李 媛 陳金煥 金 曌 侯景丫 姜玉松 邢海濤

(1. 重慶文理學(xué)院 經(jīng)濟(jì)植物生物技術(shù)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶 402168；2. 北京林業(yè)大學(xué) 林木分子育種高精尖創(chuàng)新中心 北京 100083)

木材是木本植物最重要的可再生資源,不僅廣泛用于建筑、家具生產(chǎn)和造紙業(yè)，而且是生物質(zhì)能源的重要來(lái)源。次生壁是木材的主要成分，主要由木質(zhì)素、纖維素、半纖維素以及少量的結(jié)構(gòu)蛋白和酶構(gòu)成。次生壁的積累由次生壁組分合成基因和轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控(Taylor-Teeplesetal., 2015)。因此，解析次生壁物質(zhì)形成中的關(guān)鍵調(diào)控因子及其作用機(jī)制，可為利用分子生物學(xué)手段提高木材的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)量，改良木材品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)重要的調(diào)控因子，一般通過(guò)結(jié)合特異的順式作用元件從而激活或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗性響應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。NAC (NAM, ATAF1/2 和CUC2)是植物特有的且最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的植物NAC基因被發(fā)掘和鑒定，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、毛果楊(Populustrichocarpa)和毛竹(Phyllostachysedulis)中分別鑒定出117、151、152、163、93個(gè)NAC家族成員(Nuruzzamanetal., 2010; Huetal., 2010； Sunetal., 2018; Shanetal., 2019)。NAC 轉(zhuǎn)錄因子在 N 端含有1個(gè)約160個(gè)氨基酸殘基大小的保守區(qū)域，該保守區(qū)域被進(jìn)一步細(xì)分為 A、B、C、D、E 5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，亞結(jié)構(gòu)域C、D序列中含有核定位信號(hào), 可能與轉(zhuǎn)錄因子核定位及啟動(dòng)子上特定順式元件的識(shí)別有關(guān)(Aidaetal.,1997; Ookaetal., 2003)； 高度變異的C端序列存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控域，激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，C端序列的多變與NAC蛋白功能的多樣化密切相關(guān)(Duvaletal., 2002; Hegedusetal., 2003; Jensenetal., 2010)。

在植物中，NAC轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Parketal., 2011; Wangetal., 2015; Kimetal., 2016)，同時(shí)也參與植物各類(lèi)生物和非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程(孫利軍等， 2012)。在水稻中，過(guò)表達(dá)OsNAC5基因顯著增強(qiáng)了抗旱性(Jeongetal., 2013)。在擬南芥中，NAC1能夠介導(dǎo)生長(zhǎng)素信號(hào)，促進(jìn)側(cè)根發(fā)育(Guoetal., 2005)；CUC1和CUC2參與器官邊界建成和分生組織的形成(Aidaetal.,1997)。Tran等(2004)從擬南芥中分離的3個(gè)NAC基因 (ANAC019、ANAC055和ANAC072)均受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 過(guò)表達(dá)這些NAC基因能顯著提高植株的耐旱能力。NAC基因家族在次生壁形成中也發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)控作用。近幾十年來(lái)研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子作為植物細(xì)胞次生壁合成的第1級(jí)主開(kāi)關(guān), 能夠激活一系列下游轉(zhuǎn)錄因子和次生壁組分合成基因的表達(dá)(李慧等， 2020)。擬南芥SND1不僅可以直接誘導(dǎo)木質(zhì)素合成基因PAL1、CCoAOMT和4CL3的表達(dá), 以及半纖維素合成基因IRX9、纖維素合酶類(lèi)基因CSLB02、阿拉伯半乳糖蛋白基因FLA12的表達(dá)，而且能夠激活MYB46基因的表達(dá), 誘發(fā)次生壁相關(guān)基因的高度上調(diào)表達(dá), 促進(jìn)纖維素、木聚糖、木質(zhì)素在細(xì)胞次生壁的沉積(Zhongetal., 2007; 2011a； Ohashi-Itoetal., 2010)。擬南芥NST1和NST2調(diào)控花藥開(kāi)裂所必需的花藥內(nèi)皮層細(xì)胞的次生壁增厚(Mitsudaetal., 2007)； 同時(shí),NST2也參與莖稈纖維細(xì)胞次生壁合成的調(diào)控，nst1nst2nst3/snd1三突變體植株纖維細(xì)胞次生壁完全缺失, 表明NST2、NST1以及NST3/SND1協(xié)同調(diào)控纖維次生壁的合成(Zhongetal., 2015)。楊樹(shù)基因PtrWNDs在擬南芥中的異源表達(dá)可以恢復(fù)snd1nst1雙突變體的表型,PtrWNDs的過(guò)表達(dá)引起次生壁合成基因的表達(dá)上調(diào)(Zhongetal., 2010； 2011b; Ohtanietal., 2011), 在PtrWNDs表達(dá)量下降的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)中, 木質(zhì)部導(dǎo)管和纖維細(xì)胞的次生壁加厚受到抑制(Zhongetal., 2011b)。上述研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物次生壁形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因而對(duì)NAC轉(zhuǎn)錄因子的分離和鑒定將有助于解析植物細(xì)胞次生壁形成機(jī)制。

