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青蒿琥酯干預(yù)對(duì)伴糖尿病牙周炎大鼠腸道組織TNF-α、 MMP-9及Caspase 3表達(dá)的影響

2021-01-06 08:20農(nóng)曉琳
口腔醫(yī)學(xué) 2020年12期
關(guān)鍵詞:牙周牙周炎上皮

袁 仲,農(nóng)曉琳,陳 怡,梁 晨

糖尿病作為臨床上常見的慢性內(nèi)分泌疾病,獲得極大的關(guān)注,然而其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。糖尿病的發(fā)生發(fā)展伴隨著多種并發(fā)癥,其中牙周炎作為一種常見的口腔疾病,因其與糖尿病關(guān)系密切又被稱為糖尿病的“第六大并發(fā)癥”。牙周炎是主要由牙周菌斑引起,臨床表現(xiàn)為牙周軟硬組織局部破壞。伴糖尿病牙周炎因?yàn)榭谇痪哼M(jìn)一步紊亂、牙周組織浸潤性炎癥加重而具有臨床癥狀嚴(yán)重、治療困難易反復(fù)等特征。糖尿病與牙周炎往往共存并且相互促進(jìn)與影響,二者的交互作用又會(huì)導(dǎo)致全身多靶器官進(jìn)一步受損。已有研究指明,體內(nèi)的高血糖環(huán)境會(huì)引起腸道屏障功能受損從而引發(fā)腸源性感染[1];另一方面,牙周菌群亦可引起腸道菌群紊亂從而導(dǎo)致腸道內(nèi)廣泛炎癥損害[2]。所以我們推測(cè),伴糖尿病牙周炎相較單純糖尿病或牙周炎可能會(huì)進(jìn)一步加重腸道的破壞而引發(fā)相應(yīng)并發(fā)癥。

在前期研究中,青蒿琥酯(artesunate,ART)作為青蒿素的水溶性衍生物已經(jīng)證實(shí)在糖尿病多靶器官損傷中的治療作用。因其具有優(yōu)秀的抗炎[3]、抗菌[4]等能力,ART在伴糖尿病牙周炎的治療中可能存在一定的價(jià)值。本研究試圖通過構(gòu)建伴糖尿病牙周炎大鼠模型,采用青蒿琥酯干預(yù)治療后,觀察青蒿琥酯對(duì)伴糖尿病牙周炎大鼠腸道組織的影響,并探究其可能存在的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

取32只6周齡,體重190~210 g,健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過),隨機(jī)分為4組,即健康對(duì)照組、糖尿病組、伴糖尿病牙周炎組以及ART干預(yù)組。分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,自由攝食及攝水。

1.2 各組實(shí)驗(yàn)?zāi)P徒?/h3>

第1周末,除健康對(duì)照組8只動(dòng)物外,其余各組共24只大鼠均按下述方法制備1型糖尿病模型。大鼠禁食12 h后,鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)于腹膜下注射60 mg/kg,單次注射。注射3 d后進(jìn)行糖尿病的成模鑒定,以大鼠尾部靜脈血空腹血糖值>16.7 mmol/L作為1型糖尿病模型建立成功指標(biāo),且2周內(nèi)3次重復(fù)測(cè)量均穩(wěn)定>16.7 mmol/L者作為糖尿病成模動(dòng)物進(jìn)入牙周炎建模實(shí)驗(yàn)。

活化保存菌種牙齦卟啉單胞菌菌株(P.gingivalisATCC33277)接種于培養(yǎng)基中,厭氧培養(yǎng)細(xì)菌并配制成新鮮菌液。于第3周末在前述成功建立1型糖尿病大鼠模型的基礎(chǔ)上,隨機(jī)選取16只糖尿病大鼠在其雙側(cè)上頜第二磨牙采取結(jié)扎絲結(jié)扎和涂布菌液的方法構(gòu)建伴糖尿病牙周炎模型。0.5%戊巴比妥鈉麻醉后,探查雙側(cè)上頜第二磨牙并分離牙齦,采用 4-0 正畸結(jié)扎絲在齦溝內(nèi)結(jié)扎,將配置完備的牙齦卟啉單胞菌菌液涂布于結(jié)扎絲上及齦溝內(nèi)深入結(jié)合上皮處。建模后每周探診并補(bǔ)充涂布菌液,若牙周袋形成則將結(jié)扎絲進(jìn)一步推進(jìn)至牙周袋底。至第10周末,伴糖尿病牙周炎大鼠建模成功。

