段瓊，浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 浙江省杭州市 310053

段瓊，陳斌輝，臺州恩澤醫(yī)療中心(集團(tuán))恩澤醫(yī)院藥劑科 浙江省臺州市 317000

林義，溫嶺市第一人民醫(yī)院病理科 浙江省溫嶺市 317500

0 引言

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，盡管我國CRC發(fā)病率和死亡率低于發(fā)達(dá)國家水平[1]，但隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們飲食習(xí)慣的變更，我國近幾年CRC的發(fā)病率正以年均4%以上的速度增長[2]，且北京、上海、廣州等發(fā)達(dá)地區(qū)的CRC發(fā)病率已和發(fā)達(dá)國家持平[3].大部分CRC患者確診時已是中晚期，手術(shù)難以根除[4].目前臨床上應(yīng)用的FOLFOX方案是利用奧沙利鉑(oxaliplatin，L-OHP)與5-氟尿嘧啶及亞葉酸聯(lián)合用藥作為CRC的一線、二線治療[5]，但多數(shù)患者在治療一段時間后產(chǎn)生獲得性耐藥.且化療不僅易出現(xiàn)耐藥性，還極易出現(xiàn)毒副作用，導(dǎo)致臨床上治療效果不佳以及預(yù)后不良[6].因此如何逆轉(zhuǎn)CRC細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥性，提高CRC細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性，提高患者的生存率和減輕患者的毒副作用是目前研究的熱點.

電壓門控氯通道3(voltage-gated chloride channel 3，ClC-3)基因定位于4q33，編碼760個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，廣泛分布于心、腦、肝、腸、胰腺等組織.依賴ClC-3的容積調(diào)節(jié)性氯電流參與調(diào)控細(xì)胞容積變化，而細(xì)胞容積變化直接參與調(diào)控增殖、凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞粘附、細(xì)胞動力學(xué)等多種生物學(xué)功能[7-9].實體腫瘤化療時能使得實體腫瘤細(xì)胞內(nèi)部微環(huán)境發(fā)生改變[10].在缺氧和缺營養(yǎng)的微環(huán)境高滲環(huán)境下，細(xì)胞發(fā)生調(diào)節(jié)性容量增加(regulatory volume increase，RVI)[8].有文獻(xiàn)[11]提出穩(wěn)定過表達(dá)ClC-3的宮頸癌細(xì)胞對順鉑敏感性降低；ClC-3 siRNA轉(zhuǎn)染后，卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV-3/DDP對順鉑敏感性增強(qiáng)[12].因此，我們推測ClC-3表達(dá)可能與對腫瘤細(xì)胞化療相關(guān).

由以上研究背景可見，ClC-3均與腫瘤化療藥物敏感性相關(guān)，但ClC-3在CRC癌奧沙利鉑化療中的研究卻鮮有報道.本研究試圖探究下調(diào)ClC-3是否可以調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞對奧沙利鉑化療的敏感性，以及其中的機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 材料 CRC組織耐藥標(biāo)本收集：收集我院經(jīng)FOLFOX方案化療后再次復(fù)發(fā)的CRC患者再次行腫瘤切除術(shù)的腫瘤組織和相應(yīng)的癌旁組織(距離癌灶組織邊緣2-3 cm)標(biāo)本，腫瘤組織和相應(yīng)的癌旁組織經(jīng)過病理科驗證.篩選出化療耐藥CRC組織(n=28例)和化療敏感CRC組織(n=10例).其中，化療耐藥組織定義為經(jīng)FOLFOX方案化療后≤6 mo出現(xiàn)復(fù)發(fā)的CRC患者的CRC組織，化療敏感組織定義為經(jīng)FOLFOX方案化療后＞6 mo出現(xiàn)復(fù)發(fā)的CRC患者的CRC組織.本次收集的化療耐藥CRC組織為FOLFOX方案化療后4.12 mo±1.13 mo再次復(fù)發(fā)的CRC患者再次行腫瘤切除術(shù)的結(jié)直腸組織，化療敏感CRC組織為FOLFOX方案化療后22.35 mo±4.25 mo再次復(fù)發(fā)的CRC患者再次行腫瘤切除術(shù)的結(jié)直腸組織.所有標(biāo)本及臨床資料的收集均符合倫理規(guī)范，同時征得患者或其家屬同意并簽署相關(guān)知情同意書.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及奧沙利鉑耐藥細(xì)胞模型構(gòu)建：HT-29細(xì)胞(ATCC，美國)用含10%胎牛血清(Gibco，美國)和100 U/mL青/鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific，美國)常規(guī)培養(yǎng)，2 d換一次液，每6 d按照1：3傳代一次.取對數(shù)期HT-29細(xì)胞，將培養(yǎng)基換成含有2 μmol/L奧沙利鉑(賽諾菲(杭州)制藥有限公司)培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，洗除藥物，換正常培養(yǎng)基，每2 d換正常培養(yǎng)基一次，持續(xù)6 d，此為一個循環(huán).每個濃度反復(fù)刺激3個循環(huán).如此反復(fù)誘導(dǎo)、換液、傳代，并逐漸增加奧沙利鉑濃度(每次增加1 μmol/L)間歇誘導(dǎo)培養(yǎng)，最終獲得能耐受20 μmol/L奧沙利鉑的細(xì)胞，并將其培養(yǎng)在含有10 μmol/L奧沙利鉑培養(yǎng)液中，直達(dá)細(xì)胞在10 μmol/L奧沙利鉑培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長.最終獲得奧沙利鉑耐藥的HT-29/L-OHP細(xì)胞.

