尹 暉， 王亦琳， 葉 妮， 孫 雷， 王鶴佳

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所， 北京海淀100081)

大環(huán)內(nèi)酯類藥物 (Macrolides)具有抗革蘭陽性菌和抗支原體活性，廣泛應(yīng)用于臨床獸藥領(lǐng)域[1-3]，常用于治療上呼吸道感染、泌尿道感染及胃腸道感染等[4]。大環(huán)內(nèi)酯類藥物通過和細(xì)菌核糖體50S亞基發(fā)生不可逆結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)肽及mRNA位移，選擇性地抑制蛋白質(zhì)合成，從而發(fā)揮抗菌作用[5]。由于大環(huán)內(nèi)酯類藥物在可食用動物中的廣泛使用，以及目前存在的阿奇霉素等人用藥在家禽中濫用的現(xiàn)狀，禽蛋中的獸藥殘留問題愈加凸顯，這是危害人類健康的隱患。另外，動物源食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留還可導(dǎo)致攜帶耐藥因子的菌株擴(kuò)散[6-7]。

為了提供禽蛋中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留監(jiān)控手段，本文首次建立了雞蛋和鴨蛋中紅霉素、替米考星、泰樂菌素、克拉霉素、螺旋霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、吉他霉素、加米霉素和泰萬菌素共10種大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留的UPLC-MS/MS檢測方法，能夠快速、簡便地進(jìn)行大環(huán)內(nèi)酯類藥物多殘留監(jiān)控。其中，阿奇霉素、羅紅霉素和克拉霉素為人用藥，未批準(zhǔn)使用于動物 ； 替米考星在雞產(chǎn)蛋期禁用 ； 泰萬菌素的殘留標(biāo)志物為泰萬菌素和3-O-乙酰泰樂菌素的總和。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 紅霉素、替米考星、泰樂菌素、克拉霉素、螺旋霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、吉他霉素、加米霉素、泰萬菌素及3-O-乙酰泰樂菌素，純度均大于99.0%，均購自北京振翔科技有限公司；甲酸、乙腈為色譜純，均購自美國默克公司；所用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備 Shimadzu 30A-QTRAP 6500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津公司-美國愛博才思公司；AE260電子天平，梅特勒-托利多公司；Biofuge Strators高速冷凍離心機(jī)，賀利氏公司；SIR4渦旋混合器，艾卡公司；Cleanert MAS-Q凈化管，艾杰爾公司。

1.3 對照溶液配制 精密稱取紅霉素、替米考星、泰樂菌素、克拉霉素、螺旋霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、吉他霉素、加米霉素、泰萬菌素及3-O-乙酰泰樂菌素共10種大環(huán)內(nèi)酯類標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇稀釋成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，再用40%乙腈水溶液稀釋成100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 測定方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：BEH C18 (50×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A：0.1%甲酸水溶液，B：0.1%甲酸乙腈溶液；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of mobile phase

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源，掃描方式：正離子掃描，檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測，氣簾氣CUR：30 psi，碰撞氣(CAD)：中等(Medium)，電噴霧電壓(IS)：5 500 V，離子源溫度：550 ℃，輔助氣(GS1)：50 psi，輔助氣(GS2)：50 psi，EP電壓：10 V，CXP電壓：10 V，待測藥物定性定量離子對及對應(yīng)的去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)見表2。

表2 10種大環(huán)內(nèi)酯類定性定量離子對及對應(yīng)的去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)Table 2 Qualitative ions,corresponding quota ions of 10 macrolides and corresponding declustering potential(DP),collision energy(CE)

1.4.3 定性與定量 定性時試樣溶液中色譜峰的保留時間，應(yīng)與校正溶液的保留時間一致，容許偏差為±5%，試樣溶液中的離子豐度比應(yīng)與校正溶液的一致，容許偏差符合歐盟2002/657/EC決議要求。定量方法采用外標(biāo)法定量。

1.4.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密量取大環(huán)內(nèi)酯類標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用40%乙腈水溶液稀釋成含各藥物濃度分別為0.2、2、5、10 ng/mL和20 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，從中各取1.0 mL，分別加入到空白組織經(jīng)提取、凈化和吹干后的殘余物中，充分溶解，0.2 μm濾膜過濾后，作為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測定。每一濃度進(jìn)樣3針，按所得峰面積與相應(yīng)的對照溶液濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并依次計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.4.5 樣品前處理過程 稱取試料雞蛋或鴨蛋(2±0.02)g于50 mL離心管中，加入80%乙腈水溶液10 mL，渦旋振蕩1 min，8 000 r/min離心8 min。取上清液1.0 mL至Cleanert MAS-Q凈化管中，渦旋振蕩1 min，8 000 r/min離心8 min，取上清液0.5 mL，加水0.5 mL，混勻，備用，取適量體積過微孔濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.4.6 方法靈敏度確定 將適量大環(huán)內(nèi)酯類標(biāo)準(zhǔn)工作液加入到空白試料雞蛋中，經(jīng)上述方法進(jìn)行前處理后，用UPLC-MS/MS檢測，觀察藥物特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比(S/N)和對應(yīng)藥物濃度，S/N>3者定其為方法的檢測限，S/N>10者為方法的定量限。

1.4.7 準(zhǔn)確度和精密度的測定 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白試料雞蛋和鴨蛋中各添加2、20、200 μg/kg三個不同濃度藥物進(jìn)行回收率試驗(yàn)，各濃度進(jìn)行5個樣品平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，求批內(nèi)、批間RSD。