2006年完成了毛果楊全基因測(cè)序(Tuskanetal., 2006)，并建立了穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，因此，以楊樹(shù)為模式樹(shù)種，解析次生壁形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將為林木定向育種奠定重要理論基礎(chǔ)。目前，次生壁合成的關(guān)鍵酶基因已經(jīng)基本克隆出來(lái)并進(jìn)行了功能分析，但其轉(zhuǎn)錄層面的研究仍有待完善。Hu等(2010)研究表明，毛果楊NAC基因家族包含163個(gè)成員，其中14個(gè)PtrNACs基因特異地在發(fā)育中的木質(zhì)部高表達(dá)。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析，篩選到1個(gè)在毛果楊木質(zhì)部高表達(dá)的基因PtrNAC128并分離出基因全長(zhǎng)序列，通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析該基因的結(jié)構(gòu)及進(jìn)化，利用qRT-PCR分析PtrNAC128在不同組織中的表達(dá)差異； 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將PtrNAC128導(dǎo)入毛白楊(Populustomentosa)中進(jìn)行功能分析。本研究將有助于在轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面揭示木質(zhì)素合成調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

試驗(yàn)材料為毛果楊、毛白楊組培苗及溫室培養(yǎng)苗、煙草 (Nicotianabenthamiana) 幼苗。AxyPrep PCR清潔試劑盒、AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒、AxyPrep膠回收試劑盒采購(gòu)自AXYGEN公司。PCR高保真酶購(gòu)自大連寶生物科技有限公司；XcmⅠ 限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自NEB公司； Peasy-T1、大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自全式金生物有限公司。DAPI、CM-Dil 染色劑購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 毛果楊PtrNAC128 基因的克隆和序列分析

根據(jù)Hu等(2010)關(guān)于毛果楊NAC轉(zhuǎn)錄因子基因家族的報(bào)道，獲得PtrNAC128基因ID (Potri.006G152700.1)，并在Phytozome網(wǎng)站下載PtrNAC128基因序列。根據(jù)PtrNAC128基因序列，設(shè)計(jì)引物(表1)，以毛果楊葉cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得該基因，并連接到Peasy-T1載體，測(cè)序驗(yàn)證所克隆的PtrNAC128基因序列。分別使用在線(xiàn)軟件Gene Structure Display Server 2.0 和MEME分析PtrNAC128基因結(jié)構(gòu)和基序(Motif)。使用MEGA X對(duì)已知參與調(diào)控木質(zhì)部生長(zhǎng)發(fā)育的NAC結(jié)構(gòu)域蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3 PtrNAC128基因的qRT-PCR分析

