李海倫，李 恒，孫 飛，謝媛媛，梁生旺，王淑美*

經(jīng)典名方大秦艽湯HPLC指紋圖譜及含量測定方法研究

李海倫1, 2, 3，李 恒1, 2, 3，孫 飛1, 2, 3，謝媛媛1, 2, 3，梁生旺1, 2, 3，王淑美1, 2, 3*

1. 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 2. 廣東省中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006 3. 國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點研究室，廣東 廣州 510006

制備10批大秦艽湯標準煎液，建立其HPLC指紋圖譜并計算指標成分含量、轉(zhuǎn)移率等數(shù)據(jù)，為建立大秦艽湯的質(zhì)量控制標準提供參考。依據(jù)古方要求還原至現(xiàn)代煎煮方式制備大秦艽湯標準煎液。采用島津Inertsil ODS-3 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為237 nm；進樣量為10 μL。建立10批大秦艽湯HPLC指紋圖譜，使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012A版）進行相似度分析，最后對共有峰進行鑒定和藥材歸屬，并定量測定大秦艽湯中馬錢苷酸、龍膽苦苷、升麻素苷的含量。建立了10批大秦艽湯的指紋圖譜，相似度介于0.902～0.953，確認36個共有峰，指認出7、15、18～21、23、27、31、33、35號峰分別為馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷、升麻素苷、阿魏酸、甘草苷、5--甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、黃芩素、甘草酸、漢黃芩素共11個成分；其中4～8、10～12、15號峰歸屬于秦艽，19、23號峰歸屬于防風(fēng)，17、18號峰歸屬白芍，30號峰歸屬于獨活，21、25、33號峰歸屬于甘草，22、27～29、35號峰歸屬于黃芩，1號峰歸屬于當(dāng)歸和獨活，2號峰歸屬于秦艽、當(dāng)歸和細辛，3號峰歸屬于川芎和白芍，13號峰歸屬于甘草和獨活，16號峰歸屬于秦艽和白芍，20號峰歸屬于川芎、當(dāng)歸和羌活；以馬錢苷酸、龍膽苦苷、升麻素苷3項指標建立其質(zhì)量控制標準，10批次樣品中馬錢苷酸、龍膽苦苷、升麻素苷質(zhì)量分數(shù)分別為0.158～0.103、0.475～0.373、0.029～0.012 mg/g。所建立的湯劑制備方法穩(wěn)定可行，質(zhì)量控制方法簡單、專屬性強，結(jié)果準確，可用于大秦艽湯的質(zhì)量評價。

大秦艽湯；經(jīng)典名方；HPLC；指紋圖譜；質(zhì)量控制；馬錢苷酸；龍膽苦苷；芍藥苷；5--甲基維斯阿米醇苷；升麻素苷；阿魏酸；甘草苷；黃芩苷；黃芩素；甘草酸；漢黃芩素

經(jīng)典名方是有著悠久的藥用歷史、確切的臨床療效及目前仍廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)中藥方劑。2018年5月，國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑簡化注冊審批管理規(guī)定》明確了經(jīng)典名方復(fù)方制劑開發(fā)的研究原則，經(jīng)典名方復(fù)方制劑開發(fā)必須首先進行物質(zhì)基準研究，為其后的制劑開發(fā)提供依據(jù)。由此可見，建立經(jīng)典名方的質(zhì)量控制評價方法是其制劑開發(fā)的基礎(chǔ)。

大秦艽湯（Daqinjiao Decoction）入選為國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》的方劑，出自金朝劉完素《素問病機氣宜保命集》，初刊于公元1251年[1]。書中處方原文內(nèi)容為“秦艽三兩，甘草二兩，川芎二兩，當(dāng)歸二兩，白芍藥二兩，細辛半兩，川羌活、防風(fēng)、黃芩各一兩，石膏二兩，吳白芷一兩，白術(shù)一兩，生地黃一兩，熟地黃一兩，白茯苓一兩，川獨活二兩。右十六味剉，每服一兩。”確定大秦艽湯為16味中藥組成的中藥煮散劑[2]。查閱關(guān)于金元時期經(jīng)方劑量問題研究[3]及《中藥臨床處方用量控制》[4]進行劑量折算，確定金代的一兩為41.25 g。

