許藝元，李志剛，王巧俠，秦萍萍，劉瀟瀟

(北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

抑郁癥是一種長時間的持久性情緒低落，伴失眠焦慮甚至出現(xiàn)自殺傾向的精神疾患[1]。目前對抑郁癥的研究仍停留在假說階段，其中神經(jīng)營養(yǎng)因子假說和神經(jīng)遞質(zhì)假說和基因轉(zhuǎn)錄假說占有重要地位[2]。慢性應(yīng)激是誘導抑郁發(fā)生的主要原因，而海馬作為應(yīng)激遞質(zhì)分泌的靶區(qū)域，是參與應(yīng)激反應(yīng)的最重要腦區(qū)之一[3]。本實驗選取大鼠海馬內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)及5-羥色胺(5- hydroxy tryptamine，5-TH)作為研究指標，通過建立抑郁模型，觀測電針前后大鼠的行為學變化以及海馬內(nèi)BDNF、5-TH的影響，從而探索電針對抑郁癥的治療機制及影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 免疫組化相關(guān)試劑與儀器 無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司);二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司);EDTA抗原修復(fù)液(武漢博士德生物工程有限公司);雙氧水(國藥集團化學試劑有限公司);牛血清白蛋白V(北京索萊寶生物公司);PBS(武漢博士德生物工程有限公司);DAB顯色劑(武漢博士德生物工程有限公司);BDNF一抗(ab108319，美國abcam公司);5-HT一抗(ab66047，美國abcam公司);脫水機(JT-12S，武漢俊杰電子有限公司);包埋機(JB-P7，武漢俊杰電子有限公司);病理切片機(RM2235，德國徠卡);凍臺(JB-L7，武漢俊杰電子有限公司);烤片機(DB-B2，常州國華電器有限公司);烤箱[101-1BS，邦西儀器科技(上海)有限公司];搖床(SK-R1807-E，美國賽洛捷克);混勻儀(MX-S，美國賽洛捷克);倒置顯微鏡(Nikon Ci-S，日本尼康);成像系統(tǒng)(Nikon DS-U3，日本尼康)。

1.1.2 ELISA相關(guān)試劑與儀器 大鼠BDNF ELISA 檢測試劑盒(MB-1750A，江蘇酶標生物);5-HT ELISA檢測試劑盒(MB-1983A，江蘇酶標生物);超凈臺(SW-CJ-2，江蘇蘇州); 微量加樣器(Refe-rence，德國 eppendorf);微量振蕩器(MH-2，上海楚柏);烘箱(Venticell，德國MMM);酶標儀(EXL800，美國Bio-Tek)。

1.2 實驗動物

SPF級健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠32只，體質(zhì)量300～350 g，實驗環(huán)境相對室溫(23±1)℃，相對濕度(50±5)%，自然晝夜節(jié)律光照，標準飼料，自由飲水攝食，12 h白天-黑夜循環(huán)飼養(yǎng)。

1.3 模型建立

采用慢性不可預(yù)知應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng)的方式，防止大鼠對一種或多種規(guī)律的應(yīng)激刺激產(chǎn)生耐受性。正常組采取群養(yǎng)，其他各組采取孤養(yǎng)，并進行21 d每天隨機8種不同的應(yīng)激刺激，包括4℃冷水游泳5 min、晝夜顛倒24 h、禁食24 h、禁水24 h、夾尾3 min、水平搖晃30 min、籠位傾斜45° 24 h和潮濕環(huán)境24 h等刺激，平均每種刺激3次。

