王玨磊，南壽山，王柏清，王超，李朝霞，竇廣仙，孫光斌，天津市第五中心醫(yī)院消化內科 天津市 300450

0 引言

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是一種常見的慢性進行性消化系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為胃內容物反流而引起的不適癥狀或并發(fā)癥.近些年，GERD的發(fā)病率在世界范圍內呈上升趨勢[1，2].一項基于全球范圍內GERD發(fā)病率的系統(tǒng)性回顧分析顯示，北美發(fā)病率為18.1%-27.8%，歐洲8.8%-25.9%，東亞2.5%-7.8%，中東8.7%-33.1%，澳大利亞11.6%，南美23.0%[3].我國因上消化道癥狀于消化科門診就診的GERD患者占13%[4].

GERD的診斷主要依賴于上消化道內鏡檢查、食管高分辨測壓、食管24 h pH-阻抗監(jiān)測等[5].GERD典型癥狀為反酸、燒心，常伴有胸痛、噯氣、惡心、吞咽困難等，亦可伴有食管外癥狀如胸痛、咳嗽、哮喘、喉炎、牙蝕癥等，常見的并發(fā)癥為反流性食管炎、消化道出血、消化道狹窄、Barrett食管和腺癌[6].GERD的危險因素復雜，可大致分為環(huán)境因素和遺傳因素，包括吸煙、飲酒、幽門螺桿菌感染、心理因素、肥胖、年齡、性別、基因突變等[7-9].

質子泵抑制劑(proton pump inhibitors，PPIs)是臨床上用于GERD治療的主要藥物，其中奧美拉唑、蘭索拉唑、泮托拉唑等第一代PPIs，通過抑制胃壁上分泌胃酸的質子泵發(fā)揮抑酸作用，經(jīng)肝臟中CYP2C19代謝后，血藥濃度逐漸降低[10].既往研究表明，CYP2C19基因具有高度多態(tài)性，已發(fā)現(xiàn)超過25個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)[11].CYP2C19基因多態(tài)性與藥物代謝能力相關，顯著影響PPIs如奧美拉唑、蘭索拉唑、泮托拉唑等，抗血小板藥物氯吡格雷和部分抗抑郁藥物的療效和安全性[11-14].CYP2C19基因分型不同的患者，其PPIs的藥代動力學改變較大，進而影響了GERD的治療[15].中國人群中CYP2C19基因多態(tài)性位點主要包括*2 (G681A)、*3 (G636A)，這兩個突變位點均可導致CYP2C19酶活性降低；沒有突變的野生型以*1表示.按照藥物代謝動力學特征，不同基因型對應的代謝類型分別為正常代謝型(*1/*1；normal metabolizers，NMs)，中間代謝型(*1/*2，*1/*3；intermediate metabolizers，IMs)，慢代謝型(*2/*2，*2/*3，*3/*3；poor metabolizers，PMs)[16].但是在臨床上，我們發(fā)現(xiàn)部分正常代謝型GERD患者，經(jīng)PPIs診斷性治療后效果不明顯，說明可能還有其他因素發(fā)揮作用.

基因啟動子區(qū)是控制基因表達的重要調控元件；CYP2C19啟動子區(qū)如發(fā)生基因變異，可能影響基因表達，進而改變其生物學功能.在本研究中，我們將篩選正常代謝型GERD患者CYP2C19基因啟動子區(qū)的潛在變異，并在細胞水平驗證基因變異對CYP2C19啟動子功能的影響，進而分析CYP2C19啟動子區(qū)功能改變與GERD患者經(jīng)PPI治療效果的相關性，為中國人群中GERD患者的臨床用藥和治療提供了新的思路.

1 材料和方法

1.1 材料 研究對象：收集2019-01/2020-06來我院治療的經(jīng)胃鏡或24 h食管pH-阻抗監(jiān)測確診的散發(fā)性GERD患者全血163例，經(jīng)奧美拉唑2倍劑量治療2 wk，按燒心癥狀的嚴重程度及頻率評分.其中實驗組患者經(jīng) PPIs診斷性治療后，癥狀積分降低＞50%，癥狀未完全消失(n=82)；對照組患者治療后癥狀完全消失(n=81).全部患者CYP2C19基因型經(jīng)檢測為*1/*1，并按照種族、性別和年齡進行匹配.本研究方案符合《赫爾辛基宣言》的原則，經(jīng)天津市第五中心醫(yī)院人類倫理委員會批準，所有受試者均獲得知情同意.

