楊 曉，馬子豪，馬 婕，呂金盈，何 娟，王長生，李愛暖，陳 晨，曾 銳*

粗莖秦艽種子萌發(fā)過程的轉(zhuǎn)錄組及關(guān)鍵因子分析

楊 曉?1，馬子豪?1，馬 婕?1，呂金盈?1，何 娟1，王長生?2，李愛暖?1，陳 晨?3*，曾 銳?1*

1. 西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041 2. 石柱土家族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)，重慶 409100 3. 西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041

研究粗莖秦艽種子萌發(fā)的轉(zhuǎn)錄組信息及影響因子。利用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定粗莖秦艽種子萌發(fā)前、萌發(fā)中及萌發(fā)后3個(gè)階段的轉(zhuǎn)錄組，并通過生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析。共獲得了149 463條Unigenes，平均長度為601.88 bp，其中79 412個(gè)Unigene獲得注釋。6943個(gè)基因差異表達(dá)，大部分表現(xiàn)為萌發(fā)后上調(diào)表達(dá)，其中5188個(gè)富集到GO條目中，1815個(gè)富集到KEGG通路中，大多參與光反應(yīng)過程、細(xì)胞壁合成、脂質(zhì)代謝及次生代謝中。單堿基到六堿基核苷酸的SSR重復(fù)類型均有檢出，SSR發(fā)生頻率為15.13%，出現(xiàn)頻率為18.81%，平均每3199 bp就含有1個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR重復(fù)類型豐富，數(shù)目較多。粗莖秦艽種子萌發(fā)過程有大量調(diào)控基因參與，光照、激素為重要的調(diào)控因子，SSR專用標(biāo)記的開發(fā)切實(shí)可靠，且為粗莖秦艽的次生代謝調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

粗莖秦艽；種子；轉(zhuǎn)錄組；代謝通路；SSR標(biāo)記；RNA-seq

秦艽性味辛、苦、平，歸胃、肝、膽經(jīng)，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，具祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛和退虛熱的功效?[1]，為我國常用的重要藥材。粗莖秦艽Duthie ex Burk.為《中國藥典》2015年版秦艽確定的基原之一，是我國目前栽培量最大的秦艽品種?[2]。近年來臨床用藥量增加，過度采挖導(dǎo)致秦艽野生資源日漸枯竭?[3]，秦艽價(jià)格不斷上漲迫切需要開展秦艽規(guī)模化人工栽培。粗莖秦艽以有性繁殖為主，其種子自然萌發(fā)發(fā)芽率低，萌發(fā)周期差異大?[4]，導(dǎo)致秦艽繁殖能力低，是困擾人工栽培的重要問題。近年來，主要用過溫水催芽、赤霉素浸種?[5]，CO?2激光處理?[6]，不同芽床?[7]，光照、水分等環(huán)境因子?[8]等生理手段研究秦艽種子萌發(fā)的機(jī)制，其分子機(jī)制研究未見報(bào)道。

轉(zhuǎn)錄組為特定細(xì)胞或組織在功能狀態(tài)或某一發(fā)育階段下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的集合?[9]。高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展使得無參考基因組植物基因表達(dá)信息的獲得變得越來越簡便、快捷。近年來，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）越來越多的運(yùn)用到種子萌發(fā)機(jī)制的研究中，如在西洋參?[10]、黃芪?[11]等種子萌發(fā)機(jī)制中的研究。本研究擬通過粗莖秦艽種子萌發(fā)前、中、后3個(gè)不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，初步分析粗莖秦艽種子萌發(fā)過程的相關(guān)基因、途徑以及重要調(diào)控因子，為探索秦艽種子萌發(fā)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料

試驗(yàn)所用粗莖秦艽種子于2016年采自四川省阿壩州黑水縣沙石多鄉(xiāng)甲足村（102°55′11.95″E，32°7′37.14″N，海拔2710 m）粗莖秦艽種植基地3年生成熟種子，經(jīng)西南民族大學(xué)劉圓教授鑒定為龍膽科植物粗莖秦艽Duthie ex Burk.的成熟種子。