毛果楊組培苗經(jīng)煉苗后，移植于10 cm×10 cm×15 cm容器中，1個(gè)月后移植入大盆內(nèi)，室外培養(yǎng)。生長(zhǎng)6個(gè)月后，取其嫩葉(頂芽下第2片葉)、老葉(頂芽下第7片)、嫩莖(第2節(jié)間)、老莖(第6節(jié)間)和根，迅速清洗材料表面，用濾紙吸凈表面水分后液氮凍存。提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板。以Pto18S為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，以各組織cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。qRT-PCR 反應(yīng)條件為： 95 ℃預(yù)變性30 s; 95 ℃變性5 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)。生物學(xué)重復(fù)3次，技術(shù)重復(fù)5次?；虮磉_(dá)量分析采用2-△△Ct法 (Livaketal., 2001)。利用SPPSS軟件分析顯著差異，用GraphPad Prism 5軟件作圖。

1.4 PtrNAC128基因植物過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及毛白楊遺傳轉(zhuǎn)化

利用在線(xiàn)軟件DNAMAN分析PtrNAC128基因CDS區(qū)域的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)含BglⅡ、SpeⅠ的上下游引物(表1)，構(gòu)建35S∷PtrNAC128-GFP重組載體，經(jīng)菌檢、測(cè)序驗(yàn)證。轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101，參照Li等(2018)方法進(jìn)行毛白楊遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)誘導(dǎo)愈傷、分化生芽、生根形成完整轉(zhuǎn)基因植株。煉苗后移至室外培養(yǎng)。提取轉(zhuǎn)基因植株葉片總RNA，用潮霉素篩選標(biāo)記特異性引物，進(jìn)行陽(yáng)性植株P(guān)CR鑒定。

1.5 亞細(xì)胞定位分析

將1.4中構(gòu)建的35S∷PtrNAC128-GFP重組載體，以及攜帶35S∷GFP未重組載體為對(duì)照，參照寧波新芝公司高壓氣體基因槍GJ-1000的操作手冊(cè)，在煙草葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，再在熒光顯微鏡下觀察，同時(shí)用核染料DAPI染細(xì)胞核，利用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)，明確PtrNAC128在細(xì)胞中的位置。

1.6 毛白楊莖橫切面解剖觀察

取毛白楊野生型及轉(zhuǎn)基因植株莖的第6節(jié)間，制作石蠟切片，滴加甲苯胺藍(lán)染色，之后在解剖鏡下觀察，藍(lán)色部分即為木質(zhì)素沉積的部分。

1.7 次生壁組分含量測(cè)定

1.7.1 木質(zhì)素含量測(cè)定 參照 Jung 等(1999)和Dence(1992)分別測(cè)定Klason 木質(zhì)素和酸溶木質(zhì)素含量。取生長(zhǎng)6個(gè)月的野生型和PtrNAC128過(guò)表達(dá)的毛白楊莖部作為材料，烘干后研磨成粉，過(guò)40目篩，稱(chēng)取材料0.2 g，隨后用苯∶乙醇(體積比2∶1)抽提8 h，將風(fēng)干的材料轉(zhuǎn)移至質(zhì)量分?jǐn)?shù)72%的濃硫酸(3 mL)中， 20 ℃ 2 h，用蒸餾水定容至100 mL，121 ℃ 1 h，最后，105 ℃干燥12 h。采用重力法測(cè)定酸不溶木質(zhì)素含量，濾液中酸溶木質(zhì)素在205 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。參照Liyama 等(1988)，采用乙酰溴法測(cè)定總木質(zhì)素。