該方以祛風(fēng)散邪為主，兼以補血、活血、益氣、清熱的藥物，疏養(yǎng)結(jié)合，邪正兼顧，共同發(fā)揮祛風(fēng)清熱、養(yǎng)血通絡(luò)的功效，主治風(fēng)邪初中經(jīng)絡(luò)證[5]而現(xiàn)代臨床多用于治療中風(fēng)先兆、中風(fēng)[6]、腦梗死[7]、腦血管出血性后遺癥[8]等腦血管疾病及痛風(fēng)性、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[9]，配合西藥治療周圍性面神經(jīng)麻痹[10]，聯(lián)合小針刀治療肩周炎[11]。

目前，關(guān)于大秦艽湯的研究較少且多是藥理作用與臨床應(yīng)用方面，未見其質(zhì)量控制方面的報導(dǎo)。由于本方中藥味比較多，藥材的產(chǎn)地、批次均有差別，使煎液質(zhì)量不穩(wěn)定影響其臨床療效，故需要有能反映大秦艽湯化學(xué)成分的整體性、復(fù)雜性及其質(zhì)量差異的質(zhì)量控制方法。本研究以古籍記載的煎煮方法為依據(jù)，用3個不同產(chǎn)區(qū)，每個產(chǎn)區(qū)各5批藥材，共15批藥材隨機組合，采用HPLC法建立大秦艽湯標準煎液指紋圖譜，并建立外標法測定龍膽苦苷，馬錢苷酸及升麻素苷的含量，以達到更好控制大秦艽湯標準煎液的質(zhì)量。

1 儀器與材料

Waters e2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司，配備四元泵、柱溫箱、自動進樣器、2998二極管陣列檢測器、empower 3色譜工作站；DFY-200C高速搖擺多功能粉碎機，溫嶺市大德中藥機械有限公司；SQP電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；ME104電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JJ500分析電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；KQ-300DZ超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；HWS26恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；H1650-W臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

對照品馬錢苷酸（批號111865-201704，質(zhì)量分數(shù)為97.4%）、龍膽苦苷（批號110770-201716，質(zhì)量分數(shù)為97.6%）、升麻素苷（批號111522- 201712，質(zhì)量分數(shù)為96.2%）、芍藥苷（批號110736- 201741，質(zhì)量分數(shù)為95.7%）、阿魏酸（批號110773- 201614，質(zhì)量分數(shù)為99.0%）、甘草苷（批號111610- 201607，質(zhì)量分數(shù)為93.1%）、甘草酸銨（批號110731-201619，質(zhì)量分數(shù)為96.2%）、黃芩苷（批號110715-200212，質(zhì)量分數(shù)為96.2%）、黃芩素（批號111595-201607，質(zhì)量分數(shù)為96.2%）、漢黃芩素（批號111514-201605，質(zhì)量分數(shù)為96.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品5--甲基維斯阿米醇苷（批號CHB160903，質(zhì)量分數(shù)為98.0%）購自成都克洛瑪生物科技有限公司。甲醇、乙腈，色譜純，質(zhì)量分數(shù)99.9%，瑞典Oceanpak公司；冰乙酸，色譜純，質(zhì)量分數(shù)99.9%，上海麥克林生化科技有限公司；磷酸，色譜純，質(zhì)量分數(shù)99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水為蒸餾水，屈臣氏集團有限公司；其余試劑均為分析純。