1.2 儀器與試劑

本實(shí)驗(yàn)借助Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)，建庫采用illumina原裝試劑盒。1%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染，Nanodrop 2000（Thermo Fisher公司，美國）檢測(cè)RNA的純度，Qubit 2.0（Invitrogen公司，美國）對(duì)RNA濃度進(jìn)行精確定量，Agilent 2100（Agilent公司，美國）精確檢測(cè)RNA的完整性，采用Estscan（3.0.3）軟件預(yù)測(cè)其開放讀碼框，從而得到這部分基因編碼的核酸序列和氨基酸序列，采用Primer3（2.3.5）進(jìn)行簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSRs）引物設(shè)計(jì)。

2 方法

2.1 種子的萌發(fā)

選取飽滿種子于12 h光照，恒溫25 ℃下萌發(fā)，分別取將萌發(fā)前（飽滿的種子，未進(jìn)行萌發(fā)，編號(hào)GC-MFQ-01、GC-MFQ-02、GC-MFQ-03）、萌發(fā)中（種子萌發(fā)至13 d，剛出現(xiàn)露白，編號(hào)GC-MFZ-01、GC-MFZ-02、GC-MFZ-03）、萌發(fā)后（從露白開始計(jì)時(shí)，用時(shí)5 d，胚根長至0.3～0.5 cm，編號(hào)GC-MFH-01、GC-MFH-02、GC-MFH-03）3個(gè)階段（圖1）。每個(gè)階段取3個(gè)生物樣品重復(fù)，迅速放入液氮中固定，?80 ℃冰箱儲(chǔ)藏備用。

2.2 RNA抽提及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

樣品總RNA提取按照改良的Trizol的方法進(jìn)行?[12]，檢測(cè)達(dá)到測(cè)序質(zhì)量后構(gòu)建文庫。庫檢合格后，由北京諾禾致源科技股份有限公司Illumina HiSeq?TM2000平臺(tái)進(jìn)行建庫測(cè)序。

2.3 轉(zhuǎn)錄組分析

利用Trinity?[13]對(duì)clean reads進(jìn)行拼接，取每條序列中最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene，以此進(jìn)行后續(xù)的分析。基于BLAST?[14]法取值＜1e?5給出Unigene的蛋白數(shù)據(jù)庫NR注釋、SWISSPROT注釋，蛋白相鄰類的聚簇（KOG）功能注釋、GO（gene ontology）分類和京都基因與基因組百科全書（KEGG）代謝通路分析。Unigene表達(dá)量的計(jì)算使用FPKM（fragments Per kb per Million reads）法?[15]。

A-萌發(fā)前 B-萌發(fā)中 C-萌發(fā)后

A為基因名，F(xiàn)PKM(A)為基因A的表達(dá)量，為比對(duì)到基因A的fragments數(shù)，為比對(duì)到所有基因的總fragments數(shù)，為基因的長度

利用MISA軟件?[16]對(duì)粗莖秦艽種子Unigenes進(jìn)行SSRs檢測(cè)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量分析與Unigene拼接、注釋

對(duì)粗莖秦艽種子的132 532 476條轉(zhuǎn)錄組raw data進(jìn)行過濾，各樣品的clean bases為5.99～6.80 Gb，Q30均在94.71%以上，GC含量平均值為43.71%（表1）。取每條基因中最長的轉(zhuǎn)錄本為Unigene，共獲得149 463條Unigene，平均長度為601.88 bp，N50為909，長度在1 kb以上的有22 147條，表明組裝結(jié)果較可靠。

表1 樣品轉(zhuǎn)錄組clean data統(tǒng)計(jì)

raw data為原始測(cè)序序列；clean data為去除接頭、無法確定堿基信息及低質(zhì)量reads的序列數(shù)據(jù)；clean bases為測(cè)序序列的長度；Q30為堿基正確識(shí)別率達(dá)99.9%的序列比例；GC含量為堿基G和C占總的堿基數(shù)量的百分比

Raw Data was the original sequencing sequence; Clean Data was the sequence data with unconnected base information and low-quality reads; Clean bases was the length of the sequencing sequence; Q30 was the sequence ratio with a correct base recognition rate of 99.9%; GC content was the percentage of bases G and C to the total number of bases.