1.3 藥物干預(yù)及標(biāo)本采集

第10周末,大鼠糖尿病及牙周炎模型穩(wěn)定,一般狀況穩(wěn)定。對(duì)ART干預(yù)組大鼠進(jìn)行ART干預(yù),健康對(duì)照組、糖尿病組、伴糖尿病牙周炎組均給予生理鹽水對(duì)照干預(yù)。本實(shí)驗(yàn)采用60 mg/kg濃度ART對(duì)ART干預(yù)組大鼠進(jìn)行灌胃處理。每天干預(yù)1次,共持續(xù)4周。在ART干預(yù)過程中對(duì)健康對(duì)照組、糖尿病組以及伴糖尿病牙周炎組大鼠每日給予同量生理鹽水灌胃處理。第14周末處死大鼠,剪取距回盲端5 cm的回腸2 cm長,于4% 多聚甲醛溶液中固定保存。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 腸道上皮組織病理學(xué)觀察 大鼠腸道組織常規(guī)固定、脫水、包埋,腸腔橫斷面切片4 μm 厚,每份標(biāo)本各切片4張備用,蘇木精-伊紅(HE)染色對(duì)各組大鼠腸道上皮組織病理學(xué)改變進(jìn)行觀察。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色觀察腸道上皮腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9, MMP-9)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(cysteinecontaining aspartate-specific proteases 3, Caspase 3)表達(dá) 取上述切片,浸沒于枸櫞酸溶液中,使用高壓鍋進(jìn)行高壓抗原修復(fù)。5 min后將其取出自然冷卻,洗滌后在3%過氧化氫溶液中浸泡。PBS沖洗,山羊血清封閉。選擇一抗:兔抗鼠TNF-α、MMP-9、Caspase 3(均購自Bioworld公司,中國),滴加1∶100稀釋抗體。過夜后滴加羊抗鼠抗兔通用型HRP標(biāo)記二抗(武漢博士德公司,中國)。二抗孵育后PBS沖洗3次,DAB顯色,復(fù)染,干燥,封片。以腸道上皮組織內(nèi)棕黃色顆粒狀黃染作為陽性指標(biāo),鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,采用Image Pro Plus 6.0圖片分析軟件分析計(jì)算腸道上皮組織中TNF-α、MMP-9及Caspase 3光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,4組數(shù)據(jù)比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。如果方差齊則對(duì)數(shù)據(jù)行單因素方差分析,并采用SNK-q做組間兩兩比較;若方差不齊則行秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腸道組織HE染色觀察結(jié)果

各組大鼠回腸HE染色圖像見圖1??梢娊】祵?duì)照組大鼠腸道上皮各層分界清楚、排列整齊,肌層完整無破壞,腸腺排列較整齊,絨毛呈指狀無萎縮無斷裂。糖尿病組大鼠腸道黏膜結(jié)構(gòu)有破壞,具體表現(xiàn)為肌層損傷,腸絨毛萎縮,腸腺減少并伴有變形。伴糖尿病牙周炎組大鼠腸道上皮破壞較糖尿病組表現(xiàn)明顯且嚴(yán)重,具體體現(xiàn)為肌層損壞加重伴有“剝脫樣”改變,腸腺萎縮變形周圍多淋巴細(xì)胞浸潤,腸絨毛排列不整伴有粘連。ART干預(yù)組大鼠腸道肌層完整,絨毛排列整齊,淋巴細(xì)胞浸潤較伴糖尿病牙周炎組減輕。

圖1 各組大鼠腸道組織HE、免疫組化染色結(jié)果( ×200)

