宋廣州，涂芳芳，丁夢瑤，戴夢男，殷 音，董鳳林，王建南,4

(1. 蘇州大學 現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室，江蘇 蘇州 215123；2. 蘇州大學醫(yī)學部，江蘇 蘇州 215123；3. 蘇州大學附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006；4. 蘇州大學 紡織與服裝工程學院，江蘇 蘇州 215123)

蠶絲是由蠶的絹絲腺合成與分泌并由吐絲口牽引而成的纖維，蛋白純度高，不含有毒成分，未接觸化學試劑。家蠶蠶絲有別于長期接觸外界環(huán)境的羊毛等蛋白質纖維，是居家生活最具舒適親和感的紡織原料。此外，近20多年來，基于蠶絲優(yōu)質的蛋白質，家蠶絲素纖維/蠶絲織物、再生絲素蛋白和絲膠蛋白在生物醫(yī)用材料領域的應用研究越來越受到關注，尤其是絲素蛋白(SF)。家蠶SF大分子由重鏈(H鏈)、 輕鏈(L鏈)和一種糖蛋白P25鏈以量比為6∶6∶1組成，H鏈占總分子量的92%，由12個疏水性的GAGAGS六肽為主的重復序列和11個親水性的非重復序列相間排列而成[1]，獨特的序列結構可使再生SF在外在因素(溫度、溶劑、交聯(lián)劑)的誘導下形成穩(wěn)定結晶結構的絲素膜、三維支架或納微球等生物醫(yī)用材料[2]。

SF具有優(yōu)異的生物相容性，支持角膜細胞[3]、成纖細胞[4]、血管細胞[5]、干細胞[6]等多種細胞的粘附、增殖或分化。SF在皮膚[7]、神經導管[8]、軟骨[9]及血管[10-11]等組織工程支架方面的應用研究很活躍。其中，研究者對蠶絲織物、再生SF納米纖維、再生SF多孔材料用于血管組織工程支架的構建開展了深入的研究。但作為血管組織工程支架，小直徑(內徑<6 mm)血管移植物還未實現(xiàn)臨床應用，主要原因是易誘發(fā)血栓形成和內膜增生，管腔內徑小而發(fā)生閉塞。血管內膜是維持凝血系統(tǒng)平衡的承擔者，只有通過抑制平滑肌細胞過度增殖才能阻止內膜增生?，F(xiàn)有研究指出，二維或三維SF材料可促進血管內皮細胞的生長，支持血管內皮細胞、血管平滑肌細胞或血管成纖細胞在內的血管細胞共培養(yǎng)[3]，那么，如果小血管移植物植入初期內皮細胞和平滑肌細胞的競爭性生長能夠得到調控尤顯重要。

降鈣素基因相關肽(CGRP)是目前體內發(fā)現(xiàn)的最強的舒張血管活性肽，更重要的是具有保護內皮細胞活性的功能，能促進內皮細胞向受損血管壁遷移，刺激細胞增殖，同時抑制平滑肌細胞增殖和遷移[12-14]，因此，本文開展了CGRP修飾SF膜的研究，首先用己二酸對SF進行改性制備了帶高負電荷的再生SF膜，進一步探索了CGRP通過靜電相互作用在SF膜表面的加載能力，以期為SF小口徑人工血管的設計提供新的思路。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

材料：家蠶生絲，如皋春秋絲綢有限公司；己二酸(AA)，北京伊諾凱科技有限公司；透析袋(14 ku)，上海通善生物科技有限公司；溴化鋰，合肥精匯化工研究所；1-乙基-3 (3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，Sigma上海貿易有限公司；嗎啉乙磺酸(MES)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；降鈣素基因相關肽，默克密理博公司；兔抗人降鈣素基因相關肽一抗和辣根過氧化物酶(HRP)標記的驢抗兔二抗，北京博奧森生物技術有限公司；BCA試劑盒、吐溫-20和TMB顯色液，上海碧云天生物技術有限公司；牛血清白蛋白(BSA)，上海源葉生物科技有限公司；小牛血清，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；96孔細胞培養(yǎng)板，上海圣納堡生物科技開發(fā)有限公司；Na2CO3，國藥集團化學試劑有限公司。

