雷 港，武和明，江 飛

成釉細(xì)胞瘤(ameloblastoma，AM)是一種臨床常見的牙源性良性腫瘤，雖歸屬于良性腫瘤，但呈現(xiàn)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)、易惡變，具有惡性腫瘤的性質(zhì)[1]。約占頜骨腫瘤的14%[2]，在發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率相對(duì)更高[3]。目前臨床上對(duì)于成釉細(xì)胞瘤的治療主要采用手術(shù)切除病變頜骨[1]。由于該病起病癥狀不明顯，進(jìn)展緩慢，往往發(fā)現(xiàn)臨床癥狀時(shí)已造成大范圍頜骨缺損。切除大塊病變頜骨后的重建修復(fù)則成為臨床難題[4]。

對(duì)解決臨床上大塊骨缺損再生的難題，目前已有多種策略，包括自體骨移植、異體骨移植[5]，以及基于組織工程原理的骨再生手段[4]。已有研究表明，血管化骨再生的過(guò)程與缺損區(qū)域中干細(xì)胞的自噬(autophagy)水平密切相關(guān)[6]。自噬是指細(xì)胞內(nèi)有“自己吃自己”的現(xiàn)象，通過(guò)溶酶體降解長(zhǎng)半衰期蛋白及受損細(xì)胞器，將降解產(chǎn)物循環(huán)再利用[7]，從而保持細(xì)胞內(nèi)的能量平衡，抵御缺氧、饑餓、衰老等壓力及降解有害胞質(zhì)成分和入侵的細(xì)菌病毒等[8-11]。自噬作為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)再利用過(guò)程的組成部分，在清除干細(xì)胞自我更新、增殖和分化過(guò)程產(chǎn)生的廢棄蛋白及細(xì)胞器中起到重要作用[12-14]。成釉細(xì)胞瘤是否會(huì)影響成骨相關(guān)干細(xì)胞的自噬水平，如果影響成骨相關(guān)干細(xì)胞的自噬水平，可能直接關(guān)系到切除病變組織后的骨再生效果。本研究通過(guò)收集成釉細(xì)胞瘤患者切除的腫瘤組織，分離成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞(human ameloblastoma-derived cells, hAMCs)[15]，收集hAMCs條件培養(yǎng)液與正常人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone-marrow mesenchymal stromal cells, hBMSCs)共培養(yǎng)，觀察hBMSCs自噬水平和成骨相關(guān)表型，進(jìn)而間接分析成釉細(xì)胞瘤影響骨再生的相關(guān)機(jī)制，為成釉細(xì)胞瘤患者切除病灶術(shù)后的骨再生提供優(yōu)化策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