大秦艽湯中各藥材均產(chǎn)自3個產(chǎn)地，信息見表1，經(jīng)廣東藥科大學(xué)劉基柱教授鑒定，各藥材均符合《中國藥典》2020年版一部相關(guān)項下的性狀規(guī)定，鑒定結(jié)果依次為秦艽為龍膽科龍膽屬植物秦艽Pall.的干燥根，川芎為傘形科藁本屬植物川芎Hort.的干燥根莖，獨活為傘形科當(dāng)歸屬植物重齒毛當(dāng)歸Maxim. f.Shan et Yuan的干燥根，當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels的干燥根，白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥Pall.的干燥根，石膏為硫酸鹽類礦物硬石膏族石膏，甘草為豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根，羌活為傘形科羌活屬植物羌活Ting ex H. T. Chang.的干燥根莖及根，防風(fēng)為傘形科防風(fēng)屬植物防風(fēng)(Turcz.) Schischk.的干燥根，白芷為傘型科當(dāng)歸屬植物白芷(Fisch. ex Hoffm. ) Benth. et Hook. f.的干燥根，黃芩為唇形科黃芩屬植物黃芩Georgi的干燥根，白術(shù)為菊科蒼術(shù)屬植物白術(shù)Koidz.的干燥根莖，茯苓為多孔菌科茯苓屬真菌茯苓(Schw.) Wolf的干燥菌核，生地黃為玄參科地黃屬植物地黃Libosch.的干燥塊根，熟地黃為生地黃的炮制加工品，細辛為馬兜鈴科細辛屬植物北細辛Fr. Schmidt var.(Maxim.) Kitag.的干燥全草。

表1 10批次大秦艽湯中藥材的產(chǎn)地信息

2 方法

2.1 大秦艽湯的制備

將表1中3個產(chǎn)地，15味藥材隨機取樣組合成S1～S10，共10個不同批次的大秦艽湯方劑。取秦艽10.54 g，甘草7.02 g，川芎7.02 g，當(dāng)歸7.02 g，白芍藥7.02 g，細辛1.76 g，羌活、防風(fēng)、黃芩各3.51 g，石膏7.02 g，白芷3.51 g，白術(shù)3.51 g，生地黃3.51 g，熟地黃3.51 g，茯苓3.51 g，獨活7.02 g。制得二號篩（24目）粗粉末樣品，加水1000 mL，浸泡10 min，包煎，先武火，沸騰后轉(zhuǎn)文火煎煮至藥液體積80%，擠渣，60 ℃條件下恒溫減壓干燥，研細，即得干粉樣品。

2.2 指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件 色譜柱為島津Inertsil ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，9%～10%乙腈；5～10 min，10%～11%乙腈；10～22 min，11%～15%乙腈；22～30 min，15%～17%乙腈；30～34 min，17%～20%乙腈；34～42 min，20%～27%乙腈；42～53 min，27%乙腈；53～60 min，27%～32%乙腈；60～90 min，32%～74%乙腈；檢測波長為237 nm；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量10 μL。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取0.4 g樣品干粉，置于具塞錐形瓶中，加甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲（500 W，40 kHz）處理30 min，放至室溫，補足減失的質(zhì)量，5000 r/min離心（離心半徑62 mm）離心10 min，取上清液，過0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.2.3 對照品溶液制備 精密稱取馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷、升麻素苷、阿魏酸、甘草苷、5--甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨、漢黃芩素對照品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇制成分別含1.022、1.010、1.079、1.020、1.067、1.016、1.028、1.030、1.038、1.024、1.040 mg/mL的對照品溶液。

2.2.4 精密度試驗 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液（S1）1份，按“2.2.1”項下色譜條件測定，分別連續(xù)平行進針6次，記錄色譜圖。除去溶劑峰的影響，以龍膽苦苷色譜峰為參照（S），計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0～0.20%和0～2.94%，均＜5%，結(jié)果說明儀器精密度良好，符合要求。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液（S1）1份，按“2.2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24 h時測定，記錄色譜圖。除去溶劑峰的影響，以龍膽苦苷色譜峰為參照，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0～0.42%和0～2.74%，均＜3%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合要求。