2.2 腸道組織TNF-α, MMP-9及Caspase 3免疫組化染色觀察結(jié)果

TNF-α是炎癥信號(hào)通路的一種表達(dá)因子,在正常腸道組織中較少表達(dá)在絨毛內(nèi)細(xì)胞間質(zhì)以及黏膜下層,表現(xiàn)為棕黃色及棕紅色顆粒狀、片狀深染。根據(jù)圖像分析結(jié)果,伴糖尿病牙周炎組TNF-α陽性表達(dá)水平最高,糖尿病組陽性表達(dá)次之,ART干預(yù)組及健康對(duì)照組表達(dá)最低。其中,ART干預(yù)組與健康對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其余健康對(duì)照組、糖尿病組、伴糖尿病牙周炎組及ART干預(yù)組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、2。

MMP-9是一種基質(zhì)金屬蛋白酶,在正常腸道中腸絨毛及腺泡周圍細(xì)胞間質(zhì)較少表達(dá)或不表達(dá)。圖像分析結(jié)果示:伴糖尿病牙周炎組及糖尿病組MMP-9陽性表達(dá)水平最高,ART干預(yù)組表達(dá)次之,健康對(duì)照組MMP-9表達(dá)最低。各組兩兩比較,ART干預(yù)組與健康對(duì)照組、糖尿病組與伴糖尿病牙周炎組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、2。

Caspase 3參與調(diào)控細(xì)胞凋亡,在正常腸道上皮中不表達(dá)或很少表達(dá)。在伴糖尿病牙周炎組及糖尿病組中Caspase 3表達(dá)最高,在ART干預(yù)組表達(dá)較低,在健康對(duì)照組中表達(dá)最低。SNK-q分析,伴糖尿病牙周炎組與糖尿病組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、2。

*:P<0.05, **:P<0.01, ***:P<0.001, n=8

3 討 論

糖尿病會(huì)使全身多靶器官處于慢性高炎癥狀態(tài)從而導(dǎo)致多種并發(fā)癥狀。已有研究表明,糖尿病會(huì)引起腸道內(nèi)環(huán)境改變,繼而引發(fā)腸道內(nèi)慢性炎癥改變、腸道通透性增加、腸道上皮破壞等一系列病損。其中,腸道微生物失衡可能作為糖尿病致腸道炎癥的一條重要途經(jīng)。Zhang等[5]通過16SrDNA腸道菌群測(cè)序的方法,發(fā)現(xiàn)隨著葡萄糖耐受不良的進(jìn)展,腸道內(nèi)擬桿菌屬和梭菌屬富集程度發(fā)生波動(dòng),鏈球菌則呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢(shì)。而這種菌群結(jié)構(gòu)紊亂,則會(huì)導(dǎo)致腸腔內(nèi)乳酸菌等益生菌顯著減少,革蘭陰性腸道病原菌占比大幅增加,產(chǎn)生大量內(nèi)毒素,使腸道屏障功能受損,腸道上皮炎癥浸潤。Thaiss等[1]發(fā)現(xiàn)在糖尿病的小鼠模型中,高血糖環(huán)境通過腸道上皮細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter type 2, GLUT2)來驅(qū)動(dòng)腸屏障通透性,由此得出高血糖介導(dǎo)的屏障破壞會(huì)導(dǎo)致微生物產(chǎn)物的全身流入并增加腸道感染。