α-MEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、雙抗(青霉素/鏈霉素)(均購(gòu)自Gibco，美國(guó)) ，CCK-8試劑盒(Dojindo，日本)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(分析純，Ameresco，美國(guó))，堿性磷酸酶染色試劑盒(建成，中國(guó)) ，堿性磷酸酶活力檢測(cè)試劑盒(中生，中國(guó))，茜素紅染色液(Sigma，美國(guó))，RIPA蛋白裂解液(碧云天，中國(guó)廣州)，SDS-PAGE凝膠試劑盒(凱基，中國(guó))，蛋白Marker(Fermentas，美國(guó))，SuperSignal?West Pico化學(xué)發(fā)光底物(Thermo，美國(guó))，細(xì)胞角蛋白18(Cytokeratin，CK-18)、波形蛋白(Vimentin)、E鈣黏蛋白(E-Cadherin)抗體(Bioworld，美國(guó))，核心結(jié)合蛋白因子2 (Runt-related transcription factor 2， RUNX2)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、 成骨轉(zhuǎn)錄因子(Osterix，OSX)、骨涎蛋白(Bone sialoprotein， BSP)、骨鈣素(Osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)、Ⅰ型膠原(Type Ⅰ collagen，Collagen Ⅰ)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈(Microtuble-associated protein light chain 3，LC3b)、自噬相關(guān)蛋白6同源物(Autophagy related 6 homolog， Beclin1)、自噬相關(guān)蛋白5同源物(Autophagy related 5 homolog，ATG5)抗體(Abcam，英國(guó))，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)抗體(Bioworld，美國(guó))，山羊抗兔IgG二抗(中杉金橋，中國(guó))等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 hBMSCs的培養(yǎng) hBMSCs購(gòu)自廣州賽業(yè)生物科技有限公司，細(xì)胞增殖至80%～90%，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，擴(kuò)增培養(yǎng)至P3代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 hAMCs的分離和培養(yǎng) 取成釉細(xì)胞瘤組織，置于4 ℃無(wú)血清α-MEM 培養(yǎng)液(含200 U/mL青霉素及200 μg/mL鏈霉素)中移入超凈臺(tái)。用含有200 U/mL青霉素及200 μg/mL鏈霉素的PBS漂洗3次，每次3 min。將組織剪成1～2 mm3大小后移入含1 g/L Ⅰ型膠原酶的α-MEM 培養(yǎng)液中，37 ℃孵箱內(nèi)消化4 h，每半小時(shí)震蕩15 s。當(dāng)組織塊呈絮狀時(shí)停止消化，1 200 r/min離心5 min，去上清液，加入PBS重懸漂洗3次，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×106個(gè)細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入含10% FBS的α-MEM完全培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，每2～3 d換液。細(xì)胞增殖至80%～90%消化傳代，P1及P2代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 成釉細(xì)胞瘤條件培養(yǎng)液(hAMC-CM)制備 待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%后，每天換液置換出來(lái)的培養(yǎng)液以3 000 r/min離心15 min，收集上清，用孔徑為0.22 μm的小濾器過(guò)濾，加入等量的含10% FBS的α-MEM完全培養(yǎng)基制成條件培養(yǎng)液(hAMC-CM)備用。

1.2.4 CCK-8檢測(cè) 制備hBMSCs單細(xì)胞懸液以1 000個(gè)/孔接種于96孔板中,細(xì)胞貼壁后用無(wú)血清α-MEM培養(yǎng)液饑餓處理24 h后換用α-MEM完全培養(yǎng)基及hAMC-CM條件培養(yǎng)基培養(yǎng)(每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔)，隔天換液，連續(xù)培養(yǎng)1、3、5、7、9 d。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，根據(jù)CCK-8試劑盒操作步驟檢測(cè)各組樣品的吸光度值(450 nm波長(zhǎng))。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 堿性磷酸酶活性檢測(cè)和染色 將hBMSCs制備成單細(xì)胞懸液以1×104個(gè)/孔接種24孔板中，待細(xì)胞貼壁后更換無(wú)血清α-MEM培養(yǎng)液饑餓處理24 h，換α-MEM完全培養(yǎng)基及hAMC-CM條件培養(yǎng)基培養(yǎng)(每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔)，隔天換液，3、5 d后依據(jù)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行堿性磷酸酶活性檢測(cè)及染色。

1.2.6 茜素紅染色 將hBMSCs制備成單細(xì)胞懸液以5×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度加在12孔板中待細(xì)胞貼壁后換無(wú)血清培養(yǎng)基，饑餓處理24 h后分別加入α-MEM完全培養(yǎng)基和hAMC-CM條件培養(yǎng)基配置的成骨誘導(dǎo)液(每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔)，隔天換液，連續(xù)培養(yǎng)2周后按照染色試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行染色。掃描儀記錄染色結(jié)果后用10%氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液溶解染色結(jié)節(jié)，檢測(cè)各組吸光度值(560 nm波長(zhǎng))，記錄并作統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7 Western blot檢測(cè) 用RIPA蛋白裂解液及細(xì)胞刮棒收集培養(yǎng)7 d的P0和P2代hAMCs細(xì)胞蛋白，利用Western blot方法檢測(cè)上皮組織或間充質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白CK-18、Vimentin以及E-Cadherin的表達(dá)量，用以鑒定不同代數(shù)培養(yǎng)的hAMCs的細(xì)胞來(lái)源。收集在成骨誘導(dǎo)過(guò)程中用α-MEM完全培養(yǎng)基和hAMC-CM條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的hBMSCs細(xì)胞蛋白，用Western blot方法檢測(cè)成骨分化相關(guān)蛋白ALP、RUNX2、OSX、BSP、OPN、OCN以及Collagen Ⅰ的表達(dá)情況，用以檢測(cè)條件培養(yǎng)液對(duì)成骨作用的影響。類似的，收集不同培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的hBMSCs細(xì)胞蛋白，用Western blot方法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白ATG5、Beclin1以及LC3b的表達(dá)，用以分析條件培養(yǎng)液對(duì)hBMSCs成骨分化過(guò)程中自噬行為的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。Image J分析各組條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hAMCs的培養(yǎng)鑒定及擴(kuò)增