1.7.2 纖維素及半纖維素含量測(cè)定 纖維素及半纖維素的含量參考Van Soest等(1967)方法測(cè)定。

1.8 次生壁組分合成關(guān)鍵酶基因及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析

取野生型和PtrNAC128過(guò)表達(dá)(PtrNAC128-OE)毛白楊組培苗嫩莖，提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板。利用qRT-PCR 分析木質(zhì)素合成途徑關(guān)鍵酶基因(CAD1、C3H3、COMT2、C4H2、CCoAOMT1、CSE1、HCT1、F5H2、CCR2、PAL1和4CL5)、纖維素合成酶基因(CesA7-A和CesA4)和半纖維素合成酶基因(GT8D、GT43B和GT43D)的表達(dá)差異(Shietal., 2010; Vanholmeetal., 2013； Songetal., 2010； Leeetal., 2011)。另外，對(duì)參與調(diào)控次生壁組分合成的已知NAC、MYB 轉(zhuǎn)錄因子(MYB028、MYB090、MYB152、MYB161、MYB168、MYB175、MYB192、NAC105、NAC154和NAC156) 在不同株系中的表達(dá)情況進(jìn)行分析(Lietal., 2018)。qRT-PCR同1.3，引物見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛果楊PtrNAC128基因克隆及結(jié)構(gòu)分析

毛果楊PtrNAC128基因，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度2 379 bp，ORF長(zhǎng)度1 374 bp，編碼蛋白457個(gè)氨基酸(圖1A)，包含6個(gè)外顯子(圖1B)，分子量51.47 kDa，A. PtrNAC128與擬南芥同源基因的氨基酸序列比對(duì)(深藍(lán)色代表完全一致氨基酸序列，上劃線(xiàn)代表NAC 保守結(jié)構(gòu)域); B.PtrNAC128基因結(jié)構(gòu)分析； C. PtrNAC128氨基酸序列保守模塊預(yù)測(cè)； D. PtrNAC128與其他參與調(diào)控次生壁發(fā)育的NAC蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。Ptr: 毛果楊; Os: 水稻; Zm: 玉米; Eg: 巨桉; 其余為擬南芥。A. Multiple sequence alignment between PtrNAC128 and the 3 homologes ofArabidopsis(Identical amino acids are shaded in dark blue, the conserved NAC domain are overlined); B. Gene structure ofPtrNAC128; C. Structure of PtrNAC128 protein potential motifs; D. Phylogenetic analysis of PtrNAC128 and other NAC proteins by the neighbor-joining method using MEGA version X. Ptr:Populustrichocarpa; Os:Oryzasativa; Zm:Zeamays; Eg:Eucalyptusgrandis; Others：Arabidopsisthaliana.

表1 引物序列Tab.1 List of primers

圖1 PtrNAC128與其他物種NAC蛋白序列的比較Fig.1 Comparison of PtrNAC128 with other NAC amino acid sequences

等電點(diǎn)(pI)6.51。在線(xiàn)軟件Pfam scan分析PtrNAC128蛋白結(jié)構(gòu)域的結(jié)果表明，PtrNAC128蛋白N端(48—189 aa) NAC保守結(jié)構(gòu)域包含A、B、C、D 4個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(圖1A)。MEME 的分析表明PtrNAC128蛋白含有10個(gè)較為保守的Motif，均勻分布在蛋白序列間，沒(méi)有聚集分布特征(圖1C)。搜集已知物種中參與調(diào)控木質(zhì)部發(fā)育的NAC 家族氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖1D)，結(jié)果顯示，PtrNAC128與擬南芥NAC075、SND2、SND3在同一支。PtrNAC128與擬南芥NAC075氨基酸序列相似性是63.69%，且主要集中在N端，C端差異明顯。這些結(jié)果表明，PtrNAC128在DNA結(jié)合區(qū)具有較強(qiáng)的保守性，但其激活區(qū)在進(jìn)化上具有較大的差異。