2 結(jié)果

2.1 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照上述系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行線性回歸，得到的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3、表4。從表中可以看出，10種大環(huán)內(nèi)酯類藥物于雞蛋和鴨蛋中在0.2～20 ng/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2均大于0.990。

表3 雞蛋中10種大環(huán)內(nèi)酯類藥物基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 Matrix-matched standard curve of 10 macrolides and a metabolite in eggs

表4 鴨蛋中10種大環(huán)內(nèi)酯類藥物基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 4 Matrix-matched standard curve of 10 macrolides and a metabolite in duck eggs

2.2 方法靈敏度 按上述方法進(jìn)行處理，當(dāng)添加濃度為1 μg/kg時，測得大環(huán)內(nèi)酯類藥物的S/N>3，說明方法檢測限為1 μg/kg。當(dāng)添加濃度為2 μg/kg時，測得大環(huán)內(nèi)酯類藥物的S/N>10，說明方法定量限為2 μg/kg。20 μg/kg空白雞蛋添加試液中10種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的特征離子質(zhì)量色譜圖見圖1。

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forwoud)

(續(xù)圖1 Continued)

圖1 空白雞蛋添加試樣溶液中得到的特征離子質(zhì)量色譜圖(20 μg/kg)Fig.1 Qualitative ions of 10 macrolides in spiked eggs(20 μg/kg)A:紅霉素(734.5>576.4)； B:替米考星(869.5>696.5)； C:泰樂菌素(916.6>174.0)； D:克拉霉素(748.5>590.4)； E:螺旋霉素(843.3>174.2)； F:阿奇霉素(375.4>591.5)； G:羅紅霉素(837.6>679.5)； H:吉他霉素(772.5>109.0)； I:加米霉素(777.7>619.3)； J:泰萬菌素(142.6>109.1)； K:3-O-乙酰泰樂菌素(958.7>814.3)A:Erythromycin(734.5>576.4)； B:Tilmicosin(869.5>696.5)； C:Tylosin(916.6>174.0)； D:Clarithromycin(748.5>590.4)； E:Spiramycin(843.3>174.2)； F:Azithromycin(375.4>591.5)； G:Roxithromycin(837.6>679.5)； H:Guitamycin(772.5>109.0)； I:Gamithromycin(777.7>619.3)； J:Tylvalosin(142.6>109.1)； K:3-O-Acetyltylosin(958.7>814.3)

2.3 方法精確度 在空白雞蛋和鴨蛋中各添加3個不同濃度大環(huán)內(nèi)酯類藥物進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表5、表6?？梢钥闯?，雞蛋中10種大環(huán)內(nèi)酯類藥物平均回收率為65.1%～115%，鴨蛋中10種大環(huán)內(nèi)酯類藥物平均回收率為67.5%～117%，本方法的回收率范圍都在60%～120%，批內(nèi)批間RSD均小于20%。

表5 空白雞蛋中10種大環(huán)內(nèi)酯類藥物添加的回收率Table 5 Recoveries of 10 macrolides and a metabolite in spiked eggs

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forwoud)

表6 空白鴨蛋中10種大環(huán)內(nèi)酯類藥物添加的回收率Table 6 Recoveries of 10 macrolides and a metabolite in spiked duck eggs

3 討論

目前，我國動物可食性組織中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留檢測方法的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)大部分是高效液相色譜法，多針對動物性食品中的單一藥物或某幾種藥物[8-9]，已有的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法標(biāo)準(zhǔn)也只針對單一藥物或某幾種藥物[10-11]，僅有少量文獻(xiàn)對同時檢測大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及其代謝物進(jìn)行報道[12]。

目前還沒有雞蛋和鴨蛋中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留檢測方法的報道，本文創(chuàng)新性地首次建立了雞蛋和鴨蛋中紅霉素、替米考星、泰樂菌素、克拉霉素、螺旋霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、吉他霉素、加米霉素和泰萬菌素共10種藥物殘留的UPLC-MS/MS檢測方法，為動物性食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物的殘留監(jiān)控提供了關(guān)鍵的技術(shù)支持。

液-液萃取常用于大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留的定量檢測，但是有機(jī)溶劑消耗大，操作耗時[13]。本方法根據(jù)稱樣量，選擇適宜體積的80%乙腈水溶液提取1次，可以有效提取大環(huán)內(nèi)酯類藥物，提取步驟簡便，同時通過高速離心又能很好的去除蛋白質(zhì)等大量雜質(zhì)的干擾，并且在不影響回收率的情況下盡可能減少過柱體積，為實(shí)際應(yīng)用中大批量樣品檢測提供了便捷操作性。

固相萃取法是最常見的凈化方式，大環(huán)內(nèi)酯類藥物可采用HLB柱[14]或C18柱[15]凈化，經(jīng)過比較試驗(yàn)，本方法采用Cleanert MAS-Q凈化管，有效吸附備用液中脂肪及其他雜質(zhì)，有效去除禽蛋樣品中的大部分基質(zhì)干擾，直接收集上清并過濾膜后上機(jī)檢測，節(jié)省了固相萃取和濃縮步驟，有利于提高回收率。本方法定性、定量準(zhǔn)確，前處理方法簡便，是一種高靈敏度、高選擇性的檢測方法，對動物性食品中獸藥殘留風(fēng)險監(jiān)測提供了科學(xué)依據(jù)。