杜 冰，王佳寧，楊 艷，洪 力，閆龍騰，羅德霞，姚 政，4△

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.榆林市教育示范性綜合實(shí)踐基地，陜西 榆林 719000；3.云南省臨滄衛(wèi)生學(xué)校，云南 臨滄 677000；4.云南省高校中醫(yī)證候微觀辨證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty live，NAFLD）是全球最普遍的肝臟疾病，患者高達(dá)17億，在中國患病率高達(dá)29.2%[1-2]。NAFLD患者易同時(shí)存在胰島素抵抗（insulin resistance，IR）及代謝綜合癥，很大程度上增加了肝癌和心血管病的風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。瘦素（leptin，LEP）又稱瘦蛋白，是人體OB基因編碼的一種分泌性蛋白，主要由脂肪細(xì)胞合成，釋放入血，抑制胰島素的釋放，調(diào)控糖脂代謝平衡[5]。當(dāng)機(jī)體攝入高脂高糖食物等因素引起瘦素水平長時(shí)間升高后，會引發(fā)瘦素抵抗，胰島素減少，糖脂代謝紊亂，游離脂肪酸通過血液循環(huán)進(jìn)入肝臟，加重了肝臟的負(fù)擔(dān)，引起脂質(zhì)沉積在肝臟，成為脂肪肝[6-7]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痰瘀互結(jié)是NAFLD的主要病因，痰與瘀同源、互化、同病，共礙肝、脾二臟機(jī)能[8]。加味二陳湯是在二陳湯的基礎(chǔ)上加三七，主要功效為祛瘀化痰，為臨床治療NAFLD的常用方[9-11]。課題組前期研究表明加味二陳湯可通過調(diào)節(jié)NAFLD大鼠脂質(zhì)代謝，改善脂肪肝癥狀[12]。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制非酒精性脂肪性肝病大鼠模型，觀察加味二陳湯對NAFLD脂質(zhì)代謝及血清瘦素的影響，尋找加味二陳湯治療NAFLD的有效作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步明確化痰祛瘀法的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級8周齡雄性SD大鼠80只（四川省成都達(dá)碩生物有限公司，生產(chǎn)證號：SCXK（川）2014-23，合格證號：0018160），體質(zhì)量180～220 g。動物飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房，室內(nèi)保持安靜，12 h照明，溫濕度適宜，實(shí)驗(yàn)期間動物自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑 加味二陳湯由陳皮15 g，半夏15 g，茯苓9 g，甘草5 g，三七6 g組成，生藥購自云南中醫(yī)藥大學(xué)門診部藥房。辛伐他汀片（哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司，批號：1401001）；0.9%NaCl溶液（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號：1601080726）；大鼠瘦素ELISA檢測試劑盒（美國R&D公司，批號：CSB-E07433r）；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白-膽固醇（LDL-C）檢測試劑盒均購自羅氏生物科技有限公司（批號分別為：21595301、01757261、01772862、197344-01）；肝臟甘油三酯檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：AUZ5073）。

1.3 主要儀器 羅氏全自動生化分析儀Cobas c311（德國羅氏）；Spectra Max 340PC酶標(biāo)儀（美國分子儀器公司）；AR2140電子分析天平（上海奧豪斯公司）；正置光學(xué)顯微鏡ECLIPSE E200（日本Nikon公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 藥物制備 中藥煎煮方法參考《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》（上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006年版），湯藥濃縮后加入三七粉，室溫冷卻，分裝，4℃冰箱冷藏保存。灌胃時(shí)37℃水浴加熱30 min后使用。大鼠用藥劑量為成人臨床等效劑量，換算方法參考《實(shí)驗(yàn)動物學(xué)》（中國中醫(yī)藥出版社，2012），用人與大鼠體表面積轉(zhuǎn)換系數(shù)換算成大鼠每日所需生藥量，灌胃劑量為4.5 g/kg。

辛伐他汀片碾碎研磨后溶解于0.9%NaCl中，分裝，4℃冰箱冷藏保存。用藥劑量為成人臨床等效劑量，換算方法同上，劑量為1.8 mg/kg。

1.4.2 動物分組、藥物干預(yù)、一般指標(biāo)觀察 將實(shí)驗(yàn)動物置于動物房，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組，分別為正常組、模型組、辛伐他汀組、加味二陳湯組，每組20只。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，其他組給予高脂飼料（88%普通飼料，10%豬油，2%膽固醇）。喂養(yǎng)至第9周開始灌胃，正常組和模型組予以等體積0.9%NaCl灌胃；辛伐他汀組予以辛伐他汀（1.8 mg/kg）灌胃；加味二陳湯組予加味二陳湯（4.5 g/kg）灌胃，每日1次，持續(xù)至12周末。期間對大鼠體質(zhì)量、毛色光澤度、進(jìn)食、活動度分別進(jìn)行觀察，取材時(shí)稱量大鼠體質(zhì)量和肝臟濕重。