2.2 PtrNAC128基因的組織表達(dá)分析

取室外培養(yǎng)6個(gè)月的毛果楊扦插苗的根、嫩莖、老莖、嫩葉、老葉樣品，提取RNA,進(jìn)行PtrNAC128基因的qRT-PCR分析(圖2)。PtrNAC128基因在根、莖、葉中均有表達(dá)。在嫩葉中表達(dá)量最低； 老莖中表達(dá)量最高，老莖和嫩莖中的基因表達(dá)量分別約為嫩葉中的23.49倍和11.44倍。

圖2 PtrNAC128 組織特異性表達(dá)模式分析Fig.2 Expression patterns of PtrNAC128 in different tissues of poplar采用t檢驗(yàn)，*表示差異顯著(P < 0.05)，**表示差異極顯著(P < 0.01)。The single and double stars indicate significant difference at 0.05 and 0.01 levels of the gene expression in different tissues according to Student’s t-test.

圖3 PtrNAC128亞細(xì)胞定位分析Fig.3 Subcellular localization analysis of PtrNAC128熒光共聚焦顯微鏡追蹤PtrNAC128-GFP定位在細(xì)胞核內(nèi)，對(duì)照組顯示自由GFP均勻分布在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上。DAPI為細(xì)胞核染料。Confocal images of localization of PtrNAC128-GFP in tobacco(Nicotiana benthamiana) leaf epidermal cells. Bright field and fluorescent micrographs show the nuclear localization of PtrNAC128-GFP and free GFP expressed both in nuclear and cytomembrane localization in tobacco leaf epidermal cells. DAPI (40, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride), a nuclear staining dye.

2.3 亞細(xì)胞定位分析

利用基因槍法將35S∷PtrNAC128-GFP重組載體在煙草表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)，進(jìn)行亞細(xì)胞定位(圖3)。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，PtrNAC128蛋白集中分布在細(xì)胞核內(nèi)，表明其編碼核定位蛋白。

圖4 過(guò)表達(dá)PtrNAC128對(duì)毛白楊次生木質(zhì)部的影響Fig.4 Effects of PtrNAC128 overexpression on secondary xylem of Populus tomentosa stems標(biāo)尺 Scale bars A: 5 cm; D, E, F: 50 μm; G, H, I: 20 μm. A. 溫室培養(yǎng)6個(gè)月，野生型(WT)和過(guò)表達(dá)PtrNAC128代表性株系L6、L7(OE-L6、OE-L7)的表型； B.野生型和各轉(zhuǎn)基因材料(OE-L1-11)中PtrNAC128的相對(duì)表達(dá)量; C. 第6節(jié)間木質(zhì)部寬度統(tǒng)計(jì)； D.野生型(WT)毛白楊第6節(jié)間莖橫切面； E、F分別為過(guò)表達(dá)PtrNAC128的OE-L6和OE-L7第6節(jié)間莖切片材料； G、 H、 I分別為D、E、F的局部放大圖。Ph: 韌皮部; Xy： 木質(zhì)部; Ve: 導(dǎo)管; Xf: 木纖維。t 檢驗(yàn)結(jié)果： *表示差異顯著(P < 0.05); **表示差異極顯著(P < 0.01)； 下同。A. Phenotypes of representative 6-month-old wild-type(WT) and transgenic lines(OE-L6 and OE-L7); B. The relative expression levels of PtrNAC128 in transgenic(OE-L1-11) and wild-type poplar; C. Xylem width of wild-type and PtrNAC128 overexpression lines (OE-L6 and OE-L7). D,E,F are stem sections from the 6th internode of wild-type(D) and transgenic plants OE-L6(E)and OE-L7(F); G, H, I are the enlarged view of red rectangular in D, E, F, respectively. Ph: Phloem; Xy： Xylem; Ve: Vessel; Xf： Xylary fiber. The single and double stars indicate significant difference at 0.05 and 0.01 levels according to Student’s t-test, the same below.