儀器：PB-10型pH計，賽多利斯科學儀器有限公司；DF-101S型磁力攪拌器，上海予正儀器設備有限公司；DZF-6053型真空干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；Alpha 1-4 Lscplus型冷凍干燥機，德國Christ公司；Malvern ZS90型粒徑電位分析儀，英國Malvern公司；Nicolet 5700型傅里葉紅外光譜儀，美國Nicolet公司；X′Pert-Pro MPD型全自動X射線衍射儀，荷蘭PANalytical B.V.公司；Bio-Tek型多功能全自動酶標儀，美國BioTek公司。

1.2 試樣制備方法

1.2.1 SF溶液的制備

稱取家蠶生絲以浴比為1∶50于煮沸的質量分數為0.06%的Na2CO3水溶液中攪拌均勻，30 min后取出用去離子水洗滌干凈，重復3次。干燥后將脫膠的蠶絲纖維以浴比為3∶20溶解于9.3 mol/L溴化鋰水溶液中，于(65±2) ℃攪拌直至完全溶解。將溶解液裝入截留分子質量為14 ku的透析袋，于 4 ℃ 去離子水中透析3 d，得到再生SF水溶液，過濾后采用旋轉蒸發(fā)法濃縮至質量濃度為40 mg/mL。

1.2.2 AA改性SF膜的制備

制備10 mg/mL的AA溶液，分別加入與AA量比為2.5∶1的EDC和NHS，攪拌均勻于4 ℃活化1 h。 向SF水溶液中添加質量分數為20%的MES混合均勻，然后按SF與AA質量比為100∶0、100∶0.5、100∶1、100∶1.5、100∶2和100∶2.5制備SF/AA混合溶液，冰浴攪拌反應30 min。然后將反應后的混合溶液裝入透析袋中，于4 ℃冰箱內透析2 d。每個樣品量取一定體積脫除細小氣泡后，輕輕倒入聚苯乙烯板孔內，于40 ℃恒溫干燥后取出，在室溫下平衡12 h揭膜，得到AA交聯(lián)改性SF膜。

1.3 測試與表征

1.3.1 熱水溶失率測試

根據SF質量濃度和倒入板孔的體積，計算得到絲素膜中原有SF的質量m1。所有樣品置于恒溫恒濕環(huán)境平衡24 h后逐一稱取質量，按浴比為1∶50浸漬于去離子水中，于37 ℃水浴振蕩12 h，棄去樣品，以3 000 r/min離心5 min收集上清液。采用BCA試劑盒并根據說明書標準步驟測定上清液中SF的質量濃度。

首先用BSA配制標準梯度質量濃度，用酶標儀檢測562 nm處的吸光度(OD562)，繪制曲線擬合得到回歸直線方程y=ax+b(R2≥0.99)(式中：x為BSA質量濃度，mg/mL；y為吸光度)。同時測定各樣品的吸光度，根據y=ax+b計算各樣品的SF質量濃度，進一步根據浸漬的體積計算各樣品溶失的SF質量m2。根據下式計算熱水溶失率：

S=m2/m1×100%

1.3.2 Zeta電位測試

將1.2.2節(jié)反應透析后的SF溶液稀釋至質量濃度為1.0 mg/mL，采用粒徑電位分析儀測定溶液中改性SF的Zeta 電位。

1.3.3 結構測試

將SF膜剪成細小粉末，收集透過孔徑為50 μm網篩的粉末，采用傅里葉紅外光譜儀測定樣品的化學結構和分子構象。掃描次數為32，分辨率為2 cm-1，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

使用X射線衍射儀測定樣品的結晶結構，采用CuKα射線，波長為0.154 06 nm，管電壓為40 kV，管電流為35 mA，掃描速度為2(°)/min，記錄2θ在5°～50°間的X射線衍射曲線。

1.3.4 SF膜表面CGRP加載能力測試

SF膜表面加載CGRP：將SF與AA 質量比為100∶0、100∶1和100∶2.5的改性SF膜按96孔細胞培養(yǎng)板的底面積剪成小圓片并鋪于孔底部，每孔加入30 μL(180 ng)的CGRP水溶液，于4 ℃孵育12 h，然后室溫風干，再用去離子水漂洗 2次，風干。