對(duì)獲得的Unigene進(jìn)行注釋，共有79 412個(gè)Unigene獲得注釋信息，約占Unigene總數(shù)的53.13%（圖2-B），與NR數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果見圖2-A，其中，與咖啡Pierre ex Froehn.的同源性最高，達(dá)21.7%，其次為葡萄L. 為5.5%，油菜L. 為5.2%，芝麻L. 為4.3%，煙草L為3.0%，其余物種均小于3%。

圖2 粗莖秦艽轉(zhuǎn)錄組NR數(shù)據(jù)庫比對(duì)物種分布(A) 及注釋統(tǒng)計(jì) (B)

3.2 粗莖秦艽種子萌發(fā)過程中差異表達(dá)基因分析

差異基因共6943個(gè)。與粗莖秦艽種子未萌發(fā)的轉(zhuǎn)錄組對(duì)比，萌發(fā)中共有差異基因5960個(gè)，萌發(fā)后共有差異基因5619個(gè)，萌發(fā)后與萌發(fā)中共有差異基因587個(gè)，共同差異基因?yàn)?86個(gè)。對(duì)共同差異表達(dá)的基因進(jìn)行聚類分析，大部分差異基因表現(xiàn)為萌發(fā)中、萌發(fā)后上調(diào)表達(dá)。差異基因韋恩及聚類分析見圖3。

3.3 差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析

對(duì)粗莖秦艽種子萌發(fā)過程中的差異基因進(jìn)行GO分類富集分析，結(jié)果表明，共有5188個(gè)差異基因富集到GO條目中，其中光合作用、淀粉代謝過程、蔗糖代謝過程為生物過程的優(yōu)勢(shì)富集條目，富集到的差異基因分別占總基因數(shù)的1.40%、1.35%和1.35%；光系統(tǒng)II和細(xì)胞壁為細(xì)胞組分的優(yōu)勢(shì)富集條目，富集到的差異基因分別占總基因數(shù)的0.94%和0.83%；CH-OH基團(tuán)為供體，NAD/NADP為受體的氧化還原酶活性和醇類為受體的磷酸酶活性為分子功能的優(yōu)勢(shì)富集條目，富集到的差異基因分別占總基因數(shù)的17.15%和15.42%（圖4）。對(duì)粗莖秦艽種子萌發(fā)過程中的差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果表明，共有1815個(gè)差異基因富集到KEGG通路中，其中淀粉和蔗糖的代謝（參與該通路的差異基因占比為5.29%）、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（4.41%）、苯丙素類的生物合成（3.97%）、氨糖和核糖代謝（3.53%）、半胱氨酸和蛋氨酸代謝（2.81%）、光合作用的碳固定（2.75%）、脂肪酸代謝（2.70%）、戊糖-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換（2.37%）、光合作用（2.26%）和萜類化合物骨架的生物合成（1.82%）為KEGG富集途徑的Top10（圖5）。

圖3 差異基因維恩(A)及聚類分析(B)

圖4 差異基因的GO富集分析

圖5 差異KEGG富集(top20)

3.4 種子萌發(fā)的差異代謝及調(diào)控過程分析

粗莖秦艽為環(huán)烯醚萜類、黃酮類等次生代謝產(chǎn)物含量豐富的藥用植物，因此，對(duì)粗莖秦艽種子萌發(fā)過程中的代謝過程進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析。較多的差異基因參與光反應(yīng)過程、細(xì)胞壁合成、脂質(zhì)代謝及次生代謝中（圖6）。植物通過感受外界及自身的信號(hào)調(diào)控自身的發(fā)育，秦艽種子萌發(fā)過程中參與赤霉素、生長素、細(xì)胞分裂素等調(diào)控過程的差異基因數(shù)目較多，同時(shí)，大量的轉(zhuǎn)錄因子也參與了種子萌發(fā)過程的調(diào)控。通過以上統(tǒng)計(jì)分析，光照條件為秦艽種子萌發(fā)重要的外界條件，赤霉素、生長素、細(xì)胞分裂素等通過單獨(dú)或聯(lián)合調(diào)控萌發(fā)。