1.2 方法 DNA序列分析及基因變異篩選：按照BloodZol試劑盒(北京全式金生物科技有限公司)說明書操作，從全部樣本的外周血淋巴提取細胞基因組DNA.參考NCBI中從人類CYP2C19基因序列(NCBI，NC_000010.11)，設計PCR引物，擴增CYP2C19基因啟動子區(qū)(1665bp)；PCR產(chǎn)物經(jīng)ABI 3730基因分析儀進行Sanger測序分析并篩選基因變異.擴增和測序用引物序列在表1中.

1.3 細胞轉染和雙熒光素酶報告基因檢測 將CYP2C19基因啟動子片段(野生型/變異型)克隆到螢火蟲熒光素酶報告基因載體pGL3 basic，并分別轉染HEK 293T細胞；作為內參質粒，表達海腎素熒光素酶的載體pRL-TK同時進行共轉染.細胞轉染48 h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京全式金生物科技有限公司)操作說明，檢測螢火蟲和海腎熒光素酶的熒光值.

統(tǒng)計學處理以測定的螢火蟲螢光素酶熒光值除以海腎螢光素酶的熒光值，得到相對熒光值來反映CYP2C19基因啟動子的轉錄活性，所有的實驗均獨立進行3次.數(shù)據(jù)采用非配對t檢驗進行處理和分析，P值小于0.05被認為具有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 3個新的基因變異被發(fā)現(xiàn) 本研究從3例實驗組GERD患者CYP2C19基因(*1/*1)啟動子序列中分別篩查并發(fā)現(xiàn)了3個新發(fā)雜合變異，g.94761364 T＞A，g.94762112 T＞A和 g.94762514 G＞T，Sanger測序峰圖如圖1所示；對照組中沒有發(fā)現(xiàn)基因變異.經(jīng)NCBI dbSNP和PubMed數(shù)據(jù)庫搜索比對，這3個基因變異均未曾報道過.

2.2 雙熒光素酶報告基因檢測 為了研究CYP2C19啟動子區(qū)的3個基因變異對其轉錄活性的影響，我們構建了表達載體pGL3 basic-CYP2C19啟動子(野生型/變異型)，并與內參質粒pRL-TK分別共轉染到HEK 293T細胞中，48 h后檢測雙熒光素酶的相對熒光值，分別為pGL3-basic (0.31)；pGL3-CYP2C19 (4.21)；pGL3-94761364A(4.47)；pGL3-94762112A (3.97)；pGL3-94762514T (3.89)，用于評價CYP2C19啟動子的轉錄活性.結果如圖2所示，攜帶基因變異的CYP2C19啟動子的活性均受到影響；其中攜帶94761364A變異位點的CYP2C19啟動子，與野生型相比，其活性顯著升高(P=0.034).

3 討論

GERD是一種多因素疾病，發(fā)病機制復雜.隨著高通量測序技術的快速發(fā)展和測序成本的降低，通過測序直接分析GERD的遺傳因素成為可能，越來越多與GERD發(fā)病相關的基因多態(tài)性或變異被發(fā)現(xiàn)[17].

表1 用于PCR和Sanger測序的引物序列

圖2 pGL3-CYP2C19啟動子(野生型/變異型)的相對熒光素酶活性.aP＜0.05.

近期研究表明，人的GNB3基因發(fā)生突變后，將通過介導食管初級傳入纖維末梢和中心對內臟刺激的反應，從而提高食管黏膜對胃酸的敏感性，可能成為GERD易感人群[18].白細胞介素-1 (IL-1)基因多態(tài)性及其單倍型與GERD的發(fā)生密切相關，GERD患者中IL-1基因TCCL單體型頻率明顯高于對照組(P=0.016)；同時，GERD患者與對照組之間IL-1RN 1/2基因型差異有統(tǒng)計學意義[19].Lam發(fā)現(xiàn)FOXF1 rs9936833 (C allele)和MHC rs9257809 (A allele)的基因多態(tài)性與胃酸反流的存在相關性，有可能是一個潛在的遺傳水平的GERD發(fā)病機制[20].BARX1基因和ADAMTS17基因在食管分化中起重要作用，Argyrou對來自希臘人群的160名GERD患者和180名健康對照受試者進行了前瞻性隊列研究，發(fā)現(xiàn)了BARX1和ADAMTS17基因多態(tài)性(rs11789015和rs4965272)與GERD的發(fā)生發(fā)展顯著相關[21].