1.4.3 血清指標(biāo)及肝臟甘油三酯檢測 分別于10、12周末觀察大鼠各項(xiàng)指標(biāo)。采用生化分析儀檢測血清 AST、TG、HDL-C、LDL-C 水平；血清瘦素采用ELISA法檢測；肝臟TG采用GPO-PAP法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.4 HE染色 各大鼠肝臟大葉距肝門約5 mm處取相同部位大小約10 mm×10 mm×3 mm肝組織1塊，4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，切成4 μm的組織片后進(jìn)行HE染色，正置光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用 SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Dunnett T3檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察 開始實(shí)驗(yàn)的前3周各組大鼠狀態(tài)良好，高脂飲食喂養(yǎng)的3組大鼠在第4周開始食物攝入量明顯增加。第10周開始，各組大鼠毛色光澤度下降，飲食、活動度明顯降低，其中模型組最為明顯。加味二陳湯組出現(xiàn)便粘軟，偶有稀溏，可能是藥物干預(yù)影響了消化功能。

2.2 大鼠肝指數(shù) 肝指數(shù)可以反應(yīng)肝臟的受損程度，計(jì)算方法：肝指數(shù)（%）=肝濕重（g）/體質(zhì)量（g）×100%。結(jié)果顯示，與正常組比較，10、12周末模型組肝指數(shù)均顯著增高（P＜0.05）。10周末與模型組比較，辛伐他汀組明顯降低（P＜0.05），加味二陳湯組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。12周末與模型組比較，辛伐他汀組、加味二陳湯組肝指數(shù)降低明顯（P＜0.05），見表 1。

表1 各組大鼠肝指數(shù)比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠肝指數(shù)比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別劑量/（g·kg-1）10周末/%12周末/%正常組 - 2.53±0.20 2.36±0.33模型組 - 2.98±0.48▲ 3.35±0.62▲辛伐他汀組 0.0018 2.68±1.27* 3.17±0.51*加味二陳湯組 4.5 2.81±0.36 3.16±0.58*

2.3 大鼠肝臟外觀 正常組大鼠肝臟體積較小，包膜飽滿圓鈍，色澤深紅；模型組大鼠肝臟體積較正常組增大，色黃，質(zhì)地略軟，表面呈花斑狀；辛伐他汀組、加味二陳湯組較模型組均有改善。

圖1 大鼠肝臟外觀

2.4 大鼠肝組織病理變化 正常組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)未見明顯異常。模型組10周末肝索排列紊亂，超過2/3的肝細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)圓形脂滴空泡；12周末胞漿疏松化，幾乎完全出現(xiàn)氣球樣變。辛伐他汀組10周末肝索排列紊亂，部分可見圓形脂滴空泡；12周末圓形脂滴空泡較之前減少。加味二陳湯組10周末肝索排列紊亂，肝細(xì)胞胞漿約1/3的視野中可見圓形脂滴空泡；12周末圓形脂滴空泡較之前減少。各藥物處理組肝組織損傷情況較模型組有所改善。

2.5 大鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)變化 10周末結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血TG、肝TG、LDL-C顯著升高，HDL-C 顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組大鼠血TG顯著降低（P＜0.05），加味二陳湯組 LDL-C 顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 10周末各組大鼠生化指標(biāo)變化（±s，n=10）

表2 10周末各組大鼠生化指標(biāo)變化（±s，n=10）

注：與正常組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別劑量/（g·kg-1）AST/（U·L-1）血TG/（mmol·L-1）肝TG/（mg·g-1）HDL-C/（mmol·L-1）LDL-C/（mmol·L-1）正常組 - 154.29±40.64 0.35±0.07 2.33±0.49 1.16±0.24 0.33±0.29模型組 - 163.13±38.68 0.46±0.09▲ 6.31±2.04▲ 0.99±0.36▲ 1.00±0.26▲辛伐他汀組 0.0018 153.38±11.08 0.39±0.05* 4.89±1.90 0.77±0.12 0.77±0.26加味二陳湯組 4.5 161.63±25.49 0.44±0.05 4.90±1.24 0.73±0.09 0.68±0.24*

12周末結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠AST、血 TG、肝 TG、LDL-C顯著升高，HDL-C顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組血TG及加味二陳湯組血TG、肝TG顯著降低，而HDL-C均升高（P＜0.05），見表 3。

表3 12周末各組大鼠生化指標(biāo)變化（±s，n=10）

表3 12周末各組大鼠生化指標(biāo)變化（±s，n=10）

注：與正常組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別劑量/（g·kg-1）AST/（U·L-1）血TG/（mmol·L-1）肝TG/（mg·g-1）HDL-C/（mmol·L-1）LDL-C/（mmol·L-1）正常組 - 157.83±30.27 0.37±0.02 2.48±0.39 0.78±0.13 0.28±0.19模型組 - 217.71±38.76▲ 0.56±0.15▲ 6.13±1.91▲ 0.73±0.11▲ 1.09±0.27▲辛伐他汀組 0.0018 206.50±20.07 0.46±0.07* 5.59±1.15 0.83±0.06* 0.88±0.39加味二陳湯組 4.5 205.63±29.49 0.46±0.08* 3.72±1.19* 0.84±0.12* 0.80±0.21