種子萌發(fā)過程中，含氮化合物、異戊二烯類、黃酮類等次生代謝過程中基因表達(dá)差異，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控著基因的表達(dá)，大量的轉(zhuǎn)錄因子在種子萌發(fā)過程中差異表達(dá)，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，Auxin Response Factor家族、bHLH家族、Constans-like zinc finger家族、MYB-domain家族、WRKY家族、Aux/IAA家族、bZIP家族、NAC-domain家族為差異基因數(shù)目較多的轉(zhuǎn)錄因子家族，結(jié)果見表3。

A-差異代謝富集 B-差異調(diào)控富集

表2 粗莖秦艽種子萌發(fā)過程次生代謝差異基因統(tǒng)計(jì)

3.5 SSRs特征分析

利用軟件MISA對(duì)粗莖秦艽轉(zhuǎn)錄組149 463條Unigene序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)分析，單堿基到六堿基核苷酸重復(fù)類型均有檢出。其中，28 120個(gè)SSR分布于22 613條Unigene序列中，SSR發(fā)生頻率（含有SSR的Unigene數(shù)目與總Unigene的數(shù)目之比）為15.13%，出現(xiàn)頻率（檢出SSR個(gè)數(shù)與總Unigene數(shù)目之比）為18.81%，平均每3199 bp就含有1個(gè)SSR位點(diǎn)（圖7）。其中18 167條Unigenes只包含單個(gè)SSR位點(diǎn)，4446條Unigenes包含1個(gè)以上SSR位點(diǎn)。粗莖秦艽SSR重復(fù)類型豐富，數(shù)目較多。

從SSR位點(diǎn)數(shù)量上看，出現(xiàn)最多的為一至三核苷酸重復(fù)，占到總SSR位點(diǎn)數(shù)量的98.45%。其中單核苷酸重復(fù)比例最高，可占到62.42%，A/T為優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型，占單核苷酸重復(fù)類型的95.66%；其次為三核苷酸和雙核苷酸重復(fù)，分別為19.46%和16.59%，AAG/GAA為三核苷酸優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型，占三核苷酸重復(fù)類型的7.78%，AT/TA為二核苷酸優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型，占二核苷酸重復(fù)類型的54.91%。四、五、六核苷酸重復(fù)類型的數(shù)量很少，總計(jì)占比1.55%（表4）。

表3 粗莖秦艽種子萌發(fā)過程差異轉(zhuǎn)錄因子統(tǒng)計(jì)

圖7 粗莖秦艽種子轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型統(tǒng)計(jì)

4 討論

4.1 秦艽有效成分合成基因的篩選

粗莖秦艽的主要活性成分有環(huán)烯醚萜類、黃酮類、萜類及苯丙素類等[17-19]，對(duì)粗莖秦艽種子萌發(fā)過程的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，大量的次生代謝相關(guān)基因差異表達(dá)，包括含氮化合物、異戊二烯類、黃酮類等，與陳俊可等?[18]、王長生等[19]對(duì)于粗莖秦艽有效成分的鑒定結(jié)果一致。因此，在后續(xù)研究中，應(yīng)對(duì)該部分基因進(jìn)行克隆及功能驗(yàn)證，以期解析粗莖秦艽有效成分的基因合成路徑，為粗莖秦艽有效成分的生物合成奠定基礎(chǔ)。

表4 粗莖秦艽種子轉(zhuǎn)錄組的SSR位點(diǎn)分析

4.2 秦艽種子萌發(fā)水平的機(jī)制初探

植物激素是一類調(diào)節(jié)植物生理反應(yīng)的活性物質(zhì)?[20]。赤霉素?[21]、脫落酸?[22]、乙烯?[20]均可參與種子休眠的調(diào)控；生長素促進(jìn)細(xì)胞的分裂與分化?[23]；細(xì)胞分裂素可調(diào)控芽的形成?[24]。統(tǒng)計(jì)粗莖秦艽種子萌發(fā)過程差異表達(dá)基因，大量的生長素、赤霉素調(diào)控基因差異表達(dá)，因此，生長素、赤霉素在粗莖秦艽種子萌發(fā)過程中起重要作用。與侯格平等?[5]使用了赤霉素浸種秦艽種子，提高了其萌發(fā)率相符合。另外，光反應(yīng)過程、碳固定、淀粉和蔗糖代謝相關(guān)基因大量差異表達(dá)，表明光照應(yīng)為粗莖秦艽種子萌發(fā)的重要條件。因此，后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)繼續(xù)驗(yàn)證光照、植物內(nèi)源激素對(duì)秦艽種子萌發(fā)的調(diào)控功效，以期提高粗莖秦艽種子萌發(fā)水平。

