牛賀 王俊月 李亮 宋倩紅 王肖艷 謝文英 包永生

(河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)作為一種不完全可逆氣流受限的呼吸系統(tǒng)慢性疾病，近年來(lái)其發(fā)病率在我國(guó)逐年上升，已成為排列第3位的疾病負(fù)擔(dān)和死因〔1〕。不僅發(fā)病率逐年遞增，研究發(fā)現(xiàn)COPD并發(fā)癥叢生，諸如肺動(dòng)脈高壓、肺栓塞、右心衰竭等，同樣對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生了嚴(yán)重的負(fù)面影響。目前COPD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，最新研究顯示，氣管、肺實(shí)質(zhì)與肺血管的炎癥反應(yīng)及結(jié)構(gòu)重塑是COPD的典型病理變化〔2〕。而高遷移率族蛋白(HMG)B1廣泛參與COPD患者的多條信號(hào)通路中〔3〕，且HMGB1的表達(dá)在COPD中的意義不僅在于促進(jìn)炎癥反應(yīng)，也在于其可以引起氣道平滑肌纖維化，與氣道和血管重塑，與肺氣腫和氣流受限也息息相關(guān)〔4，5〕。根據(jù)最新的研究，血清基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9同樣伴隨COPD患者疾病的進(jìn)行性發(fā)展而變化〔6，7〕。雖然HMGB1與MMP-2、MMP-9均與COPD關(guān)系密切，且三者之間的相互關(guān)系已在其他疾病中被頻頻證實(shí)〔8〕，但在COPD中的變化機(jī)制尚不明確。本研究小組已證實(shí)二陳湯加味可通過(guò)多條信號(hào)通路協(xié)同來(lái)抑制COPD的炎癥反應(yīng)，并阻止氣道重塑〔9～19〕，因此本研究選取HMGB1與MMP-2、MMP-9為研究對(duì)象，為二陳湯加味對(duì)COPD的多靶點(diǎn)治療作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 清潔健康的SD大鼠雄性70只，SPF級(jí)，2月齡，體重(200±20)g，合格證號(hào)SCXK(魯)20140007，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供；實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地河南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SYXK(豫)2012-0009；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查批準(zhǔn)編號(hào)DWLL20130018。生長(zhǎng)飼料由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)蘇飼證(2014)01008。

1.2藥物及試劑二陳湯加味方組成 姜半夏10 g(批號(hào)1505001S)、茯苓20 g(批號(hào)1405002W)、陳皮10 g(批號(hào)1509002S)、白術(shù)15 g(批號(hào)1407001W)、黨參25 g(批號(hào)1407007W)、枳殼10 g(批號(hào)1510002W)、山藥20 g(批號(hào)1509003S)、地龍10 g(批號(hào)1511002S)、桂枝3 g(批號(hào)1510002S)、炒蘇子20 g(批號(hào)1512001S)、炙麻黃6 g(批號(hào)1508001S)、杏仁10 g(批號(hào)1404002S)、葶藶子15 g(批號(hào)1506001W)，均為中藥配方顆粒，購(gòu)自華潤(rùn)三九醫(yī)藥公司。脂多糖(美國(guó)Sigma公司，025M40400V)；大鼠MMP-2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(武漢博士德公司，EK0639)，大鼠MMP9 ELISA試劑盒(武漢博士德公司，EK1463)，兔多抗HMGB1(武漢三鷹公司，10829-1-ap)，兔多抗GAPDH(杭州賢至公司，AB-P-R 001)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德公司，BA1054)。紅旗渠過(guò)濾嘴香煙，購(gòu)自河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司。其他試劑均由河南中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，DL-5-B離心機(jī)(上海安亭儀器廠)，TWCL-B140×140調(diào)溫、恒溫磁力攪拌器(鞏義予華公司)，BA210生物顯微鏡(廈門麥克奧迪公司)，BSA124S-CW萬(wàn)分之一電子天平(北京麥多利斯公司)，ZWY240恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠(chéng)公司)，DB-B1烤片機(jī)(常州國(guó)華公司)，微量分光光度計(jì)(杭州奧盛公司)，SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰公司)，EG1150C冷臺(tái)，RM2245半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，TP1020-1自動(dòng)組織脫水處理機(jī)，ST5020全自動(dòng)染色機(jī)，HI1210烘片機(jī)(均購(gòu)自上海徠卡公司)。