2.4 PtrNAC128 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

構(gòu)建35S∷PtrNAC128-GFP植物表達(dá)載體，通過(guò)葉盤(pán)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，使PtrNAC128在毛白楊中過(guò)量表達(dá)。利用9 mg·L-1的潮霉素選擇壓力進(jìn)行篩選，篩選出陽(yáng)性植株。另外，通過(guò)qRT-PCR分析PtrNAC128表達(dá)情況，獲得PtrNAC128過(guò)量表達(dá)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗(圖4A、B)。

2.5 轉(zhuǎn)基因毛白楊植株表型分析

從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程看，過(guò)表達(dá)PtrNAC128毛白楊各株系與野生型相比沒(méi)有明顯差異(圖4A)。選取過(guò)表達(dá)株系L6和L7，進(jìn)一步通過(guò)解剖對(duì)莖橫切面進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)PtrNAC128較野生型的次生木質(zhì)部顯著增厚，為野生型的1.42～1.51倍(圖4C-F); 木質(zhì)部細(xì)胞層數(shù)增加，約為野生型的1.22～1.31倍(圖4G-I)。

2.6 木質(zhì)部細(xì)胞次生壁中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素含量測(cè)定

毛白楊野生型植株木質(zhì)素含量一般為189.7 mg·g-1, 過(guò)表達(dá)PtrNAC128各轉(zhuǎn)基因株系中Klason木質(zhì)素含量為212.7～231.9 mg·g-1，較野生型增加12%～22%； 利用乙酰溴法也發(fā)現(xiàn)同樣的趨勢(shì)(表2)。在過(guò)表達(dá)PtrNAC128各轉(zhuǎn)基因株系中，半纖維素的含量未發(fā)現(xiàn)顯著差異。過(guò)表達(dá)PtrNAC128各株系纖維素的含量為476.4～511.5 mg·g-1，較野生型(443.6 mg·g-1)增加7.4%～13.1%(表2)。

表2 過(guò)表達(dá)PtrNAC128和野生型毛白楊次生壁組分含量分析①Tab.2 Secondary cell wall composition analysis of the stems in PtrNAC128 overexpression and wild-type P. tomentosa

圖5 次生壁組分合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)Fig.5 Gene expression analysis of secondary wall biosynthetic genes

2.7 木質(zhì)部細(xì)胞次生壁組分關(guān)鍵合成酶基因及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)檢測(cè)

為了探究PtrNAC128調(diào)控次生壁各組分合成的分子機(jī)制，利用qRT-PCR，對(duì)木質(zhì)素、纖維素和半纖維素合成途徑的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)差異進(jìn)行分析。結(jié)果表明，木質(zhì)素合成途徑酶基因(PtoCAD1,PtoC3H3,PtoCOMT2,PtoC4H2,PtoCCoAOMT1,PtoCSE1,PtoHCT1,PtoF5H,PtoCCR2,PtoPAL1,Pto4CL5)表達(dá)水平均有顯著提高； 纖維素合成酶基因(PtoCesA7-A和PtoCesA4)表達(dá)量提高1.57～2.7倍； 而半纖維素合成酶基因(PtoGT8D,PtoGT43B和PtoGT43D)沒(méi)有明顯的變化(圖5)。

MYB、NAC轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控木質(zhì)素和纖維素的生物合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。用qRT-PCR檢測(cè)毛白楊植株中可能參與調(diào)控木質(zhì)素、纖維素合成的轉(zhuǎn)錄因子(PtoMYB028、PtoMYB090、PtoMYB152、PtoMYB161、PtoMYB168、PtoMYB175、PtoMYB192、PtoNAC105、PtoNAC154、PtoNAC156)表達(dá)情況。結(jié)果表明，PtoMYB028、PtoMYB152、PtoMYB161、PtoMYB192、PtoNAC105、PtoNAC156在過(guò)表達(dá)PtrNAC128各株系中均顯著上調(diào)(圖6)。這表明，PtrNAC128通過(guò)激活木質(zhì)素和纖維素相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)，影響木質(zhì)部次生壁各組分的合成。