通過(guò)組織塊結(jié)合Ⅰ型膠原酶消化法獲得混合生長(zhǎng)的hAMCs，其中可以觀察到能相互共存的呈上皮樣生長(zhǎng)的細(xì)胞群體以及呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)的細(xì)胞群體，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的持續(xù)，這些細(xì)胞群體可以持續(xù)增殖并融合(圖1A)。原代培養(yǎng)的hAMCs中上皮樣細(xì)胞(epithelial cell-like hAMCs, E-hAMCs)占據(jù)較多的生長(zhǎng)空間而通過(guò)傳代培養(yǎng)后細(xì)胞的上皮樣群體逐漸萎縮，成纖維細(xì)胞樣群體(mesenchymal cell-like hAMCs, M-hAMCs)逐漸占據(jù)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，但均可發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞的存在。通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)P0代和P2代細(xì)胞均可表達(dá)上皮和間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，但在P0代hAMCs中上皮細(xì)胞來(lái)源的標(biāo)志蛋白CK-18和E-Cadherin表達(dá)強(qiáng)度強(qiáng)于P2代hAMCs，而間充質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的標(biāo)志蛋白Vimentin的表達(dá)卻弱于P2代hAMCs(圖1B)，這與我們細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中觀察到的現(xiàn)象一致。

A：原代培養(yǎng)的成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞包括上皮樣及成纖維樣細(xì)胞群落；B：P0和P2代成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞的來(lái)源鑒定；C：hAMC-CM培養(yǎng)hBMSCs后的細(xì)胞形態(tài)照片；D：CCK-8檢測(cè)hBMSCs增殖曲線

2.2 hAMC-CM對(duì)hBMSCs形態(tài)及增殖的影響

加入hAMC-CM的hBMSCs細(xì)胞形態(tài)與常規(guī)α-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的hBMSCs細(xì)胞形體沒(méi)有區(qū)別，均呈梭形漩渦狀生長(zhǎng)且生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖1C)。通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hAMC-CM及α-MEM培養(yǎng)的hAMCs在前2 d均增殖稍慢，第3天進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，第7 天左右增殖放緩進(jìn)入平臺(tái)期，整體生長(zhǎng)曲線近“S”型，各時(shí)間點(diǎn)增殖指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說(shuō)明hAMC-CM對(duì)hBMSCs的增殖狀態(tài)沒(méi)有影響(圖1D)。

2.3 hAMCs-CM對(duì)hBMSCs早期成骨能力的影響

hAMCs-CM及α-MEM培養(yǎng)基配制的成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)hBMSCs 5 d后，固定細(xì)胞ALP染色發(fā)現(xiàn)加入hAMC-CM后hBMSCs的ALP染色強(qiáng)度較α-MEM單純培養(yǎng)組弱(圖2A)。而分別培養(yǎng)3、5 d后，ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示單純培養(yǎng)組明顯高于條件培養(yǎng)液組，且培養(yǎng)5 d的ALP活性高于3 d組，各組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖2B)。通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)成骨早期的轉(zhuǎn)錄因子蛋白R(shí)UNX2、OSX以及成骨蛋白ALP在加入hAMC-CM后表達(dá)均有不同程度的下調(diào)，灰度值分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)(圖2)。