1.2.2 轉(zhuǎn)染：由Invitrogen 公司(美國)按照BLOCK-iT? RNAi Designer設(shè)計合成人ClC-3 cDNA不同區(qū)域的RNAi(ClC-3 siRNA，序列為：5'-AUAAUAGCUAACCUCCUC CAAACUA-3')，以及無已知的基因編碼的陰性對照siRNA(NC siRNA，序列為：5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3').按照說明書步驟，用脂質(zhì)體lipofectAMINE2000(Invitrogen，美國)分別將ClC-3 siRNA和NC siRNA通過瞬時轉(zhuǎn)染法染入HT-29細(xì)胞和HT-29/L-OHP細(xì)胞，細(xì)胞繼續(xù)在培養(yǎng)箱孵育48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)研究.

1.2.3 藥物處理：用100 nmol/L雷帕霉素(自噬激動劑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)處理已/未轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA的HT-29細(xì)胞和HT-29/L-OHP細(xì)胞30 min，再繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)研究.

1.2.4 CCK-8實驗：調(diào)整雷帕霉素已/未處理的已/未轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA的HT-29細(xì)胞和HT-29/L-OHP密度為1×104個/孔，接種于96孔板，然后分別給予(0、4、8、16、32、64、100 μmol/L)奧沙利鉑處理48 h，待測孔加入100 μL CCK-8工作液(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)，孵箱培養(yǎng)2 h.用酶標(biāo)儀在490 nm處測量吸光值計算細(xì)胞活力.

1.2.5 Cyto-ID自噬率檢測：將已轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA或NC-siRNA的HT-29細(xì)胞和HT-29/L-OHP細(xì)胞調(diào)整密度為1×105個/mL接種于24孔板內(nèi)，細(xì)胞處理后用PBS清洗3次，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS清洗3次，加入Cyto-ID檢測試劑(ENZO，美國)孵育45 min，激光共聚焦顯微鏡下觀察，統(tǒng)計單個細(xì)胞中Cyto-ID的陽性自噬點數(shù)，每樣本至少統(tǒng)計50個細(xì)胞.

1.2.6 免疫組化：取癌旁組織、CRC化療耐藥組織和化療敏感組織組織，并用石蠟包埋.切為6 μm厚度的組織切片，并經(jīng)脫蠟至水、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶和封閉后，分別室溫孵育抗ClC-3(1：150，Abcam，美國)和抗微管相關(guān)蛋白1Ⅱ輕鏈3(microtubule-associated protein 1Ⅱ light chain 3，LC3-Ⅱ)(1：100，Abcam，美國)2 h.PBS沖洗后，室溫孵育酶標(biāo)抗兔二抗(1：100，北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)45 min.PBS沖洗后，用DAB液顯色，蘇木素復(fù)染后，顯微鏡白光視野下觀察并拍照，用Image J軟件統(tǒng)計陽性信號值.

圖1 ClC-3和LC3-Ⅱ在結(jié)直腸癌化療耐藥組織和奧沙利鉑耐藥細(xì)胞HT-29/L-OHP中表達(dá)情況.A-D：免疫組化檢測癌旁組織(n=38)、結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)化療耐藥組織(n=28)和CRC化療敏感組織(n=10)中ClC-3(A、B)和LC3-Ⅱ(C、D)的表達(dá)；與癌旁組織比較，aP＜0.05；與化療敏感組織比較，bP＜0.05.(E-G)Western blot檢測HT-29細(xì)胞和HT-29/L-OHP細(xì)胞中ClC-3表達(dá)(E、F)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率(E、G)；n=4，與HT-29細(xì)胞比較，cP＜0.05.