4.3 秦艽專屬SSR標(biāo)記的開發(fā)

SSR標(biāo)記因其可重復(fù)性、多等位性、共顯性遺傳、相對(duì)豐度和良好的基因組覆蓋率等特點(diǎn)，在植物遺傳育種中廣泛的應(yīng)用?[25]。利用轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SSR標(biāo)記均位于編碼區(qū)，因此，更有效地解釋了不同品種的表型和功能的多樣性，目前厚樸?[26]、云錦杜鵑?[27]等已利用轉(zhuǎn)錄組成功開發(fā)出有效的SSR標(biāo)記。分析粗莖秦艽轉(zhuǎn)錄組的SSR特征，表明SSR類型豐富、數(shù)量可觀，為粗莖秦艽遺傳多樣性研究及分子育種提供研究基礎(chǔ)。

綜上，研究粗莖秦艽種子萌發(fā)過程的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，獲得了大量的重要信息，后續(xù)將通過驗(yàn)證各個(gè)因子對(duì)于粗莖秦艽種子萌發(fā)的影響，揭示粗莖秦艽種子萌發(fā)的機(jī)制，探索提高其萌發(fā)率及成活率的技術(shù)手段。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Transcriptome and key factors analysis ofin seed germination process

YANG Xiao?1, MA Zi-hao?1, MA Jie?1, LYU Jin-ying?1, HE Juan?1, WANG Chang-sheng?2, LI Ai-nuan1, CHEN Chen3, ZENG Rui?1

1. School of Pharmacy, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China 2. Shizhu Tujia Autonomous County Agriculture and Rural Committee, Chongqing 409100, China 3. Institute of Qinghai-tibetan Plateau, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China

To explore the transcriptome information and key factors ofin seed germination process.The transcriptome of the stage before germination, during germination and after germination ofwere determined by high-throughput sequencing and analyzed by systemic bioinformatics.A total of 149 463 unigenes were obtained, with an average length of 601.88 bp, and 79 412 unigenes were successfully annotated. A total of 6943 genes were differentially expressed, most of which were up-regulated after germination. Among them, 5188 genes were enriched in the GO and 1815 genes were enriched in the KEGG pathway, most of which were involved in the light reaction, cell wall synthesis, lipid metabolism and secondary metabolism. The 1—6 nucleotides SSR repeat types were all detected. The frequency of SSR occurrence was 15.13% and the frequency of appearing was 18.81%. On average, every 3199 bp contained one SSR site. Abundant SSR repeat types and a large number of SSR repeat types were obtained.A large number of genes were involved in regulating the germination process of. Light and plant hormones were important regulatory factors. The special SSR markers development was effective and reliable through transcriptome information. This study provided a reference for further understanding of regulation ofsecondary metabolism.

Duthie ex Burk.; seeds; transcriptome; metabolim pathway; SSR markers; RNA-seq

R282.12

A

0253 - 2670(2021)01 - 0219 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.026

2020-06-06

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFC1700705）；四川省留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目擇優(yōu)資助經(jīng)費(fèi)計(jì)劃（2018-68）；四川省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2019YFS0174）；四川省科技支撐項(xiàng)目（14ZC2103）；西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項(xiàng)目（CX2020SZ77）

楊 曉（1997—），碩士研究生，主要從事中藥資源研究。Tel: 13258279138 E-mail: xiaoyeeyang@yeah.net

陳 晨（1987—），助理研究員，博士，主要從事藥用植物發(fā)育分子機(jī)理及民族藥資源研究。Tel: (028)83372832 E-mail: lilychenqhu@163.com

曾 銳（1976—），教授，主要從事中藥和民族藥研究。Tel: (028)85522099 E-mail: rzeng@swun.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]