1.4 動物分組

清潔、健康級雄性SD大鼠32只根據(jù)隨機數(shù)字表法隨機分為4組：正常對照組、模型組、電針組和藥物組，每組各8只。

1.5 各組飼養(yǎng)及干預(yù)方法

1.5.1 正常組 群養(yǎng)，正常飼養(yǎng)，不接受任何刺激。

1.5.2 模型組 孤養(yǎng)，接受慢性應(yīng)激處理21 d，不給予任何治療性刺激及抗抑郁劑。

1.5.3 電針組 孤養(yǎng)，接受慢性應(yīng)激處理21 d。每日于應(yīng)激刺激1 h后將大鼠置于自制鼠套(前半部透明網(wǎng)紗，后半部黑色)內(nèi)進行電針治療。電針治療方法：治療采用一次性針灸針(0.30 mm×25 mm，華佗牌，蘇州針灸器械廠)進行針刺，穴位選用百會穴(GV20)、印堂穴(GV29)與雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴(PC6)，穴位定位參照全國針灸學會實驗針灸研究會制定的《實驗動物針灸穴位圖譜》。針刺GV20時，針尖朝向大鼠后頭部斜刺2 mm，針刺GV29針尖向鼻尖方向斜刺5 mm ，實驗中為避免因兩針位置太近針柄相接而短路，于兩針柄間放置消毒脫脂棉球。針刺完成后分別于雙側(cè)PC6間、GV20與GV29間接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，電針頻率2/100 Hz，電流強度為1 mA，以動物肢體微顫為度，每次治療持續(xù)20 min。

1.5.4 藥物組 孤養(yǎng)，接受慢性應(yīng)激處理21 d，每日于應(yīng)激刺激1 h后予百優(yōu)解灌胃(劑量：2 mg/kg，1次/d，生理鹽水1 mL稀釋)。

1.6 高架十字迷宮測試

大鼠每組8只，21 d造模后做行為學檢測。自制高架十字迷宮(High plus maze，HPM)：由兩條相對開放臂(50 cm×10 cm)和兩條相對閉合臂(50 cm×10 cm，臂兩側(cè)有40 cm高擋板)及中央?yún)^(qū)(10 cm×10 cm)連接而成，離地高70 cm。將大鼠放入十字迷宮的中央格，保持向閉合臂，記錄5 min內(nèi)大鼠的活動情況。觀察大鼠進入開放臂的次數(shù)以及在開放臂的停留時間、閉合臂的進入次數(shù)及閉合臂停留時間；計算比較各組大鼠在開放臂的停留時間及進入次數(shù)的百分比。開放臂停留時間百分比為大鼠在開放臂停留時間與在開放臂和閉合臂停留的總時長之比；開放臂進入次數(shù)比為大鼠進入開放臂次數(shù)與進入開放臂和閉合臂的總次數(shù)之比。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法檢測

高十字架迷宮測試后，在各組大鼠中隨機抽取6只，10%水合氯醛富強麻醉。腹主動脈采血，室溫靜止1～2 h，4200 rmp離心10 min，取上清，-80℃保存，備用。按照檢測BDNF及5-TH 的 ELISA 試劑盒說明書進行操作，于波長450 nm酶標儀上讀值，以O(shè)D值為橫坐標，縱坐標為樣品濃度，以此繪制出標準曲線。并根據(jù)血清樣品的OD值，在標準曲線上查出其對應(yīng)的濃度。

1.8 免疫組織化學檢測

各組動物快速斷頭取腦，去除顱骨，充分暴露腦組織，快速剝離海馬組織，放入4%多聚甲醛液中固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋和熱修復(fù)，免疫組化備用。BDNF及5-TH的測定采用免疫組化SP法。具體步驟按照試劑盒說明書進行操作，每張切片隨機選擇3個視野，之后計算每高倍鏡(200×)下積分光密度值(Integral optical density，IOD)。BDNF的陽性反應(yīng)產(chǎn)物主要集中在胞質(zhì)及核膜周圍區(qū)域，呈棕黃色絲狀物；5-TH則主要在神經(jīng)元包質(zhì)包膜著色，呈黃褐色。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 高架十字迷宮實驗結(jié)果