圖6 次生壁組分合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)Fig.6 Gene expression analysis of secondary wall-associated transcription factors

3 討論

木材形成是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程。高等植物在長(zhǎng)期適應(yīng)陸地生境中，進(jìn)化出一套精細(xì)調(diào)控細(xì)胞次生壁組分的生物合成途徑。次生壁各組分的生物合成關(guān)鍵酶基因已經(jīng)分離并進(jìn)行了功能鑒定，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面也取得了一定進(jìn)展。研究表明，在擬南芥中，NAC和MYB轉(zhuǎn)錄因子分別作為第1級(jí)和第2級(jí)主開(kāi)關(guān), 共同激活下游轉(zhuǎn)錄因子和次生壁物質(zhì)合成基因的表達(dá)(Zhongetal., 2014; Nakanoetal., 2015)。SND1是激活次生壁物質(zhì)合成途徑的主要轉(zhuǎn)錄開(kāi)關(guān)。SND1不僅直接激活MYB46,MYB83,MYB103，SND3和KNAT7, 而且還調(diào)控SND2,MYB85,MYB52,MYB54,MYB69,MYB42,MYB43和MYB20等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá) (Zhongetal., 2009)。NST1和NST3也是調(diào)節(jié)次生壁加厚的重要轉(zhuǎn)錄因子。nst1和nst3雙突變體植株中次生壁增厚和纖維細(xì)胞中木質(zhì)素的沉積受到抑制, 植株呈現(xiàn)倒伏的表型(Mitsudaetal., 2007)。在木本植物中，也存在類(lèi)似的NAC-MYB轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。毛果楊PtrVNS1-16均包含NAC保守結(jié)構(gòu)域，其中PtrVNS1-12在木質(zhì)部中表達(dá)，這些基因不僅在序列上與擬南芥SND1存在相似性，而且在功能上也高度同源。過(guò)量表達(dá)這些基因均能夠?qū)е麓紊谠龊?Ohtanietal., 2011)。盡管在模式植物中，對(duì)于次生壁各組分的生物合成已經(jīng)進(jìn)行較為深入的研究，但其木質(zhì)素和纖維素合成的精細(xì)調(diào)控框架中仍存在許多未知途徑有待完善。Hu等(2010)通過(guò)對(duì)毛果楊不同組織的表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PNAC085、PNAC128等13個(gè)NAC基因特異地在發(fā)育中的木質(zhì)部中高表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，PtrNAC128在木質(zhì)部發(fā)育較為活躍的莖中表達(dá)量較高，尤其是老莖中表達(dá)量最高，與Hu等(2010)的結(jié)果一致，暗示PtrNAC128可能在木質(zhì)部發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，PtrNAC128與擬南芥ANAC075、SND2聚在一支，含有典型的NAC結(jié)構(gòu)域。在擬南芥中，Sakamoto等(2015)研究表明，ANAC075可回復(fù)nst1-1nst1-3雙突變體的木質(zhì)部發(fā)育缺陷。另外，F(xiàn)ujiwara等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，ANAC075主要在韌皮部中表達(dá)，anac075突變體表現(xiàn)為早花表型。本研究發(fā)現(xiàn)，毛果楊PtrNAC128在根、莖、葉中均有表達(dá)，其中在老莖中表達(dá)豐度最高(圖2), 揭示PtrNAC128可能參與木質(zhì)部的次生發(fā)育。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，PtrNAC128定位在細(xì)胞核內(nèi)(圖3)。在楊樹(shù)中，NST/SND同源基因均屬于NAC 結(jié)構(gòu)域蛋白，在調(diào)控木質(zhì)纖維、韌皮纖維和木射線(xiàn)細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Zhong等(2015)研究表明，nst1nst3雙突變體不能形成完整的束間纖維，nst1nst2nst3/snd1三突變體完全喪失了形成次生壁的能力。Takata 等(2019)研究表明，vns09vns10vns11vns12四突變體細(xì)胞壁組分積累受到抑制導(dǎo)致植株莖不能自然直立，株高較野生型減小。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)PtrNAC128株高沒(méi)有明顯差異。莖段橫切面染色觀察發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)PtrNAC128較野生型植株的木質(zhì)部細(xì)胞層數(shù)明顯增加，次生木質(zhì)部厚度顯著增大(圖4)； 木質(zhì)素、纖維素含量增加但半纖維素含量沒(méi)有明顯變化(表2)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)PtrNAC128通過(guò)影響木質(zhì)素和纖維素的含量，增加木材的含量。為了進(jìn)一步分析木質(zhì)部各組分(木質(zhì)素、纖維素)含量增加的原因，利用qRT-PCR的方法，檢測(cè)了木質(zhì)素生物合成中11個(gè)關(guān)鍵酶基因的變化情況。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株中所有木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平顯著增加，其中CAD1、C3H3、C4H2、CCoAOMT1、COMT2、CSE1、HCT1和F5H2變化尤為明顯(圖5)。這些結(jié)果表明，木質(zhì)素含量的增加可能通過(guò)調(diào)控木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平從而調(diào)控木質(zhì)素的合成來(lái)實(shí)現(xiàn)的。纖維素也是次生壁重要組分之一。前人的研究表明，楊樹(shù)CesA4、CesA7-A、CesA7-B、CesA8-A和CesA8-B是次生壁中纖維素合成的關(guān)鍵酶基因(Songetal.， 2010； Xietal., 2016)。本研究結(jié)果顯示，過(guò)量表達(dá)PtrNAC128各株系中纖維素合成酶基因PtoCesA7-A、PtoCesA4顯著上調(diào)，纖維素含量增加，半纖維素合成酶基因PtoGT8D、PtoGT43B和PtoGT43D沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明PtrNAC128對(duì)于木質(zhì)素和纖維素關(guān)鍵合成酶基因具有調(diào)控作用，但對(duì)半纖維素的生物合成沒(méi)有影響。