1.4分組、模型制備與給藥 隨機(jī)將70只SD大鼠分為7組：即正常組、模型組、二陳湯加味低、中、高劑量〔10、20、40 g/(kg·d)〕、二陳湯組、消咳喘組。除正常組外，其余各組制備COPD的大鼠模型〔13～15〕，并于第1天、第14天，對(duì)70只大鼠進(jìn)行逐一麻醉(麻醉方法為腹腔注射10%水合氯醛溶液，給藥量為0.03 ml/kg)，除正常組外皆于氣管滴注LPS(給藥量為1 mg/ml)0.2 ml。正常組則在氣管內(nèi)注入等量生理鹽水。第2～45天將需造模的大鼠置入自制密封的煙熏箱內(nèi)，被動(dòng)吸煙，進(jìn)行煙霧染毒，2次/d，香煙10支/次，30 min/次，間隔4 h。最終以肺功能的改變和病理組織為標(biāo)準(zhǔn)判斷模型是否制備成功〔16〕。模型制備成功之后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行灌胃，各組大鼠每日用藥分別按照二陳湯加味低、中、高劑量組每日10、20、40 g/kg換算出免煎顆粒用量，用純水稀釋后于每天10 AM及4 PM分別灌胃給藥。模型組和正常組灌胃相同體積的純水，給藥全程持續(xù)14 d。備注：灌胃劑量換算：二陳湯加味中劑量組用藥量按照體重70 kg的成年人每日常規(guī)服用藥量換算，公式：(動(dòng)物體重/人的體重)×人用藥量×6.3計(jì)算，即體表面積系數(shù)為0.018。確定中劑量后，低、高劑量再依等比數(shù)列進(jìn)行設(shè)置〔17〕。

1.5標(biāo)本制備 ①固定標(biāo)本：使用4%濃度的多聚甲醛將大鼠右肺上葉組織固定；②脫水：選取1～2 cm厚的右肺上葉組織的橫截面置于包埋盒中，并用自動(dòng)組織脫水機(jī)脫水；③石蠟包埋和切片：手動(dòng)在石蠟包埋機(jī)上完成石蠟包埋，并保存在4 ℃環(huán)境下，6 μm厚切片。

1.6ELISA測(cè)定肺組織中MMP-2、MMP-9含量 分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00 μl，余孔分別加待測(cè)樣品100 μl。覆膜，37 ℃，90 min。棄去液體并甩干，每孔加入抗體工作液100 μl，覆膜，37 ℃，1 h。棄去液體，洗板3次，每次浸泡30 s，350 μl/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。加ABC工作液100 μl，覆膜，37℃，30 min。棄去液體，甩干，洗板5次。每孔加顯色劑90 μl，酶標(biāo)板覆膜，37℃，避光孵育15 min。加終止液100 μl，此時(shí)藍(lán)色轉(zhuǎn)黃色。立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值)，并經(jīng)轉(zhuǎn)化，計(jì)算出MMP-2、MMP-9的實(shí)際濃度。

1.7Western印跡檢測(cè)HMGB1的蛋白表達(dá) 取新鮮的冰凍組織100 mg置于容量為2 ml勻漿器中，剪碎肺組織，添加裂解液，裂解30 min，并移入離心管，離心之后取上清液分裝、稀釋。將稀釋樣品放置于96孔的板內(nèi)，按比例為50∶1的比例將二喹啉甲酸(BCA)試劑盒中A液與B液混合，加入96孔板內(nèi)，避光并孕育30 min，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度與相應(yīng)的OD值計(jì)算直線回歸方程。取蛋白樣品，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜GAPDH(200 mA 90 min)、HMGB1(200 mA 120 min)。5%脫脂奶粉封閉，加入一抗HMGB1，GAPDH (1∶1 000)，4℃靜置過(guò)夜。洗滌3次，加入二抗(1∶50 000)，25℃孵育1 h，PBS洗滌5次；電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色曝光。晾干膠片并掃描，用BandScan分析膠片灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，正常組大鼠毛皮仍然呈白色并有光澤、呼吸均勻、反應(yīng)迅速。模型組大鼠呼吸淺快，呼吸困難，易煩躁激惹，毛發(fā)干燥發(fā)黃，精神差。二陳湯加味高、中、低劑量組分別以相應(yīng)的藥物灌胃后，大鼠體重增加，改善最顯著的是二陳湯加味中劑量組。二陳湯加味低劑量組在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行期間死亡1只，模型組死亡2只，經(jīng)解剖觀察，發(fā)現(xiàn)肺氣腫及肺部感染可能是致死的主要原因。

