張晨新,曲 怡,王建波,張立德

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥創(chuàng)新工程技術(shù)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110847)

作為心腦血管疾病中發(fā)病率及死亡率極高的病種，原發(fā)性高血壓在臨床上的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)，因高血壓引起的心、腦和腎的靶器官損傷已經(jīng)成為威脅正常人體健康的重要因素之一[1]。血壓的異常增高而導(dǎo)致的微血管損傷是高血壓靶器官主要發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)，血管內(nèi)皮損傷是高血壓疾病的主要研究熱點(diǎn)[2]，尋找能逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮功能的治療方式對(duì)于逆轉(zhuǎn)高血壓靶器官損傷有著重要意義。既往對(duì)Ghrelin研究均集中于調(diào)節(jié)胃腸激素分泌、增強(qiáng)胃黏膜防御、調(diào)節(jié)胃動(dòng)力功能和增強(qiáng)胃運(yùn)動(dòng)活動(dòng)等方面[3-5]，然而Ghrelin對(duì)于血管內(nèi)皮的保護(hù)作用鮮有報(bào)道。最新研究表明Ghrelin與血壓密切相關(guān)，GHSR在心臟、腎臟和血管中的高表達(dá)為Ghrelin在血壓調(diào)節(jié)提供了證據(jù)，Ghrelin濃度與血壓呈負(fù)相關(guān)[6]。因此，調(diào)節(jié)Ghrelin濃度對(duì)保護(hù)高血壓內(nèi)皮功能具有重要的意義。

足三里具有顯著降壓效果，臨床Meta分析文獻(xiàn)證實(shí)，常用降壓穴位中，足三里的使用頻次高達(dá)30.6%[7]。中醫(yī)將高血壓歸屬為“眩暈”“頭痛”“不寐”等范疇，其針刺治療依據(jù)中醫(yī)辨證論治選穴配方。足三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)穴位，陽(yáng)明經(jīng)屬多氣多血之經(jīng)，而足三里作為“合穴”“合主逆氣而泄”，針刺足三里具有“泄氣血”之功。因此，在臨床采用針灸治療高血壓配穴時(shí)，常選用該穴，并達(dá)到了良好的治療效果。本實(shí)驗(yàn)擬從胃動(dòng)力密切相關(guān)Ghrelin入手探討針刺足三里調(diào)節(jié)Ghrelin保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，部分闡釋了足三里“泄”的機(jī)理，為臨床針刺降壓提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。對(duì)豐富中醫(yī)內(nèi)涵、拓寬臨床醫(yī)生診療思維具有重要意義。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SHR大鼠30只、WKY大鼠10只，大鼠體質(zhì)量在(200±10 g)左右[許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0011]。動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。本實(shí)驗(yàn)在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格按照無(wú)菌操作標(biāo)準(zhǔn)，保障大鼠SPF級(jí)生存環(huán)境。

1.2 主要儀器

華佗牌針灸針(0.25 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；ABI Veriti梯度PCR儀(Applied Biosystems)；超微量紫外分光光度計(jì)(Thermo，nano-drop 2000)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System)；SpectraMax i3多功能酶標(biāo)儀(奧地利)；VE-386半干轉(zhuǎn)移電泳槽(上海天能)；EPS-600電泳儀(上海天能)；VE-180垂直電泳槽(上海天能)；數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(上海天能)。

1.3 主要試劑

ET-1 E1isa試劑盒(Bejing Cheng Lin Biological Technology Co.，Lot.201905)；Ghrelin E1isa試劑盒(Bejing Cheng Lin Biological Technology Co.，Lot.201905)；PCR反轉(zhuǎn)試劑盒(康為世紀(jì)，Lot 40326)；PCR擴(kuò)增試劑盒(康為世紀(jì)，Lot 60407)；Trizol總RNA抽提試劑(Beyotime，Lot R0061)；PCR引物(博邁德引物合成公司)；DEPC水配制，0.2mL DEPC與200 mL超純水混合，分裝后過(guò)夜，高壓滅菌；RIPA組織/細(xì)胞裂解液(Solarbio，Lot.No.20190418)；PMSF(Solarbio，Lot.No.20190505)；PVDF膜(Membrane，Lot.K5EA7920A)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Beyotime Lot No.P0012S)；SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒(Beyotime，Cat No.P0012AC)；5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(凱基生物，Lot No.051319190513)；Marker(凱基生物，Lot.20171113)；β-actin Mouse Monoclonal Antibody(Absci，Lot.5814)；GHS-R1 antibody(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，Lot.L0214)；eN0S Mouse Monoclonal Antibody(Abcam，Lot.4023); HRP*Goat Anti-Mouse IgG(Immuno Way，Catalog No:RS0001)；HRP*Goat Anti -Rabbit IgG(ImmunoWay，Catalog No:RS0002)；HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(E030120-01)；ECL (Beyotime，Lot:P0018S)；引物合成(北京博邁德基因技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 分組和造模