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡：用RIPA細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)在冰上裂解細(xì)胞并提取蛋白.蛋白用BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行定量后，調(diào)整蛋白上樣量(50 μg/樣品)，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離.電泳結(jié)束，將PVDF膜覆蓋于分離膠上，置于電轉(zhuǎn)槽中用濕轉(zhuǎn)法以200 mA恒流電轉(zhuǎn)90 min.用含5%脫脂奶粉的TBST將PVDF膜在室溫中封閉1 h.在室溫下孵育針對ClC-3(1：1000，Abcam，美國)、Beclin1 (1：2000，Cell Signaling Technology，美國)、LC3(1：1500，Cell Signaling Technology，美國)和β-actin (1：5000，武漢博士德生物工程有限公司)的一抗2 h.洗膜后，孵育HRP標(biāo)記的二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)1 h.洗膜后，用避光ECL超敏發(fā)光液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)顯影.使用Image J軟件分析條帶光密度值.

統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以mean±SD表示，用SPSS 21.0軟件包對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗；多組間數(shù)據(jù)比較用方差分析，再采用SNK檢驗法進(jìn)行均數(shù)的兩兩比較.以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 CLC-3和LC3-Ⅱ在CRC化療耐藥組織和奧沙利鉑耐藥細(xì)胞HT-29/L-OHP中高表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示，與化療敏感組織比較，化療耐藥組織中ClC-3(圖1A、B)和LC3-Ⅱ(圖1C、D)的表達(dá)均明顯增加(P＜0.05)，說明CLC-3和LC3-Ⅱ在CRC化療耐藥組織中呈現(xiàn)高水平.Western blot結(jié)果顯示，與HT-29細(xì)胞比較，奧沙利鉑耐藥細(xì)胞HT-29/L-OHP中ClC-3表達(dá)(圖1E、F)和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率(圖1E、G)均明顯增加(P＜0.05).以上結(jié)果提示，ClC-3表達(dá)和自噬可能與CRC奧沙利鉑耐藥相關(guān).

2.2 抑制ClC-3表達(dá)可以增強(qiáng)奧沙利鉑敏感性 用ClC-3 siRNA分別轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞和HT-29/L-OHP細(xì)胞，與對照組比較，ClC-3 siRNA組的HT-29細(xì)胞和HT-29/L-OHP細(xì)胞中ClC-3表達(dá)均明顯降低(圖2A、B；P＜0.05)，說明構(gòu)建的ClC-3 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功.用CCK-8法檢測不同處理后細(xì)胞活力的變化，如圖2C所示，相比于HT-29細(xì)胞，用ClC-3 siRNA處理的HT-29細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯下降，表明細(xì)胞對于奧沙利鉑化療的敏感性增加；同時，在奧沙利鉑耐藥細(xì)胞HT-29/L-OHP中抑制ClC-3后，細(xì)胞對奧沙利鉑敏感性增強(qiáng).總之，不管是否發(fā)生奧沙利鉑耐藥，抑制細(xì)胞中ClC-3表達(dá)均可以增強(qiáng)細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性.

圖2 抑制ClC-3表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞奧沙利鉑化療敏感性的影響.A，B：Western blot鑒定HT-29細(xì)胞(A)和HT-29/L-OHP細(xì)胞(B)的ClC-3 siRNA的轉(zhuǎn)染效率；C：CCK-8法檢測不同組細(xì)胞活力；n=4；與HT-29細(xì)胞比較，aP＜0.05，cP＜0.05；與HT-29/L-OHP細(xì)胞比較，bP＜0.05.

2.3 抑制ClC-3表達(dá)能抑制自噬 Cyto-ID染色結(jié)果(圖3A、B)顯示，在HT-29細(xì)胞和HT-29/L-OHP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA，轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA后的兩種細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)Cyto-ID的陽性自噬點數(shù)均降低(P＜0.05).進(jìn)一步通過Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)自噬關(guān)鍵蛋白的表達(dá)(圖3C)，結(jié)果(圖3C-F)顯示，不管是在HT-29細(xì)胞和HT-29/L-OHP細(xì)胞中，與轉(zhuǎn)染NC siRNA比較，轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA后的兩種細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率(圖3D)和Beclin1表達(dá)(圖3E)均明顯降低(P＜0.05)，同時p62表達(dá)(圖3F)明顯增加(P＜0.05).以上結(jié)果說明，抑制ClC-3表達(dá)能降低CRC細(xì)胞的自噬水平.