2.2.6 重復(fù)性試驗 取同一批樣品S1干粉，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，分別測定，記錄色譜圖。除去溶劑峰的影響，以龍膽苦苷色譜峰為參照，計算各共有峰相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD分別為0～1.99%和0～2.75%，均＜3%，說明該方法重復(fù)性良好，符合要求。

2.2.7 指紋圖譜的建立 根據(jù)中藥經(jīng)典名方復(fù)方制劑開發(fā)的要求，使用3個不同產(chǎn)地藥材，每個產(chǎn)地5批，共15個不同批次的藥材進行隨機組合成10劑藥方，按“2.2.2”項下方法分別制備10批大秦艽湯（干粉）樣品S1～S10，再按“2.2.1”項下色譜條件分別測定，記錄HPLC圖，見圖1。

圖1 10批大秦艽湯樣品HPLC指紋圖譜及對照指紋圖譜(R)

利用中藥指紋圖譜相似度系統(tǒng)評價軟件（2012A）對“2.2.7”項下制得大秦艽湯樣品S1～S10的HPLC色譜圖進行分析。以S1樣品圖譜為參照圖譜，時間窗為0.1 min，采用平均數(shù)法、經(jīng)多點校正進行峰匹配，生成對照指紋圖譜（R），結(jié)果見圖1，進行相似度計算，結(jié)果見表2。

2.2.8 主要色譜峰的鑒定 分別取“2.2.3”項下各對照品儲備液適量，加甲醇分別稀釋成一定質(zhì)量濃度的對照品稀釋液，在相同的色譜條件下進樣，將生成的色譜峰與大秦艽湯S1樣品指紋圖譜相應(yīng)峰進行對比。如圖2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7、15、18～21、23、27、31、33、35號色譜峰分別與各對照品峰相對應(yīng)，其紫外光譜也分別相吻合。因此，大秦艽湯樣品指紋圖譜中7、15、18～21、23、27、31、33、35號峰分別鑒定為馬錢苷酸、龍膽苦苷、芍藥苷、升麻素苷、阿魏酸、甘草苷、5--甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨、漢黃芩素。

表2 10批大秦艽湯樣品相似度比較

7-馬錢苷酸 15-龍膽苦苷 18-芍藥苷 19-升麻素苷 20-阿魏酸 21-甘草苷 23-5-O-甲基維斯阿米醇苷 27-黃芩苷 31-黃芩素 33-甘草酸銨 35-漢黃芩素

2.2.9 主要色譜峰的歸屬 分別制備秦艽、甘草、川芎、當(dāng)歸、白芍、石膏、獨活、羌活、防風(fēng)、黃芩、白芷、白術(shù)、生地黃、熟地黃、茯苓、細辛各單味藥樣品，缺秦艽、缺甘草、缺川芎、缺當(dāng)歸、缺白芍、缺石膏、缺獨活、缺羌活、缺防風(fēng)、缺黃芩、缺白芷、缺白術(shù)、缺生地黃、缺熟地黃、缺茯苓、缺細辛的陰性樣品，分別制備各單味藥樣品溶液和各陰性樣品溶液，在相同的色譜條件下進樣，并與大秦艽湯S1樣品指紋圖譜進行對比分析。如圖3、4，以各峰保留時間、紫外光譜圖為鑒定標準，進行色譜峰的指認。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4～8、10～12、15號色譜峰為秦艽的特征峰，19、23號色譜峰為防風(fēng)的特征峰，17、18號色譜峰為白芍的特征峰，30號色譜峰為獨活的特征峰，21、25、33號色譜峰為甘草的特征峰，22、27～29、35號色譜峰為黃芩的特征峰，1號色譜峰為當(dāng)歸和獨活所共有，2號色譜峰為秦艽、當(dāng)歸和細辛所共有，3號色譜峰為川芎和白芍所共有，13號色譜峰為甘草和獨活所共有，16號峰為秦艽和白芍所共有，20號峰為川芎、當(dāng)歸和羌活所共有。