細胞色素P450酶系(CYP450)對目前臨床廣泛使用的約70-80%的藥物代謝起重要作用.CYP2C19作為重要的藥物代謝酶，是CYP450超家族成員之一，參與約10%藥物的體內代謝[22，23].CYP2C19基因多態(tài)性顯著影響許多藥物的療效和安全性.例如，BMS-823778是治療2型糖尿病的潛在候選藥物，CYP2C19基因多態(tài)性顯著影響該藥物的在生物體內的代謝途徑[13].CYP2C19基因型與氯吡格雷的抗凝作用密切有關，部分患者(*2/*2，*2/*3，*3/*3) 服用常規(guī)劑量氯吡格雷后會發(fā)生血栓性心血管不良事件；因此，對于經(jīng)皮冠狀動脈介入治療合并藥物洗脫支架植入術后的冠狀動脈疾病患者，在使用氯吡格雷藥物前，對患者進行CYP2C19基因多態(tài)性檢測，并指導其調整用藥劑量，具有重要的臨床意義[24].

CYP2C19基因型與大多數(shù)主要通過CYP2C19代謝為非活性代謝物的PPIs的使用劑量、療效和副作用密切相關.利用CYP2C19基因型數(shù)據(jù)指導PPI治療的潛在好處包括：(1)通過基因型預測較低血藥濃度的患者，為其開出更高劑量的處方，從而增加療效的可能性；(2)通過基因型預測較高血藥濃度的慢性治療患者，為其開出低劑量的處方，以盡量減少與長期使用PPIs相關的毒性風險[25].

在本研究中，我們分別在3例散發(fā)性正常代謝型(*1/*1) GERD患者CYP2C19啟動子基因序列中發(fā)現(xiàn)了3個新的雜合變異.細胞功能驗證結果表明，三種變異均導致CYP2C19基因啟動子轉錄活性的改變，其中攜帶94761364 T＞A變異位點的CYP2C19啟動子，其轉錄活性比野生型顯著升高(P=0.034)，有可能加快PPIs的代謝，并降低血藥濃度，可能是患者治療效果較差的因素之一；臨床上可考慮更換非酶途徑代謝的藥物如雷貝拉唑等，開展進一步治療.

4 結論

本實驗的結果表明，CYP2C19啟動子區(qū)堿基發(fā)生變異，也可能導致CYP2C19酶活性的改變，具有一定的臨床意義，這一發(fā)現(xiàn)為中國人群中GERD患者的臨床指導用藥和治療提供了新的思路.

文章亮點

實驗背景

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是一種慢性疾病，主要治療方法為口服質子泵抑制劑(proton pump inhibitors，PPIs)，臨床上常用的第一代PPIs，經(jīng)肝臟中CYP2C19代謝，血藥濃度逐漸降低.先前的研究已證明CYP2C19基因多態(tài)性導致PPIs在代謝速率、半衰期和藥效等方面?zhèn)€體差異大，影響療效.

實驗動機

基因啟動子區(qū)是控制基因表達的重要調控元件；CYP2C19啟動子區(qū)如發(fā)生基因變異，可能影響基因表達，進而改變其生物學功能及PPIs在體內的代謝速率.

實驗目標

在本研究中，我們將篩選正常代謝型(*1/*1)的GERD患者CYP2C19基因啟動子區(qū)的變異，并在細胞水平驗證基因變異對啟動子功能的影響，進而分析CYP2C19啟動子區(qū)功能改變與GERD經(jīng)PPIs治療效果的相關性.

實驗方法

收集入院治療的散發(fā)性GERD患者全血163例，實驗組患者經(jīng)PPIs診斷性治療后，癥狀積分降低＞50%，癥狀未完全消失(n=82)；對照組患者治療后癥狀完全消失(n=81)；全部患者CYP2C19基因型經(jīng)檢測為*1/*1.利用PCR擴增并結合Sanger測序篩選入組患者CYP2C19啟動子區(qū)的基因變異；將CYP2C19啟動子片段克隆至pGL3 basic載體，并轉染HEK 293T細胞，檢測基因變異對啟動子功能的影響.

實驗結果

本研究在3個正常代謝型GERD患者的CYP2C19基因啟動子中分別發(fā)現(xiàn)了3個新的雜合變異：g.94761364 T＞A，g.94762112 T＞A，g.94762514 G＞T；與野生型相比，攜帶g.94761364 T＞A變異的CYP2C19啟動子的轉錄活性顯著升高(P=0.034).

實驗結論

CYP2C19啟動子區(qū)堿基發(fā)生變異可能影響其轉錄活性，進而改變PPIs的代謝和血藥濃度，這一發(fā)現(xiàn)為中國人群中GERD患者的臨床用藥和治療提供了新的思路.

展望前景

本研究主要在分子和細胞水平對CYP2C19啟動子區(qū)功能改變與GERD經(jīng)PPIs治療效果的相關性進行了研究，具有一定的臨床意義，將為GERD的分子診療提供一定的理論依據(jù).