CGRP加載能力測定(酶聯(lián)免疫吸附法)：每孔加入100 μL含5%小牛血清和0.05%吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液(pH值為7.4)，于37 ℃孵育1 h；漂洗后加入1∶1 000稀釋的兔抗人降鈣素基因相關肽一抗40 μL，于37 ℃孵育1 h；再次漂洗后加入1∶5 000稀釋的HRP驢抗兔二抗40 μL，于37 ℃孵育1 h；漂洗后加入200 μL 的TMB溶液，于37 ℃孵育20 min；最后加入50 μL的2 mol/L 的硫酸溶液終止反應。取上述反應液稀釋相同倍數后，每個樣品取200 μL溶液加入到新的96孔板內，用酶標儀檢測450 nm波長下的吸光度(OD450)值。

2 結果與討論

2.1 AA改性SF的反應機制

有機合成和生物化學中，EDC和NHS是常用的水溶性催化交聯(lián)劑，可催化介導羧基和氨基偶聯(lián)成酰胺鍵[15]，反應機制如圖1所示。EDC先活化AA端部的2個—COOH，使其充分地與SF分子上的—NH2反應形成酰胺鍵—CONH—，交聯(lián)SF分子鏈或者接枝于SF分子鏈上。SF大分子之間也發(fā)生側基—COOH 與—NH2的共價結合形成—CONH—。整個反應過程中，EDC和NHS只起到催化作用，形成中間體O—異酰基脲和NHS酯，再與—NH2共價結合后成為小分子副產物，未反應的EDC、NHS及生成的小分子副產物均可通過透析或者凝膠過濾除去。

圖1 AA改性SF的反應機制Fig.1 Reaction mechanism of AA modified SF

2.2 AA改性SF的電負性分析

Zeta電位是帶電分子或微粒表面剪切層的電位，水溶液環(huán)境下AA改性SF的Zeta電位測試結果如圖2所示?？梢?，隨著AA質量占比的增加，改性SF的電負性逐漸增加。研究初期，實驗方案設計的SF與AA的最大質量比為100∶5，但研究發(fā)現(xiàn)當AA質量占比較大，即SF與AA質量比為100∶3時，SF膜的成型開始受到影響，因此，確定AA添加比例最大為100∶2.5。 AA改性SF后，當端部2個—COOH交聯(lián)反應連接2個SF分子時，SF分子鏈上可接受質子的伯胺—NH2基團被反應形成酰胺鍵—CONH—，使SF分子中—COOH數量相對增多，凈電荷負值增加；當AA的1個—COOH接枝反應在SF分子鏈上時，不僅與SF分子鏈上接受質子的伯胺—NH2基團反應，同時還引入1個—COOH，使凈電荷負值增加。當SF與AA的質量比為100∶2.5時，SF溶液的Zeta電位由未改性SF溶液的-2.66 mV 下降為-5.4 mV，說明Zeta負電位值增加1倍。

圖2 水溶液環(huán)境下AA改性SF的Zeta電位Fig.2 Zeta potential of AA modified SF in aqueous solution

2.3 改性SF膜的熱水溶失率分析

對生物材料來說，水(組織液)環(huán)境不溶性是非常重要的，因為溶解產物易引起肌體炎癥反應及免疫反應。圖3示出37 ℃水環(huán)境下AA改性SF膜的熱水溶失率。

圖3 AA改性SF膜的熱水溶失率Fig.3 Hot water loss rate of AA modified SF films. (a)BSA standard curve; (b)Loss rate of SF

由圖3(a)BSA質量濃度-吸光度的標準曲線可得，其回歸直線方程為y=0.545 9x+0.205 6，確定系數R2=0.996 5。由圖3(b)可知，未改性SF膜中蛋白的溶失率小于10.5%，說明SF膜具有較好的熱水穩(wěn)定性；隨著AA質量占比的增加，SF膜的熱水溶失率進一步減小，當SF與AA的質量比由100∶0 增加為100∶1時，SF的熱水溶失率下降顯著；SF與AA的質量比為100∶1.5時，SF溶失率達到最小，隨后趨于穩(wěn)定。添加AA后，兩端活化的—COOH 連接于SF大分子使SF材料形成了更穩(wěn)定的網絡結構，提高了SF的耐水性。