A：hAMC-CM培養(yǎng)hBMSCs 5 d后的堿性磷酸酶染色結(jié)果；B：hAMC-CM培養(yǎng)hBMSCs 3、5 d后的堿性磷酸酶活性檢測(cè)結(jié)果；C：hAMC-CM培養(yǎng)hBMSCs 7 d后RUNX2、ALP及OSX的表達(dá)情況；D：圖C蛋白條帶的灰度值分析；*：P<0.05,**:P<0.01

2.4 hAMC-CM對(duì)hBMSCs晚期成骨能力的影響

兩種培養(yǎng)液配置的成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)hBMSCs 14 d后進(jìn)行茜素紅染色，結(jié)果顯示α-MEM培養(yǎng)液組著色程度及范圍明顯強(qiáng)于hAMC-CM培養(yǎng)液組(圖3A)，利用10% CPC溶液溶解經(jīng)茜素紅染色后的鈣化結(jié)節(jié)，然后進(jìn)行相應(yīng)的定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)α-MEM培養(yǎng)液組鈣離子濃度顯著高于條件培養(yǎng)液組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3A)。通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)成骨晚期的相關(guān)蛋白BSP、OPN、OCN以及Collagen Ⅰ的表達(dá)在加入hAMC-CM后均有不同程度的下調(diào)，灰度值分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01或P<0.05)(圖3)。

A：不同培養(yǎng)液培養(yǎng)hBMSCs 14 d后的茜素紅染色結(jié)果；B：茜素紅染色結(jié)果的鈣離子含量分析；C：不同培養(yǎng)液培養(yǎng)hBMSCs 7 d后BSP、OPN、OCN及Collagen Ⅰ的表達(dá)情況；D：圖C蛋白條帶的灰度值分析；*：P<0.05,**:P<0.01

2.5 hAMC-CM對(duì)hBMSCs自噬活性的影響

hAMC-CM培養(yǎng)hBMSCs 7 d后通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白ATG5、Beclin1和LC3b的表達(dá)較正常培養(yǎng)組均有明顯下調(diào)，灰度值分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖4)。說(shuō)明加入了成釉細(xì)胞條件培養(yǎng)液后hBMSCs的自噬活性受到了抑制。

A：hAMC-CM培養(yǎng)hBMSCs 7 d后ATG5、Beclin1及LC3b的表達(dá)情況；B：自噬相關(guān)蛋白ATG5、Beclin1及LC3b的灰度值分析；**:P<0.01

3 討 論

本研究根據(jù)文獻(xiàn)所報(bào)道的方法[15]分離提取的分離成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞(hAMCs)呈現(xiàn)兩種主要的細(xì)胞形態(tài)，即內(nèi)皮細(xì)胞樣成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞(epithelial cell-like hAMCs, E-hAMCs)和間充質(zhì)樣成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞(mesenchymal cell-like hAMCs， M-hAMCs)，符合成釉細(xì)胞瘤公認(rèn)的組織病理結(jié)構(gòu)中存在上皮成分和纖維成分的特征，通過(guò)Western blot對(duì)所提取的hAMCs的標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證，其也與成釉細(xì)胞瘤研究的相關(guān)文獻(xiàn)中所提取的hAMCs特征相一致[15-16]。然而，本研究中所獲得的hAMCs在原代培養(yǎng)傳代后出現(xiàn)增殖緩慢，到P2代時(shí)逐漸呈現(xiàn)停止增殖并凋亡的趨勢(shì)。因此本研究中所收集的hAMCs條件培養(yǎng)液(hAMC-CM)為生長(zhǎng)增殖狀態(tài)基本正常的P2代之前的細(xì)胞條件培養(yǎng)液(收集時(shí)經(jīng)過(guò)0.22 μm過(guò)濾)。