Zhong等(2011b)研究報(bào)道，毛果楊PtrMYB028、PtrMYB090、PtrMYB152、PtrMYB161、PtrMYB168、PtrMYB175、PtrMYB192、PtrNAC105和PtrNAC154/156等基因可被PtrWND2B/6B誘導(dǎo)表達(dá)，調(diào)控次生壁中木質(zhì)素、纖維素的累積。本研究結(jié)果表明，PtrNAC128可顯著誘導(dǎo)PtoMYB028、PtoMYB152、PtoMYB161、PtoMYB192、PtoNAC105、PtoNAC156的表達(dá)(圖6)，暗示PtrNAC128可通過(guò)調(diào)節(jié)這些次生壁組分合成的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而影響木質(zhì)素和纖維素的合成。

4 結(jié)論

在毛果楊中克隆到一個(gè)新的NAC基因PtrNAC128, 該基因轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度為2 379 bp，ORF長(zhǎng)度為1 374 bp，編碼蛋白457個(gè)氨基酸，且在 N端具典型NAC結(jié)構(gòu)域; 進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建分析顯示 PtrNAC128與擬南芥NAC075、SND2、SND3聚為一支，組織表達(dá)分析顯示在老莖中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。對(duì)PtrNAC128基因的功能分析顯示，毛果楊PtrNAC128通過(guò)激活木質(zhì)素和纖維素生物合成的關(guān)鍵酶基因及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控次生壁各組分的生物合成。過(guò)表達(dá)PtrNAC128轉(zhuǎn)基因株系的木質(zhì)素、纖維素的含量均顯著增加，可進(jìn)一步增加木材的利用率。本研究通過(guò)對(duì)楊樹(shù)PtrNAC128功能的解析，對(duì)木本植物定向育種和多功能利用提供了基因儲(chǔ)備。