選用雄性SHR大鼠30只，隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(10只)、針刺組(10只)和非經(jīng)非穴組(10只)，WKY大鼠(10只)作為空白組。SHR大鼠收縮壓均>150 mmHg。

2.2 取穴與針刺方法

針刺組選取大鼠雙側(cè)足三里穴(穴位定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》)進(jìn)行針刺治療[8-9]，用0.25 mm×13 mm毫針針刺“足三里”穴，穴位位于大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)外側(cè)、腓骨小頭下3.5 mm處；非經(jīng)非穴組針刺鼠尾作為非經(jīng)非穴點(diǎn)，以毫針直刺5 mm即可。針刺療程共7 d。

2.3 取材

大鼠在針刺結(jié)束后，禁食24 h，禁食期間自由飲水，然后進(jìn)行取材工作。按照大鼠體質(zhì)量注射10%水合氯醛麻醉，麻醉劑量為0.3 mL/100 g。大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，離心取血清，將血清置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。取血結(jié)束后，剔出胸主動(dòng)脈組織于無(wú)菌EP管中，凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.4.1 熒光定量PCR檢測(cè)GHSR、eNOS mRNA表達(dá) 取大鼠主動(dòng)脈組織100 mg，用Trizol法萃取提取mRNA。經(jīng)過(guò)濃度與純度測(cè)定后，調(diào)整mRNA濃度進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將mRNA反轉(zhuǎn)為cDNA并用ROX熒光體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)總體系為20 μL(擴(kuò)增條件：95 ℃，5 s；60 ℃，34 s；40個(gè)循環(huán))。擴(kuò)增使用PCR引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

2.4.2 使用Elisa法檢測(cè)ET-1、Ghrelin濃度 取主動(dòng)脈組織100 mg，加入1 mL PBS與研磨珠進(jìn)行勻漿(3 000 r，15 min)。離心后收取上清液。在96孔板上設(shè)置好空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔以及待測(cè)樣品孔。不同孔分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品以及待測(cè)樣品各50 μL；每孔加入50 μL酶標(biāo)試劑，封口孵育30 min；洗滌后加入顯色劑A，B各50 μL，封口封口孵育30 min；加入終止液50 μL，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD值(450 nm波長(zhǎng))；用標(biāo)準(zhǔn)孔數(shù)值繪制y=ax+b回歸線，用公式計(jì)算主動(dòng)脈ET-1、Ghrelin濃度。

2.4.3 Western Blot檢測(cè)不同組別大鼠主動(dòng)脈eNOS、GHSR蛋白表達(dá) 取胸主動(dòng)脈組織100 mg，加入1 mL RIPA裂解液進(jìn)行勻漿，離心取上清液。用BCA法測(cè)定上清液中總蛋白濃度并進(jìn)行濃度調(diào)整。配置凝膠進(jìn)行電泳，每孔上樣50 μg進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到0.22的PVDF膜上。封閉37 ℃，1 h；加入一抗，4 ℃過(guò)夜；TBST清洗；加入二抗，37 ℃ 1 h；TBST清洗。加入ECL發(fā)光液，在數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。分析條帶灰度值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間分析使用單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)分析方法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同組別大鼠主動(dòng)脈組織GHSR、eNOSmRNA表達(dá)比較

由表2、圖1可知，與空白組比較，模型組和非經(jīng)非穴組大鼠主動(dòng)脈組織GHSR、eNOS mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；與模型組相比，針刺組大鼠主動(dòng)脈組織GHSR、eNOS mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，非經(jīng)非穴組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 不同組別大鼠胸主動(dòng)脈GHSR、eNOS mRNA表達(dá)變化比較

圖1 不同組別大鼠胸主動(dòng)脈GHSR、eNOS mRNA溶解與擴(kuò)增曲線

3.2 不同組別大鼠血清ET-1、Ghrelin表達(dá)