2.6 大鼠血清瘦素變化情況 與正常組比較，模型組2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清瘦素水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀組和加味二陳湯組血清瘦素水平均顯著降低（P＜0.05），其中辛伐他汀組下降最多，接近正常組水平。

表4 各組大鼠血清LEP比較（±s，n=10）

表4 各組大鼠血清LEP比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別 劑量/（g·kg-1）10周末/（ng·mL-1）12周末/（ng·mL-1）正常組 - 2.07±0.43 1.57±0.39模型組 - 3.67±0.53▲ 2.50±0.29▲辛伐他汀組 0.0018 2.21±0.36* 1.69±0.58*加味二陳湯組 4.5 2.71±0.40* 1.80±0.66*

2.7 各組大鼠血清瘦素與血TG、LDL-C、肝TG的相關(guān)性分析 結(jié)果表明，各組大鼠血清瘦素表達(dá)量與血TG、LDL-C、及肝 TG 含量呈正相關(guān)（P＜0.05），見表 5。

表5 各組大鼠血清瘦素表達(dá)量與血TG、LDL-C、肝TG的相關(guān)性分析

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，NAFLD病因多為飲食不節(jié)，勞逸失當(dāng)，病位在肝、脾、腎三臟，病機(jī)主要是痰濁與血瘀[13]。痰濁和瘀血既是病因，也是病理產(chǎn)物。脂肪肝的發(fā)生發(fā)展與痰濁、瘀血密不可分[14]。遵從“方從法出、法隨證立”的古訓(xùn)，中醫(yī)治療NAFLD的基本治法為化痰祛瘀[15]。經(jīng)典化痰方二陳湯由陳皮、半夏、茯苓、甘草組成?，F(xiàn)代臨床和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，二陳湯等系列方可以有效改善脂肪肝情況[9，16-17]。加味二陳湯中的加味藥三七是云南的道地藥材，具有化瘀止血、補(bǔ)血活血、消腫止痛、養(yǎng)血強(qiáng)身等功效，為中醫(yī)活血化瘀常用藥。三七的主要有效成分為三七總皂苷，有抗炎、抗氧化、降血脂及血糖、抗血小板聚集、促進(jìn)血管新生、擴(kuò)張血管、改善肝內(nèi)微循環(huán)及腦缺血損傷等作用[18-19]。在二陳湯基礎(chǔ)上加三七，可以共奏化痰祛瘀之功。

“瘀”的病理表現(xiàn)之一為肝脂、血脂過多。肝臟中過多的脂質(zhì)會導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，進(jìn)而引起肝臟損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加味二陳湯組大鼠肝臟脂質(zhì)沉積情況較輕，肝指數(shù)、血清TG、HDL-C、LDL-C及肝TG均顯著降低。本研究中模型組大鼠處于脂肪肝早期，10周末模型組AST有所升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，12周末AST顯著升高；加味二陳湯灌胃后AST明顯低于模型組，說明加味二陳湯能一定程度改善大鼠肝功能。上述結(jié)果表明，加味二陳湯可以通過化痰祛瘀有效治療NAFLD。

瘦素是一種由OB基因編輯的分泌性蛋白，由脂肪細(xì)胞釋放，能夠有效抑制游離脂肪酸在肝臟等非脂肪組織的積聚[20]。在正常機(jī)體中，瘦素可以促進(jìn)脂肪的分解和代謝，在保持體重和體脂方面起重要作用[21]。臨床研究證實(shí)，NAFLD患者血清瘦素水平升高與IR呈正相關(guān)、與糖代謝障礙指標(biāo)呈正相關(guān)，提示血液中瘦素水平與甘油三酯在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積，并促進(jìn)單純性脂肪肝向脂肪性肝炎的轉(zhuǎn)變中發(fā)揮重要作用[5，22]。本實(shí)驗(yàn)中，10、12周末大鼠血清瘦素水平結(jié)果表明，模型組血清瘦素隨造模時(shí)間增加而逐漸升高，表明血清瘦素水平在脂肪肝發(fā)展過程中不斷升高，與肝臟脂肪病變的嚴(yán)重程度相關(guān)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清瘦素水平與血脂、肝脂含量呈正相關(guān)，提示瘦素在脂代謝紊亂過程中是值得關(guān)注的一個(gè)重要指標(biāo)。加味二陳湯治療后血清瘦素水平明顯下降，說明瘦素可能是加味二陳湯治療NAFLD的有效作用靶點(diǎn)之一。

綜上所述，具有化痰祛瘀功效的加味二陳湯可有效降低血脂、肝脂，保護(hù)肝功能，同時(shí)可通過降低血清瘦素水平改善機(jī)體糖脂代謝，對NAFLD起治療作用，有較好的療效和安全性。中藥復(fù)方作用靶點(diǎn)較多，在后期研究中，可考慮對其他糖脂代謝相關(guān)指標(biāo)如JAK/STAT3、AMPK/ACC2等信號通路蛋白進(jìn)行檢測，并結(jié)合代謝組學(xué)方法，進(jìn)一步闡明化痰祛瘀法治療NAFLD的作用機(jī)制。