為研究hAMCs對(duì)骨再生的影響，本研究選擇標(biāo)準(zhǔn)提取流程所獲得的hBMSCs作為細(xì)胞模型進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。首先驗(yàn)證hAMC-CM的毒性作用，通過(guò)CCK-8驗(yàn)證hBMSCs在hAMC-CM中的增殖情況，結(jié)果顯示，細(xì)胞的形態(tài)和增殖情況與對(duì)照組(α-MEM)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此我們可以判定后續(xù)用hAMC-CM培養(yǎng)的hBMSCs在成骨表型中的所呈現(xiàn)的與對(duì)照的差異并非來(lái)自hAMC-CM的毒性。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中對(duì)hBMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，并選取成骨誘導(dǎo)早期、晚期的特征性實(shí)驗(yàn)和相關(guān)蛋白水平的標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證[17]。在成骨誘導(dǎo)液中摻入hAMC-CM后，hBMSCs的ALP活性明顯受到抑制，成骨早期的標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄因子RUNX2、OSX以及胞內(nèi)ALP表達(dá)顯著下降。RUNX2和OSX同為成骨相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，是干細(xì)胞成骨分化調(diào)控的重要因子，抑制其表達(dá)會(huì)直接抑制細(xì)胞成骨分化[18]。而ALP是成骨細(xì)胞表面標(biāo)志物之一，直接反映成骨細(xì)胞的活性或功能狀況[19]，ALP表達(dá)降低、活性降低都反映出成骨細(xì)胞礦化障礙。經(jīng)過(guò)14 d的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，hAMC-CM對(duì)hBMSCs成骨分化呈現(xiàn)持續(xù)性的抑制，hBMSCs所形成的礦化結(jié)節(jié)明顯少于對(duì)照組。成骨表型相關(guān)的標(biāo)志物OCN、BSP、Collagen Ⅰ[17]也都呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)。腫瘤組織會(huì)侵蝕破壞正常頜骨，造成骨質(zhì)破壞。而另一方面，由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，成釉細(xì)胞瘤還會(huì)對(duì)正常的骨髓干細(xì)胞的成骨分化進(jìn)行抑制，進(jìn)而使機(jī)體失去自我修復(fù)的能力，間接加重頜骨病變。

已有大量報(bào)道發(fā)現(xiàn)hBMSCs的成骨分化過(guò)程存在自噬現(xiàn)象[20-21]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證hAMCs分析對(duì)hBMSCs成骨抑制的作用機(jī)制，我們驗(yàn)證了hAMC-CM是否會(huì)抑制hBMSCs的自噬水平。結(jié)果顯示hAMC-CM顯著抑制了hBMSCs中自噬相關(guān)標(biāo)志物Beclin1、ATG5和LC3b的表達(dá)。Beclin 是自噬過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)分子[22]，Beclin1主要通過(guò)與PI3K形成復(fù)合體來(lái)調(diào)節(jié)ATG蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中定位，調(diào)節(jié)自噬活性[23]。ATG5則是自噬形成的標(biāo)志，其表達(dá)量可在某種程度上反應(yīng)細(xì)胞自噬活性[24]。LC3是自噬泡膜的通用標(biāo)記物，主要有兩種存在形式：LC3a(胞質(zhì)型)及LC3b(膜型)[25]。LC3a轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3b表示自噬體形成，因此LC3b常被作為自噬體形成的分子標(biāo)志。結(jié)果表明：成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞在抑制hBMSCs成骨分化的同時(shí)還可以抑制hBMSCs自噬，阻礙干細(xì)胞的自我循環(huán)利用，間接影響骨髓干細(xì)胞對(duì)頜骨病損的修復(fù)進(jìn)程。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)分離hAMCs，所收集hAMC-CM可抑制hBMSCs成骨分化，且這一抑制作用與hBMSCs的自噬水平降低密切相關(guān)。說(shuō)明成釉細(xì)胞瘤組織侵蝕正常頜骨組織的同時(shí)，間接抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨再生的能力。這一研究結(jié)論的意義在于，手術(shù)切除成釉細(xì)胞瘤后，可通過(guò)調(diào)節(jié)缺損處腫瘤微環(huán)境中骨髓干細(xì)胞的自噬水平促進(jìn)機(jī)體內(nèi)源性骨再生，為成釉細(xì)胞瘤術(shù)后骨再生提供補(bǔ)充治療策略。