2.4 雷帕霉素能逆轉(zhuǎn)ClC-3 siRNA對奧沙利鉑的增敏效應(yīng) CCK-8結(jié)果(圖4A)顯示，不管是在HT-29細(xì)胞和HT-29/L-OHP細(xì)胞中，與轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA比較，用自噬激動劑雷帕霉素處理均能降低細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性(P＜0.05).Western blot結(jié)果(4B-E)顯示，不管是在HT-29細(xì)胞和HT-29/L-OHP細(xì)胞中，與轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA比較，用雷帕霉素處理后的兩種細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率(圖4B、C)和Beclin1表達(dá)(圖4B、D)均明顯增加(P＜0.05)，同時p62表達(dá)(圖4B、E)明顯降低(P＜0.05)；以上結(jié)果說明，促進(jìn)自噬能逆轉(zhuǎn)ClC-3 siRNA對CRC細(xì)胞的奧沙利鉑的增敏效應(yīng).另外，結(jié)果(圖4B、F)顯示，不管是在HT-29細(xì)胞和HT-29/L-OHP細(xì)胞中，雷帕霉素對ClC-3表達(dá)無影響，這提示ClC-3是細(xì)胞自噬的上游調(diào)節(jié)分子.

3 討論

自噬是實體腫瘤細(xì)胞在缺氧和缺營養(yǎng)的癌灶中生存的重要方式，而化療藥物往往能增強(qiáng)實體腫瘤細(xì)胞缺氧和缺營養(yǎng)的微環(huán)境[10].在自噬過程中，Beclin1上調(diào)能發(fā)揮啟動自噬的作用；LC3-Ⅱ則是自噬體形成的標(biāo)記物；p62可同自噬過程中的降解底物一起被自噬體結(jié)合并降解.且研究[13]已顯示，在實體腫瘤化療耐藥組織切片中發(fā)現(xiàn)，其自噬關(guān)鍵標(biāo)記物Beclin1和LC3-Ⅱ的蛋白水平升高.因此，自噬在實體腫瘤化療敏感性中可能發(fā)揮著重要的作用.另外，缺氧和缺營養(yǎng)的微環(huán)境能促進(jìn)細(xì)胞ClC-3表達(dá)[8].由此觀之，在腫瘤化療中，ClC-3表達(dá)、自噬水平和化療敏感性三者之間可能具有一定的內(nèi)部聯(lián)系.因此，本研究關(guān)注ClC-3和細(xì)胞自噬的作用，以及它們在調(diào)控CRC化療耐藥細(xì)胞對奧沙利鉑化療的敏感性的作用.

ClC-3是電壓門控性氯離子通道家族的成員，有研究[14]發(fā)現(xiàn)抑制ClC-3的表達(dá)，可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的自噬，促進(jìn)U251細(xì)胞對順鉑化療敏感性.我們同樣在CRC化療耐藥組織和奧沙利鉑耐藥的HT-29/L-OHP細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)ClC-3和LC3-Ⅱ高表達(dá)，由此推測ClC-3和LC3-Ⅱ表達(dá)可能與CRC奧沙利鉑化療敏感性相關(guān).為證明ClC-3通過自噬參與結(jié)直腸的奧沙利鉑化療敏感性，本研究采用ClC-3 siRNA轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞和HT-29/L-OHP細(xì)胞，觀察自噬水平和其奧沙利鉑化療敏感性變化，結(jié)果顯示，不管是否發(fā)生奧沙利鉑耐藥，抑制ClC-3表達(dá)均能使結(jié)直腸細(xì)胞對奧沙利鉑增敏，且其過程伴隨自噬水平降低.且Sun等[15]發(fā)現(xiàn)在化療耐藥CRC細(xì)胞中抑制細(xì)胞自噬，奧沙利鉑處理可以促使腫瘤細(xì)胞凋亡增加.比較直接的證據(jù)是Selvakumaran等[16]在CRC細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，給予自噬抑制劑氯喹預(yù)處理的CRC細(xì)胞或轉(zhuǎn)染Beclin1 siRNA的CRC細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性明顯升高.為證明下調(diào)ClC-3對CRC細(xì)胞的奧沙利鉑的增敏效應(yīng)是否通過抑制細(xì)胞自噬，本研究進(jìn)一步選用自噬激動劑雷帕霉素處理已轉(zhuǎn)染ClC-3 siRNA的HT-29細(xì)胞和HT-29/L-OHP細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)自噬能逆轉(zhuǎn)ClC-3 siRNA對奧沙利鉑的增敏效應(yīng)，但其對ClC-3表達(dá)無影響，這一結(jié)果，更進(jìn)一步證明了ClC-3是自噬的上游分子，抑制ClC-3是通過降低CRC細(xì)胞自噬水平來達(dá)到對奧沙利鉑的增敏.