2.3 大秦艽湯標準煎液中指標成分馬錢苷酸、龍膽苦苷和升麻素苷的轉(zhuǎn)移率及含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為島津Inertsil ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫程序見表3；檢測波長為237 nm；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量10 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 取馬錢苷酸、龍膽苦苷、升麻素苷適量，精密稱定，加甲醇分別制成含馬錢苷酸1.026 mg/mL、龍膽苦苷2.489 mg/mL和升麻素苷1.050 mg/mL的對照品儲備液。分別精密吸取馬錢苷酸、龍膽苦苷、升麻素苷各儲備液2.0、4.0、0.2 mL，加甲醇定容至10 mL量瓶，制得混合對照品稀釋液，搖勻，備用。

D1-大秦艽湯樣品 D2-缺秦艽陰性樣品 D3-缺甘草陰性樣品 D4-缺川芎陰性樣品 D5-缺當(dāng)歸陰性樣品 D6-缺白芍陰性樣品 D7-缺石膏陰性樣品 D8-缺獨活陰性樣品 D9-缺羌活陰性樣品 D10-缺防風(fēng)陰性樣品 D11-缺黃芩陰性樣品 D12-缺白芷陰性樣品 D13-缺白術(shù)陰性樣品 D14-缺生地黃陰性樣品 D15-缺熟地黃陰性樣品 D16-缺茯苓陰性樣品 D17-缺細辛陰性樣品

A1-大秦艽湯樣品 A2-秦艽單味樣品 A3-甘草單味樣品 A4-川芎單味樣品 A5-當(dāng)歸單味樣品 A6-白芍單味樣品 A7-石膏單味樣品 A8-獨活單味樣品 A9-羌活單味樣品 A10-防風(fēng)單味樣品 A11-黃芩單味樣品 A12-白芷單味樣品 A13-白術(shù)單味樣品 A14-生地黃單味樣品 A15-熟地黃單味樣品 A16-茯苓單味樣品 A17-細辛單味樣品

表3 流動相梯度

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取0.4 g樣品干粉，置于具塞錐形瓶中，加甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲（500 W、40 kHz）處理30 min，放至室溫，補足減失的質(zhì)量，5000 r/min離心（離心半徑為62 mm）10 min，取上清液，過0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.3.2”項下混合對照品稀釋液各0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于1 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得稀釋10、5、2.5、1.67、1.25、1倍系列對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，得峰面積積分值，以質(zhì)量濃度為橫坐標（），對照品峰面積積分值為縱坐標（），并繪制標準曲線，建立回歸方程，結(jié)果分別為馬錢苷酸＝6 860.7－24 681，2＝0.999 8，線性范圍20.52～205.2 μg/mL；龍膽苦苷＝11 759－199 787，2＝0.999 4，線性范圍99.56～995.6 μg/mL；升麻素苷＝20 760－ 9 227.4，2＝0.999 5，線性范圍2.10～21.00 μg/mL。

2.3.5 精密度試驗 按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液1份，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，連續(xù)進樣6次，測定馬錢苷酸、龍膽苦苷和升麻素苷的峰面積，計算峰面積RSD。結(jié)果顯示，馬錢苷酸、龍膽苦苷和升麻素苷的峰面積RSD分別為0.25%、0.24%、0.96%，表明儀器精密度良好，符合要求。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液1份，按“2.3.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，測定馬錢苷酸、龍膽苦苷和升麻素苷的峰面積，計算峰面積RSD。結(jié)果顯示，馬錢苷酸、龍膽苦苷和升麻素苷的峰面積RSD分別為0.58%、0.39%、0.55%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批大秦艽湯S1干粉6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，測定馬錢苷酸、龍膽苦苷和升麻素苷的峰面積，分別計算3種成分的質(zhì)量分數(shù)和RSD。結(jié)果顯示，馬錢苷酸、龍膽苦苷和升麻素苷的質(zhì)量分數(shù)RSD分別為1.82%、1.22%、2.80%，表明此方法的重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取同一批大秦艽湯S1干粉6份，每份約0.2 g，精密稱定，分別精密加入對照品馬錢苷酸、龍膽苦苷和升麻素苷相當(dāng)于樣品中各成分含量的100%，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果顯示，馬錢苷酸、龍膽苦苷和升麻素苷的平均加樣回收率分別為99.97%、97.43%、91.27%，RSD分別為2.75%、0.69%、1.97%，表明此方法的準確度良好。