口腔和腸道通過消化道連接,二者在微生物構(gòu)成及致病方面有著多種多樣的聯(lián)系。牙周炎作為口腔局部炎癥會(huì)對(duì)腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)組成產(chǎn)生遠(yuǎn)隔影響。Tamotsu等[6]對(duì)小鼠口服牙齦卟啉單胞菌以觀察腸道內(nèi)微生物改變,發(fā)現(xiàn)口服牙齦卟啉單胞菌后腸道內(nèi)擬桿菌及普氏菌增加,腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。這表明,與牙周炎關(guān)系密切的細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致腸道內(nèi)細(xì)菌構(gòu)成發(fā)生改變。然而值得注意的是,牙齦卟啉單胞菌并不直接在小鼠腸道中檢出,由此可推斷牙周炎并不通過細(xì)菌直接定植方式改變腸道菌群結(jié)構(gòu),而是通過其他途徑影響腸道內(nèi)環(huán)境。Nakajima等[7]研究發(fā)現(xiàn),小鼠口服牙齦卟啉單胞菌會(huì)引起血清內(nèi)毒素水平增加,且腸道上皮中與腸道通透性相關(guān)蛋白基因水平下調(diào)。這提示牙周炎可能通過牙周組織內(nèi)過量革蘭陰性菌釋放內(nèi)毒素進(jìn)入外周血,通過體循環(huán)至腸道組織,引發(fā)腸道上皮內(nèi)廣泛炎癥,破壞腸道屏障,進(jìn)入腸腔,改變腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)。

由此可見,糖尿病及牙周炎可分別引起腸道上皮受損及炎癥。因此,伴糖尿病牙周炎作為臨床上常見的一種伴發(fā)疾病會(huì)引起腸道組織更嚴(yán)重的破壞。通過實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)了這一點(diǎn):糖尿病及伴糖尿病牙周炎大鼠相較健康對(duì)照組大鼠腸道組織結(jié)構(gòu)有破壞,TNF-α、MMP-9及Caspase 3表達(dá)均較高,且伴糖尿病牙周炎組大鼠較糖尿病組大鼠TNF-α、MMP-9及Caspase 3表達(dá)更突出。

在對(duì)糖尿病及牙周炎兩種疾病的研究中,炎癥信號(hào)通路一直是關(guān)注的焦點(diǎn)。TNF-α是核因子-κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)信號(hào)通路的一種促炎因子,其在糖尿病相關(guān)靶器官及牙周炎癥組織中均有高表達(dá)[8]。在本實(shí)驗(yàn)研究中,伴糖尿病牙周炎大鼠腸道上皮內(nèi)TNF-α表達(dá)較正常大鼠顯著增加,提示伴糖尿病牙周炎通過炎癥信號(hào)通路影響、破壞腸道上皮組織。MMP-9在炎癥性腸病領(lǐng)域有著較為重要的作用。Garg等[9]發(fā)現(xiàn),MMP-9能夠調(diào)節(jié)腸道組織中杯狀細(xì)胞的分化,這改變了腸道黏膜的防御屏障,從而導(dǎo)致了腸道炎癥。也有研究發(fā)現(xiàn),牙周炎患者牙周菌群的構(gòu)成與TNF-α、MMP-9等因子有顯著的相關(guān)性[10]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出:與正常大鼠相比,糖尿病及伴糖尿病牙周炎大鼠腸道組織中MMP-9水平提高,由此可見伴糖尿病牙周炎對(duì)腸道炎癥損傷作用顯著。Caspase 3是一種半胱氨酸蛋白酶,其在細(xì)胞凋亡中起到重要作用。有研究指出,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)在腸道內(nèi)過量生成會(huì)導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞凋亡,Caspase 3表達(dá)隨之增加[11]。另外有研究表示,TNF-α可作為獨(dú)立因子誘使腸道上皮細(xì)胞觸發(fā)凋亡信號(hào)通路引起腸道上皮損傷[12]。在本實(shí)驗(yàn)中,糖尿病組及伴糖尿病牙周炎組較健康對(duì)照組大鼠Caspase 3水平增加,且伴糖尿病牙周炎大鼠增加更明顯,這提示糖尿病及牙周炎二者交互作用使腸道上皮細(xì)胞非正常凋亡。所以我們推測(cè),糖尿病通過糖基化終產(chǎn)物途徑(AGEs-RAGE),激活了NF-κB信號(hào)通路,引發(fā)TNF-α、MMP-9等下游因子表達(dá)增加[13];另一方面,牙周炎導(dǎo)致的牙周菌群失調(diào)也進(jìn)一步促進(jìn)了LPS、TNF-α、MMP-9等的表達(dá)。而LPS、TNF-α的過表達(dá),引發(fā)了腸道上皮內(nèi)細(xì)胞凋亡通路的激活,從而導(dǎo)致Caspase 3等凋亡因子的陽性表達(dá)。