2.2大鼠肺組織勻漿液中MMP-2、MMP-9的濃度 與正常組比較，模型組大鼠肺組織勻漿液中MMP-2、MMP-9濃度顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，二陳湯加味低、中、高劑量組MMP-2、MMP-9濃度均有程度不等的降低(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3大鼠肺組織中HMGB1蛋白表達(dá) 與正常組肺組織HMGB1蛋白表達(dá)量(0.52±0.02)比較，模型組肺組織中HMGB1蛋白表達(dá)顯著上升(1.02±0.02，P<0.05)，與模型組比較，二陳湯加味低(0.82±0.04)、中(0.59±0.02)、高劑量組(0.69±0.01)、消渴喘組(0.69±0.02)、二陳湯組(0.84±0.04)HMGB1蛋白表達(dá)均有程度不等的降低(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

表1 各組肺組織勻漿MMP-2、MMP-9的濃度比較

1～7：正常組、模型組、二陳湯加味低劑量組、二陳湯加味中劑量組、二陳湯加味高劑量組、消渴喘組、二陳湯組

3 討 論

COPD歸屬中醫(yī)“肺脹”、“喘證”、“咳嗽”等范疇。其病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，且以肺氣虛為本，痰氣交阻為標(biāo)。其癥狀多以進(jìn)行性加重的咳、痰、喘、悶為主，而二陳湯作為歷代公認(rèn)的祛痰之祖方，以理氣化痰，燥濕和胃為主要功效，方中半夏和胃降逆、燥濕化痰，姜制后更適用于寒痰咳逆及脾虛痰盛；陳皮健脾理氣，茯苓淡滲利水皆可裨益化痰之力，甘草潤(rùn)肺止咳、健脾和中、調(diào)和諸藥，全方配伍精當(dāng)，為歷代醫(yī)家所推崇。如《活人書》講道“二陳湯，治痰之準(zhǔn)繩也”，汪昂《本草備要》談道“治痰通用二陳”，陳念祖提出“此方為痰飲之通劑也”，本研究結(jié)合臨床實(shí)際和歷代醫(yī)家論述，將二陳湯在原方的基礎(chǔ)上適當(dāng)增補(bǔ)，以求針對(duì)COPD痰氣交阻之巢穴，且根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，歷代在使用二陳湯時(shí)皆以二陳湯的加味運(yùn)用為主，即便是當(dāng)年的實(shí)驗(yàn)研究亦是如此〔20〕。因此本研究的二陳湯加味，再加炒苦杏仁、蜜炙麻黃以止咳平喘、宣降肺氣，兩者一升一降，恰可通暢氣機(jī)之滯澀，又加葶藶以降逆瀉肺，白術(shù)、黨參、山藥以補(bǔ)肺健脾，寓意培土生金，不離“治病必求其本”之大法；因長(zhǎng)期痰氣交阻，氣機(jī)滯澀，血脈為之而不通，淤塞由之而顯著，故加地龍以通絡(luò)祛瘀。諸藥并用，止咳平喘、燥濕化痰、通絡(luò)止痛，使肺氣得宣，脾氣得旺，腎氣得固，不僅可消弭病痛于無(wú)形，更可培護(hù)根本。

HMGB1屬于重要炎癥因子，且在COPD患者的肺組織和氣道中高表達(dá)。巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等在受到刺激之后會(huì)在16～20 h釋放HMGB1，且HMGB1在血清中能夠維持1～3 d，在COPD患者中，HMGB1在COPD患者中有重要的意義〔21〕。因其不僅可以廣泛參與到肺部炎癥反應(yīng)中，更與氣道重塑和纖維化息息相關(guān)〔22〕。HMGB1還能夠促進(jìn)炎癥細(xì)胞積聚，并促進(jìn)炎癥反應(yīng)加深，進(jìn)而對(duì)肺組織造成損傷〔23〕，因此不僅可以作為研究肺疾病的理想指標(biāo)，更是判斷預(yù)后、評(píng)價(jià)病情的客觀指標(biāo)〔24〕。MMPs，是對(duì)肺組織的基質(zhì)降解和重塑有重要調(diào)節(jié)作用的蛋白，其中MMP-2、MMP-9可作用于氣道細(xì)胞外基質(zhì)膜和基質(zhì)之上，使細(xì)胞外基質(zhì)降解，導(dǎo)致肺組織彈性降低，加快COPD的進(jìn)展，加重氣道的阻塞〔25,26〕。本研究證實(shí)，二陳湯加味可通過(guò)抑制MMP-2、MMP-9的合成與分泌，降低COPD大鼠肺組織中MMP-2、MMP-9的含量，從而達(dá)成對(duì)COPD大鼠肺組織炎癥的治愈作用；通過(guò)降低大鼠肺組織中HMGB1的蛋白表達(dá)，從而使細(xì)胞外基質(zhì)的沉積減緩，減輕了COPD大鼠肺組織的重構(gòu)。