2.3.9 出膏率 測定10批大秦艽湯的出膏率，即大秦艽湯干粉質(zhì)量（2）與藥材總質(zhì)量（1）的比值。

出膏率＝2/1

2.3.10 指標成分的含量分數(shù)及轉(zhuǎn)移率測定 對10批大秦艽湯干粉按“2.3.1”項含量測定所建立的質(zhì)量評價方法進行指標成分含量測定，并計算指標成分轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表4。

轉(zhuǎn)移率＝湯劑中含量/藥材中含量

表4 10批大秦艽湯出膏率及含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 大秦艽湯標準煎液的制備工藝探討

大秦艽湯標準煎液的制備工藝需要以古籍記載的煎煮方法為依據(jù)，參考《中藥精準煮散飲片》[12]考察了飲片粉碎粒度（0.7、5 mm粒度）、浸泡時間（5、10、15、20 min）以及加水量（800、1000、1200 mL）[13]。結(jié)果顯示，5 mm粒度粗末樣品的出膏率、指標成分的轉(zhuǎn)移率均低于二號篩（24目）粗末樣品，浸泡10 min飲片基本處于吸水飽和狀態(tài)，指標成分轉(zhuǎn)移率及出膏率在加水量至1000 mL時達到最大值。故最終確定大秦艽湯標準煎液的制備工藝為飲片制得二號篩（24目）粗末樣品，加水1000 mL，浸泡10 min，包煎，先武火，沸騰后轉(zhuǎn)文火煎煮至藥液體積80%，擠渣即得[14]。

3.2 指標成分確定

本方共有16味中藥組成，根據(jù)中藥復(fù)方君、臣、佐、使的配伍原則，優(yōu)先選擇方中君藥（秦艽）及臣藥（羌活、獨活、防風(fēng)）的指標成分作為質(zhì)量控制的指標[15]。馬錢苷酸和龍膽苦苷屬于環(huán)烯醚萜苷類成分，環(huán)烯醚萜苷類成分是秦艽的主要活性成分及質(zhì)量評價指標[16]，具有抗炎[17]、鎮(zhèn)痛作用；升麻素苷和5--甲基維斯阿米醇苷屬于色原酮類成分，色原酮類成分是防風(fēng)的主要活性成分及質(zhì)量評價指標[18]，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎藥理作用。同時結(jié)合大秦艽湯現(xiàn)代臨床功效針對腦血管疾病及痛風(fēng)性、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、面神經(jīng)麻痹方面。選擇方中君藥秦艽環(huán)烯醚萜苷類成分龍膽苦苷、馬錢苷酸和臣藥防風(fēng)色原酮類成分升麻素苷成分作為評價指標。

3.3 指紋圖譜相似度

本研究建立10批大秦艽湯的指紋圖譜，進行共有峰標定和相似度評價[19]。結(jié)果10批樣品共有峰有36個，相對保留時間RSD為0.05%～0.35%，相對峰面積RSD為4.69%～59.69%，相似度為0.902～0.953，說明10批大秦艽湯之間存在較多共有成分，但共有成分含量差異較大，可能原因與各藥味確定了相同的基原但來源于3個不同產(chǎn)地共15個批次藥材，共有成分相似但各批號產(chǎn)地間含量存在差異，最終導(dǎo)致相對峰面積RSD差異較大有關(guān)。