由表3可見(jiàn)，模型組、針刺組和非經(jīng)非穴組大鼠主動(dòng)脈組織ET-1、Ghrelin含量與空白組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；針刺組主動(dòng)脈組織ET-1、Ghrelin含量與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。非經(jīng)非穴組主動(dòng)脈組織ET-1、Ghrelin含量與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 不同組別大鼠血清ET-1、Ghrelin表達(dá)變化比較

3.3 不同組別大鼠胸主動(dòng)脈eNOS、GHSR表達(dá)

各組大鼠主動(dòng)脈組織的蛋白表達(dá)比較由圖2、表4可知，與空白組相比，模型組和非經(jīng)非穴組大鼠主動(dòng)脈組織eNOS、GHSR蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；與模型組相比，針刺組大鼠主動(dòng)脈組織eNOS、GHSR蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，非經(jīng)非穴組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 不同組別大鼠胸主動(dòng)脈eNOS、GHSR灰度值變化

圖2 不同組別大鼠胸主動(dòng)脈eNOS、GHSR表達(dá)

4 討論

原發(fā)性高血壓是由于遺傳、環(huán)境等多種因素相互作用，導(dǎo)致體循環(huán)動(dòng)脈壓增高的一種疾病[10]。在高血壓的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，可以造成心、腦、腎和循環(huán)系統(tǒng)等器官的損害，且高血壓是最常見(jiàn)的心血管疾病之一。目前研究表明,高血壓發(fā)病的主要原因是全身細(xì)小動(dòng)脈的持續(xù)性痙攣硬化，導(dǎo)致全身循環(huán)阻力增加，從而引起血壓上升,而心血管疾病的一個(gè)早期病理改變即為血管內(nèi)皮功能受損[11]，原發(fā)性高血壓發(fā)病的重要機(jī)制之一就是血管內(nèi)皮功能障礙。主動(dòng)脈內(nèi)皮屬于血液與血管平滑肌之間的一層屏障，能夠有效地抵抗炎癥物質(zhì)入侵，阻礙脂質(zhì)物質(zhì)沉淀，另外內(nèi)皮還可以釋放NO維持血管舒縮功能的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)高血壓病內(nèi)皮功能受到損害，內(nèi)皮完整性受到破壞的時(shí)候，會(huì)引起心血管重塑和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為誘發(fā)許多心腦血管疾病的共同環(huán)節(jié)是由內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷與功能紊亂導(dǎo)致。血管內(nèi)皮功能的重要性使其成為心血管疾病的1個(gè)基本靶點(diǎn)和調(diào)節(jié)點(diǎn)，血液的流動(dòng)性和抗血栓形成功能依賴于內(nèi)皮功能的完整性。內(nèi)皮釋放的體液因子可以控制纖維蛋白溶解和血栓形成、血小板激活和抑制、血管舒張和收縮，內(nèi)皮細(xì)胞釋放的縮血管物質(zhì)主要有ET-1、血栓素A2(TXA2)和血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)，NO、前列環(huán)素(PGI2)是內(nèi)皮細(xì)胞主要釋放的擴(kuò)血管物質(zhì)。這些血管活性物質(zhì)的水平直接反映了內(nèi)皮功能是否正常。

Ghrelin是一種主要由胃和小腸產(chǎn)生的含28個(gè)氨基酸的多肽[12]，是生長(zhǎng)激素分泌激素受體(GHSR)的內(nèi)源性配體，GHSR在心臟、腎臟和血管中均有表達(dá)[13]，Ghrelin主要是由X/A樣細(xì)胞產(chǎn)生，通過(guò)旁分泌的方式進(jìn)入血液循環(huán)[14]，Ghrelin及其受體在人類(lèi)微血管內(nèi)皮細(xì)胞中有表達(dá)，Ghrelin亦可改善血管內(nèi)皮功能， 抑制炎癥因子[15]。GHSR對(duì)心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用，這也間接證明了Ghrelin在高血壓發(fā)病機(jī)制和血壓調(diào)節(jié)上起到了關(guān)鍵的作用。體外研究表明Ghrelin能通過(guò)抑制ET-1的分泌、增加eNOS的合成，促進(jìn)NO的釋放，引起血管的舒張[16]。Ghrelin亦可通過(guò)降低eNOS的表達(dá)直接誘導(dǎo)NO的合成擴(kuò)張血管來(lái)保護(hù)血管內(nèi)皮功能、降低血壓[17]。Ghrelin可以激活內(nèi)皮或者直接作用于血管平滑肌，導(dǎo)致血管舒張、降低血壓[18]。本研究結(jié)果證實(shí)，模型組大鼠與空白組相比血清中Ghrelin、ET-1的含量升高，胸主動(dòng)脈GHSR、eNOS mRNA表達(dá)下降，胸主動(dòng)脈eNOS、Ghrelin蛋白量下降，說(shuō)明Ghrelin水平與高血壓血管內(nèi)皮功能密切相關(guān)。

