邪易伏，故令人不覺，久則變?yōu)樘摵?，侵蝕臟腑而死”為主要理論指導，創(chuàng)制了補腎培元膠囊治療肺癌等多種惡性腫瘤，臨床獲益顯著[17-18]。補腎培元膠囊由熟地、肉蓯蓉、核桃仁、冬蟲夏草、黨參、菟絲子六味藥組成，方小精簡而力專效宏，現代研究顯示方中單味藥物的有效成分均有抑制腫瘤細胞增殖等作用，因而補腎培元膠囊綜合其中藥味性用，溫而不燥，補而不滯，扶正固元而調整人身之陰陽平衡，從而形成補而不滯、溫而不燥、通補結合的藥物特點[19-20]。

本實驗研究發(fā)現，在陽性對照組的JNK與MKK-7表達上，MKK-7與JNK的mRNA、蛋白表達與MKK-7的mRNA、蛋白表達呈反向改變，當肺癌A549細胞增殖抑制時，MKK-7表達升高，而JNK表達下降，表明MKK-7作為抑癌表達因子，可通過抑制JNK信號通路從而抑制A549細胞增殖。采用補腎培元膠囊含藥血清干預肺癌A549細胞后，A549細胞增殖受到明顯抑制，其腫瘤細胞惡性細胞生長形態(tài)受到顯著抑制。與空白對照組、陽性對照組相比，30%BSPY組的JNK mRNA、蛋白表達量降低最顯著，其MKK-7 mRNA及蛋白表達量升高改變也最為顯著，表明補腎培元膠囊的藥效機制可能通過穩(wěn)定表達MKK-7，從而活化MKK-7/JNK信號通路表達，最終起到抑制肺癌A549細胞增殖作用。

綜上所述，本實驗證實了補腎培元膠囊含藥血清對肺癌A549細胞的抗增殖作用，其藥效機制與調控MKK-7/JNK信號通路有關，對今后進一步開展補腎培元膠囊調控MKK-7/JNK信號途徑的深層次調控表達效應機制具有重大的臨床意義。