高架十字迷宮是國際上公認的經(jīng)典測量焦慮反應(yīng)的方法，大鼠進入開放臂次數(shù)及在開放臂的停留時間與其焦慮情緒成負相關(guān)[4]。如表1所示，與正常組相比，模型組大鼠進入開放臂次數(shù)比及處于開放臂時間比明顯降低，組間相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；模型組大鼠焦慮行為明顯強于正常組，提示抑郁模型造模成功。與模型組相比，藥物組和電針組進入開放臂次數(shù)比及時間比明顯升高，組間相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明用電針、藥物進行干預(yù)后，大鼠的焦慮癥狀明顯改善。與藥物組相比，電針組大鼠進入開放臂次數(shù)比更高，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明電針在改善大鼠抑郁焦慮行為癥狀時，一定程度上優(yōu)于藥物組。

表1 高架十字迷宮中行為學檢測結(jié)果

2.2 電針對外周血與海馬中BDNF和5-TH含量的影響

ELISA結(jié)果顯示，模型組外周血中BDNF、5-HT含量明顯低于正常組，組間相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。藥物組和電針組BDNF、5-HT含量明顯高于模型組，組間相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

免疫組化結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組海馬BDNF、5-HT表達明顯降低，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，藥物組和電針組BDNF、5-TH表達均明顯升高，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與藥物組相比，電針組中BDNF與5-HT的表達都稍高，一定程度表明電針對于抑郁模型大鼠的治療效果更加顯著。見表3、圖1和圖2。

表2 各組大鼠外周血清中BDNF與5-HT含量結(jié)果

表3 各組大鼠海馬中BDNF與5-HT表達結(jié)果

圖1 各組大鼠海馬組織BDNF表達(免疫組化，200×)

圖2 各組大鼠海馬組織5-TH表達(免疫組化，200×)

3 討論

抑郁癥在中醫(yī)學中與“郁證”“梅核氣”“癲證”“臟躁”等病癥相關(guān)。其作為一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，作用機制較為復(fù)雜，且臨床藥物治療也面臨著副作用大等問題。多名學者研究顯示：針刺治療抑郁癥具有實施方便、適用患者群體廣泛、副作用小、安全度高與成本低等優(yōu)勢[5-9]。本實驗選取電針療法以增強毫針針刺的刺激量并最大限度地減小由施針者不同或同一施針者不同情態(tài)下施針而造成的誤差。其基于針灸的經(jīng)絡(luò)腧穴理論，從整體上疏通經(jīng)絡(luò)，促進氣血運行，以促進患者自身陰陽平衡，從而治愈抑郁癥導致的一系列癥狀；且電針治療在改善抑郁患者生理癥狀的同時，注重調(diào)整其內(nèi)在精神情緒狀態(tài)，達到雙管齊下的目的。

BDNF廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，作為神經(jīng)營養(yǎng)因子假說中的重要研究成分，可調(diào)節(jié)神經(jīng)功能及可塑性，尤其是對海馬的神經(jīng)發(fā)生具有極其重要的促進作用[10]。Taliaz D等[11]學者認為 BDNF 的減少可使海馬體積縮小，海馬內(nèi)神經(jīng)元及周圍膠質(zhì)細胞減少。

5-TH主要分布在中腦中縫核群，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)分泌的重要神經(jīng)遞質(zhì)，參與神經(jīng)元的分化與再生[12]。Ferraro G等[13]學者認為，反復(fù)持續(xù)應(yīng)激刺激可引起海馬結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，造成海馬神經(jīng)元的缺失，抑制中縫核內(nèi)5-TH、DA等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，出現(xiàn)抑郁癥狀。

通過本實驗，發(fā)現(xiàn)抑郁癥發(fā)病與治療過程中大鼠海馬與外周血清當中BDNF與5-HT的含量變化一致，且無明顯變化幅度的差異，據(jù)此可以猜測BDNF與5-TH兩個途徑具有某種相關(guān)性。

電針可對BDNF及5-TH兩個系統(tǒng)均產(chǎn)生良性干預(yù)，由此可印證電針對抑郁癥具有多層次、多靶點的綜合調(diào)節(jié)作用，且因其具有良好的耐受性、安全性等特點，為抑郁癥的臨床治療方案提供了新的選擇。今后筆者將繼續(xù)探索BDNF與5-HT兩條通路的具體聯(lián)系以及電針對抑郁大鼠模型的時效性。