中醫(yī)學(xué)無(wú)高血壓這一病名，常將此病歸屬于“眩暈”“頭痛”的范疇。目前本病主要以藥物治療為主， 針灸作為非藥物療法具有毒副作用小、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，且對(duì)原發(fā)性高血壓病療效確切，并且廣泛應(yīng)用于臨床。但其機(jī)制尚不清楚，本研究采用多氣多血的陽(yáng)明經(jīng)穴位足三里進(jìn)行針刺治療，研究該針刺組穴對(duì)于血管內(nèi)皮的生理機(jī)能產(chǎn)生的影響，以期發(fā)現(xiàn)針刺治療肥胖性高血壓的作用靶點(diǎn)與機(jī)制。高血壓是由于陰陽(yáng)失調(diào)、氣機(jī)運(yùn)行異常和臟腑經(jīng)絡(luò)等功能失調(diào)引起，以血壓升高作為可以監(jiān)測(cè)的臨床癥狀體征，并伴隨著頭暈、頭痛等臨床表現(xiàn)。而這些癥狀大多是由于腦小動(dòng)脈痙攣，這種動(dòng)脈痙攣又與高血壓息息相關(guān)，動(dòng)脈痙攣繼而發(fā)生腦動(dòng)脈硬化、腦供血不足等病理改變，會(huì)使患者病情更為嚴(yán)重。高血壓的中醫(yī)病因病機(jī)應(yīng)從血脈論治，且多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為內(nèi)皮功能障礙應(yīng)從“心主血脈”論治。足三里首見(jiàn)于《靈樞·本輸》，歸屬足陽(yáng)明胃經(jīng)，為胃經(jīng)合穴，又為胃腑之下合穴，具有調(diào)和氣血、補(bǔ)益中氣和健脾和胃的作用。足三里穴作為主穴用于高血壓病能有效地降低高血壓大鼠的血壓，而對(duì)心率無(wú)影響。多數(shù)醫(yī)者認(rèn)為針刺足三里對(duì)正常的血壓無(wú)降低作用，只是對(duì)異常升高的血壓有降低效用，此降壓作用是由于外周血管的擴(kuò)張所致。因此，本實(shí)驗(yàn)選取此穴作為降壓治療的主穴。針刺足三里可以達(dá)到平穩(wěn)、安全降壓的目的，降低了高血壓病對(duì)靶器官損害的風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)防心腦血管事件的發(fā)生。同時(shí)，現(xiàn)代臨床最常用于降壓的經(jīng)驗(yàn)穴之一就是胃經(jīng)合穴足三里[19]。研究表明針刺足三里可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能從而達(dá)到降低血壓的目的[20]。本研究結(jié)果顯示，針刺足三里能明顯改善SHR大鼠血清Ghrelin、ET-1水平和胸主動(dòng)脈GHSR、eNOS mRNA及eNOS和GHSR的蛋白表達(dá)，針刺足三里可能通過(guò)調(diào)節(jié)Ghrelin和血管內(nèi)皮活性物質(zhì)水平來(lái)保護(hù)SHR大鼠血管內(nèi)皮功能。以上研究通過(guò)探索針刺干預(yù)保護(hù)血管的通路，揭示了部分針刺足三里治療原發(fā)性高血壓的作用靶點(diǎn)，也為Ghrelin在血管內(nèi)皮損傷中的作用提供了一定依據(jù)，一定程度上解釋了針刺足三里對(duì)高血壓機(jī)體的保護(hù)作用機(jī)制。從實(shí)驗(yàn)方面研究針刺對(duì)原發(fā)性高血壓的防治不僅為高血壓的針刺治療提供了有力的證據(jù)，還對(duì)減緩高血壓人群的疾病進(jìn)程以及提高患者生活質(zhì)量有重大意義。