ART是青蒿素的一種倍半萜內(nèi)酯衍生物,因其是青蒿素的水溶性衍生物,在用藥方面具有多種給藥途徑,所以在臨床上應(yīng)用廣泛。已有研究表明,ART具有多種藥理作用,如抗瘧疾[14]、抗炎、抗腫瘤[15]、抗真菌等[16]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)ART具有一定程度的抗瘢痕形成能力[17];ART對(duì)糖尿病大鼠腎臟、心臟等靶器官具有一定的治療作用[18-19]。值得關(guān)注的是,有研究表明ART對(duì)多種細(xì)菌表現(xiàn)出明顯抗菌動(dòng)力學(xué)特征。Li等[20]指出ART可以有效抑制大腸桿菌抗藥性,促進(jìn)β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)大腸桿菌的抑制作用。ART可通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu),抑制肝硬化所致腸道菌群移位并一定程度減輕肝硬化程度[21]。在Kim等[4]的研究中發(fā)現(xiàn),青蒿素及其衍生物對(duì)伴放線聚集桿菌、中間普氏菌等多種牙周致病菌表現(xiàn)出明顯的抗菌活性,分析指出因其可對(duì)牙周炎相關(guān)炎癥因子及牙周炎進(jìn)程產(chǎn)生抑制作用,從而抑制各類牙周致病菌。有研究ART對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn),ART可以通過抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)等通路降低下游產(chǎn)物MMP-9的表達(dá)[22],這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符,表明ART可通過降低MMP-9的表達(dá)從而緩解腸道炎癥。另有研究表明,ART可以通過抑制NF-κB的表達(dá)從而影響下游產(chǎn)物亞硝酸鹽、TNF-α的產(chǎn)生,達(dá)到抑制高血糖環(huán)境所致的慢性炎癥作用[23]。已有研究證實(shí)ART對(duì)1型糖尿病小鼠有確切的治療作用,并可有效抑制胰腺中TNF-α、IL-6等促炎因子的表達(dá)[24]。而在牙周炎的治療中,研究人員亦發(fā)現(xiàn)ART有劑量依賴性地抑制NF-κB誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞及LPS的生成的作用[25-26]。在本次實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)ART對(duì)伴糖尿病牙周炎大鼠腸道組織形態(tài)損傷、炎癥浸潤及上皮細(xì)胞凋亡有明顯抑制作用,腸道組織恢復(fù)情況良好。我們推測(cè),ART可能通過抑制牙周致病菌及抑制腸道內(nèi)革蘭陰性致病菌,調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu),減少內(nèi)毒素產(chǎn)生,從而恢復(fù)腸道屏障,抑制腸道上皮炎癥。另一方面,ART的干預(yù)可能通過抑制PI3K/Akt、NF-κB等通路,減少因糖尿病及牙周炎導(dǎo)致的TNF-α、MMP-9及Caspase 3等因子的過表達(dá),從而達(dá)到改善腸道上皮的破壞。

綜上所述,我們初步發(fā)現(xiàn)伴糖尿病牙周炎對(duì)腸道組織的破壞,糖尿病及牙周炎二者協(xié)同作用,加重腸道上皮炎癥及細(xì)胞凋亡。ART干預(yù)后腸道上皮結(jié)構(gòu)明顯改善,TNF-α、MMP-9及Caspase 3炎癥因子及細(xì)胞凋亡因子顯著下調(diào),提示ART對(duì)伴糖尿病牙周炎腸道損傷有一定治療作用,關(guān)于具體通路上下游因子的研究仍需進(jìn)一步探討??梢赃M(jìn)一步探討ART作為治療伴糖尿病牙周炎的有效藥物與胰島素的對(duì)照研究以及研究二者聯(lián)合應(yīng)用的治療效果及機(jī)制。

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