圖4 AA改性SF膜的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of 4 000～2 000 cm-1 (a) and 2 000～1 000 cm-1 (b) of AA modified SF films

2.4 改性SF膜的化學結構與分子構象分析

2.5 改性SF膜的結晶結構分析

SF材料主要有2種結晶結構：Silk I和Silk Ⅱ。Silk Ⅰ(α螺旋和β轉角)結晶衍射峰主要出現(xiàn)在12.2°、19.7°、24.7°附近，Silk II(β-折疊)結晶衍射峰主要出現(xiàn)在9.1°、20.7°、24.3°附近。圖5示出AA改性SF膜的X射線衍射譜圖?？芍?，AA改性前后SF膜均形成了穩(wěn)定的結晶結構，AA改性后SF膜在12.2°附近的Silk Ⅰ特征衍射峰消失，19.8°附近的典型結晶峰變尖銳且峰尖偏移至20.6°附近，尤其是SF與AA的質量比為100∶1、100∶1.5和100∶2的3種SF膜，因為AA的交聯(lián)使SF肽鏈之間形成了網絡結構，促進了SF膜更穩(wěn)定的結晶結構的形成，但AA添加過多，也會阻礙SF肽鏈間緊密有序的排列。另外，所有SF膜在24.3°附近出現(xiàn)Silk Ⅱ的結晶峰。

圖5 AA改性SF膜的X射線衍射曲線Fig.5 X-ray diffraction curves of AA modified SF films

2.6 AA改性SF膜加載CGRP的能力分析

CGRP是1982 年采用分子生物技術和DNA基因重組技術研究發(fā)現(xiàn)的生物活性多肽，含有37個氨基酸殘基，N末端和C末端均有激活受體并與受體高親和性結合的活性位點[16-17]。已有研究證明，不恰當的共價結合反應封閉了生物活性分子的活性位點而使其喪失生物活性[18-20]，通過靜電作用向生物材料中引入生物活性因子才可最有效地保護其活性。CGRP是等電點為9.5的表面帶正電的活性物質，為保持CGRP活性，將AA引入SF分子鏈，使SF膜表面產生了更多的—COOH，溶液中—COOH失去質子(—COO-)從而提高了表面電負性，進一步通過靜電相互作用在SF膜表面加載CGRP，加載示意圖如圖6所示。

圖6 AA改性SF膜加載CGRP示意圖Fig.6 Schematic diagram of CGRP loading on AA modified SF films

由圖2可知，隨著AA質量占比的增加，SF膜的負電荷也隨之增加，當SF與AA的質量比從100∶0 變化為100∶1和100∶2.5時，SF的Zeta電位由-2.66 mV 下降為-3.95和-5.4 mV。圖7示出AA改性SF膜上CGRP的加載能力?？芍弘S著SF膜表面負電荷的增加，因靜電作用加載于膜表面的CGRP量逐漸增多，SF與AA質量比為100∶1的AA改性SF膜表面CGRP的加載量是未改性SF膜的1.22倍；當SF與AA質量比為100∶2.5時，改性膜表面CGRP的加載量有顯著提高，達到未改性SF膜的9倍。

注：**表示p< 0.01。圖7 AA改性SF膜上CGRP的加載能力Fig.7 Loading capacity of CGRP on AA modified SF films

3 結 論

降鈣素基因相關肽(CGRP)是一種具有調控血管舒張和血管細胞競爭性生長的活性肽，分子表面帶正電。為加載更多的CGRP，并保護CGRP分子中功能區(qū)域的側基官能團的活性，選擇帶有2個—COOH 端的己二酸(AA)對絲素蛋白(SF)進行改性，使SF表面的負電荷得到顯著的增加，大大提高了對CGRP的靜電加載能力。當SF與AA的質量比從100∶0變化為100∶2.5 時，SF的Zeta負電位值增加1倍，SF膜表面CGRP的加載量增加9倍。 本文研究對SF用于小口徑血管組織工程材料的開發(fā)與功能改性具有重要的參考作用。