根據(jù)中藥經(jīng)典名方新藥開發(fā)政策的相關(guān)要求，進行大秦艽湯質(zhì)量控制研究[20]，據(jù)古方要求還原至現(xiàn)代煎煮方式，制備了10批大秦艽湯標準煎液，建立其HPLC指紋圖譜并計算指標成分含量和轉(zhuǎn)移率，為后續(xù)建立經(jīng)典名方大秦艽湯的質(zhì)量控制標準提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 邊文靜. 《素問病機氣宜保命集》作者與學(xué)術(shù)思想研究 [D].石家莊: 河北醫(yī)科大學(xué), 2011.

[2] 傅延齡, 宋佳, 張林. 宋政府推廣普及煮散劑的原因 [J]. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 21(1): 88-90.

[3] 宋延強. 金元四大家對經(jīng)方50味常用藥物的臨床用量研究 [D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué), 2011.

[4] 傅延齡, 王倩, 王振宇. 論中藥臨床處方用量控制 [J]. 中醫(yī)雜志, 2015, 56(16): 1351-1354.

[5] 魯賽, 楊楨, 胡紅林, 等. 從“中風(fēng)”探討大秦艽湯證治內(nèi)涵 [J]. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 21(2): 143-144.

[6] 洪霞. 大秦艽湯加減治療急性缺血性中風(fēng)的臨床研究 [D].北京: 中國中醫(yī)科學(xué)院, 2012.

[7] 李華興, 劉愛武, 丘偉賢, 等. 阿替普酶與大秦艽湯治療急性腦梗死療效研究 [J]. 北方藥學(xué), 2019, 16(10): 86-87.

[8] 陳琳, 徐守宇. 大秦艽湯聯(lián)合早期綜合康復(fù)治療腦卒中后上肢痙攣性癱瘓臨床觀察 [J]. 新中醫(yī), 2018, 50(7): 68-71.

[9] 李昌勤, 張倩, 康文藝. 大秦艽湯臨床應(yīng)用概述 [J]. 中成藥, 2010, 32(6): 1029-1032.

[10] 郭冬麗, 周哲屹, 徐宏, 等. 大秦艽湯聯(lián)合西藥治療周圍性面神經(jīng)麻痹 [J]. 吉林中醫(yī)藥, 2019, 39(8): 1044-1047.

[11] 張志剛. 分析小針刀聯(lián)合大秦艽湯加減治療肩周炎患者的臨床療效 [J]. 名醫(yī), 2018(11): 226.

[12] 陳士林, 黃志海, 丘小惠, 等. 中藥精準煮散飲片 [J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2016, 18(9): 1430-1440.

[13] 楊蓉, 鄭虎占. 中藥煎煮法的現(xiàn)代研究概況 [J]. 中國醫(yī)藥科學(xué), 2012, 2(17): 44-46.

[14] 邢丹, 賀瑩, 鄭虎占. 從《太平惠民和劑局方》論中藥煮散技術(shù)規(guī)范 [J] . 中國臨床醫(yī)生, 2012, 40(11): 73-75.

[15] 唐慧青, 滕晶, 劉麗麗, 齊向華. 論大秦艽湯的病機新探 [J]. 四川中醫(yī), 2015, 33(2): 47-48.

[16] 聶安政, 林志健, 王雨, 等. 秦艽化學(xué)成分及藥理作用研究進展 [J]. 中草藥, 2017, 48(3): 597-608.

[17] 趙勤, 胡銳, 葛明娟, 等. 大秦艽湯抗炎作用研究 [J]. 中藥藥理與臨床, 2012, 28(3): 21-22.

[18] 劉雙利, 姜程曦, 趙巖, 等. 防風(fēng)化學(xué)成分及其藥理作用研究進展 [J]. 中草藥, 2017, 48(10): 2146-2152.

[19] 關(guān)洪月, 李林, 劉曉, 等.中藥指紋圖譜相似度計算方法探析 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2011, 17 (18): 282-287.