圖3 抑制ClC-3表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬的影響.A，B：Cyto-ID染色觀察不同組中自噬點形成；C-F：Western blot檢測不同組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率(C、D)、Beclin1表達(dá)(C、E)和p62表達(dá)(C、F)；n=4；與HT-29+NC siRNA比較，bP＜0.05；與HT-29/L-OHP+NC siRNA比較，aP＜0.05.

4 結(jié)論

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)ClC-3通過抑制細(xì)胞自噬從而增強(qiáng)了CRC細(xì)胞對奧沙利鉑化療的敏感性.我們的研究工作從組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)兩個方面探究ClC-3在CRC細(xì)胞奧沙利鉑敏感性中的調(diào)控作用，明確下調(diào)ClC-3在CRC化療中的作用機(jī)制，從一個新的角度為評估ClC-3參與CRC化療作用提供了理論依據(jù).

文章亮點

實驗背景

化療是腫瘤治療的最主要的治療策略之一.而化療敏感性制約著腫瘤的化療效果.因此，研究增加化療敏感性的策略對腫瘤的化療具有重大的意義.

實驗動機(jī)

自噬是腫瘤細(xì)胞應(yīng)對化療的重要生存方式之一.已有報道表明電壓門控氯通道3(voltage-gated chloride channel 3，ClC-3)在化療耐藥組織高表達(dá).而在腫瘤化療中，ClC-3表達(dá)、自噬和化療藥物敏感性三者之間的內(nèi)部關(guān)系尚不完全清楚.

圖4 促進(jìn)自噬逆轉(zhuǎn)ClC-3 siRNA對奧沙利鉑的增敏效應(yīng).A：CCK-8法檢測不同組細(xì)胞活力；B-F：Western blot檢測不同組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率(B、C)、Beclin1表達(dá)(B、D)、p62表達(dá)(B、E)和ClC-3表達(dá)(B、F)；n=3；與HT-29+ClC-3 siRNA比較，bP＜0.05；與HT-29/L-OHP+ClC-3 siRNA比較，aP＜0.05.

實驗?zāi)繕?biāo)

研究結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)奧沙利鉑化療中，ClC-3表達(dá)、自噬和奧沙利鉑敏感性三者之間的關(guān)系，并分析內(nèi)在的機(jī)制.

實驗方法

分別檢測FOLFOX方案化療后的CRC化療耐藥組織和化療敏感組織以及CRCHT-29細(xì)胞和奧沙利鉑耐藥細(xì)胞(HT-29/L-OHP)中ClC-3和微管相關(guān)蛋白1Ⅱ輕鏈3(microtubule-associated protein 1Ⅱ light chain 3，LC3-Ⅱ)表達(dá)；敲減HT-29和HT-29/L-OHP中ClC-3的表達(dá)后，分別檢測奧沙利鉑敏感性和自噬水平的變化；用雷帕霉素處理上述細(xì)胞，再分別檢測奧沙利鉑敏感性、自噬水平和ClC-3表達(dá)的變化.

實驗結(jié)果

CRC耐藥組織以及奧沙利鉑耐藥細(xì)胞中均存在高表達(dá)的LC3Ⅱ和ClC-3.在HT-29和HT-29/L-OHP中，下調(diào)ClC-3表達(dá)均對奧沙利鉑增敏并降低自噬；用雷帕霉素能部分消除敲減ClC-3對奧沙利鉑的增敏效應(yīng).

實驗結(jié)論

下調(diào)ClC-3通過抑制CRC細(xì)胞自噬水平來達(dá)到對奧沙利鉑的增敏效應(yīng).

展望前景

在CRC化療中，下調(diào)ClC-3表達(dá)可能會讓患者獲益.