[20] 李艷, 白明, 宋亞剛, 等.中藥標準湯劑的研究與思考 [J]. 中草藥, 2018, 49(17): 3977-3980.

HPLC fingerprint and content determination method of classical prescriptions Daqinjiao Decoction

LI Hai-lun1, 2, 3,LI Heng1, 2, 3,SUN Fei1, 2, 3,XIE Yuan-yuan1, 2, 3,LIANG Sheng-wang1, 2, 3,WANG Shu-mei1, 2, 3

1. School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China 2. Research Center for Traditional Chinese Medicine Quality Engineering Technology in Guangdong Universities, Guangzhou 510006, China 3. State Administration of Traditional Chinese Medicine Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Digitalization Quality Evaluation, Guangzhou 510006, China

To establish fingerprints and calculate index component content, transfer rate and other data of 10 batches of Daqinjiao Decoction (DD) by HPLC, in order to provide reference for establishing the quality control standard of DD.According to the requirements of the ancient recipe, the standard decoction of DD was prepared by the modern decoction method. Using Shimadzu inertsil ODS-3 C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) for gradient elution with acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution; Flow rate 1.0 mL/min, column temperature 30 ℃, and detection wavelength 237 nm; The injection volume is 10 μL.The HPLC fingerprint of 10 batches of DD were established and evaluated by the similarity evaluation system of the Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation system software (version 2012A), identify and assign the common peaks, and quantitatively determine the content of loganic acid, gentiopicroside, and prim--glucosylcimifugin in DD.HPLC fingerprint of 10 batches of DD were established. The similarity was ranged from 0.902 to 0.953 and 36 commonpeaks were identified as 11 chemical components: loganic acid, gentiopicroside, paeoniflorin, prim--glucosylcimifugin, ferulic acid, liquiritin, 4--beta-glucopyranosyl-5--methylvisamminol, baicalin, baicalein, glycyrrhizic acid, and wogonin (corresponding to peaks 7, 15, 18, 19, 20, 21, 23, 27, 31, 33, and 35), peaks 4—8, 10—12, and 15 belonged to(GMR), peaks 19 and 23 belonged to(SR), peaks 17 and 18 belonged to(PRA), peak 30 belonged to(APR), peaks 21, 25, and 33 belonged toet(GRR), peaks 22, 27—29, and 35 belonged to, peak 1 belonged to(ASR) and APR, peak 2 belonged to GMR, ASR andet(ARR), peak 3 belonged to(CR) and PRA, peak 13 belonged to GRR and APR, peak 16 belonged to GMR and PRA, peak 20 belonged to CR, ASR andet(NRR). Among them, three indicators of loganic acid, gentiopicroside and prim--glucosylcimifugin were used to establish theirs quality control standards, the results of content determination respectively were 0.158—0.103, 0.475—0.373, and 0.029—0.012 mg/g.The preparation method of established decoction is stable and feasible, and the quality control method is simple, specific and accurate. It can be used for the quality evaluation of DD.

Daqinjiao Decoction; classical prescriptions; HPLC; fingerprint; quality control; loganic acid; gentiopterin; paeoniflorin; 4--beta-glucopyranosyl-5--methylvisamminol; prim--glucosylcimifugin; ferulic acid; liquiritin; baicalin; baicalein; glycyrrhizic acid; wogonin

R286.02

A

0253 - 2670(2021)01 - 0099 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.013

2020-08-14

國家自然科學(xué)基金面上項目（81773884）；神威藥業(yè)經(jīng)典名方《大秦艽湯》基準物質(zhì)研究（2017HSW-KF121）；十三五重大新藥創(chuàng)制（2017ZX09301077）

李海倫，碩士，研究方向為中藥質(zhì)量分析與評價。Tel: 17818528462 E-mail: 1060020768@qq.com

王淑美，博士，教授，研究方向為中藥質(zhì)量控制。Tel: (020)39352173 E-mail: 2395903468@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]