胡凱，馬宏，王莉，趙二江，賈松樹，郭永軍

(1.河南省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省疾病預(yù)防控制中心，河南 鄭州 450000；3.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450003)

2009年3月墨西哥和美國(guó)等先后爆發(fā)了甲型H1N1流感，為A型流感病毒，H1N1亞型流感病毒毒株，該毒株包含有豬流感、禽流感和人流感3種流感病毒的基因片段，是一種新型流感病毒，可以人傳染人，隨后在全球蔓延[1-2]。中國(guó)首例甲型H1N1流感病例2009年5月發(fā)生在四川省，隨即在全國(guó)范圍內(nèi)引起流感大流行[3]。甲型流感病毒表面血凝素是該病毒主要抗原，具有免疫原性，能使人體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但易發(fā)生變異，從而導(dǎo)致該病毒在人群中暴發(fā)流行[4]。為保障實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行甲型H1N1流感病毒核酸檢測(cè)時(shí)的生物安全，最大限度地減輕對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員和環(huán)境造成的危害和損失，本文擬明確實(shí)驗(yàn)室采用實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)甲型H1N1流感病毒過(guò)程中的風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)，并提出降低風(fēng)險(xiǎn)的具體措施。

1 甲型H1N1流感病毒生物學(xué)特性

1.1 病原學(xué)特點(diǎn)甲型H1N1流感病毒屬于正粘病毒科，甲型流感病毒屬。典型病毒顆粒呈球狀，直徑為80～120 nm，有囊膜。囊膜上有許多放射狀排列的突起糖蛋白，分別是紅細(xì)胞血凝素、神經(jīng)氨酸酶和基質(zhì)蛋白M2。病毒顆粒內(nèi)為核衣殼，呈螺旋狀對(duì)稱，直徑為10 nm[2]。在MDCK細(xì)胞系中可進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)。

1.2 病原學(xué)穩(wěn)定性甲型H1N1流感病毒對(duì)乙醇、碘伏、碘酊等常用消毒劑敏感，對(duì)熱敏感，56 ℃條件下30 min可滅活[2]。實(shí)驗(yàn)室高壓蒸汽滅菌器可以有效滅活病毒，使用條件可以設(shè)定為121 ℃，0.1 MPa，20 min；對(duì)大多數(shù)化學(xué)消毒劑敏感，如乙醚、體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇、含氯消毒劑(二氧化氯500 g·L-1、含氯消毒劑1 000 g·L-1，作用30 min)、過(guò)氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，但氯已定不能有效滅活病毒。

2 風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)的確定

2.1 確定方法根據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心制訂的《突發(fā)事件公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)方案(試行)》[5]，同時(shí)參考澳大利亞和新西蘭制訂的《風(fēng)險(xiǎn)管理標(biāo)準(zhǔn)》AS/NZS 4360—2004[6]，運(yùn)用文獻(xiàn)法、專家會(huì)商法明確實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)在甲型H1N1流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)過(guò)程中的生物安全風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)[7]。

2.2 專家選取選取有傳染病學(xué)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、流行病學(xué)、院感和實(shí)驗(yàn)室生物安全管理等專業(yè)背景的10名專家，分別來(lái)自省、市級(jí)疾控機(jī)構(gòu)、省級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)、省級(jí)采供血機(jī)構(gòu)、科研機(jī)構(gòu)和高等院校。其中省級(jí)疾控機(jī)構(gòu)3名，市級(jí)疾控機(jī)構(gòu)1名，省級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)2名，省級(jí)采供血機(jī)構(gòu)1名，科研機(jī)構(gòu)2名，高等院校1名。

2.3 信息收集收集甲型H1N1流感病毒相關(guān)信息，包括世界衛(wèi)生組織、國(guó)家衛(wèi)生健康委、中國(guó)疾病預(yù)防控制中心發(fā)布的關(guān)于甲型H1N1流感信息、文獻(xiàn)信息和媒體報(bào)道信息等。

3 實(shí)驗(yàn)活動(dòng)程序

依據(jù)《甲型H1N1流感診療方案(2010年版)要求[2]，采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)疑似H1N1流感病毒患者的咽拭子、鼻拭子、鼻咽或氣管抽取物、痰中甲型H1N1流感病毒核酸。實(shí)驗(yàn)活動(dòng)程序主要包括收取標(biāo)本、標(biāo)本處理、提取病毒模板、RT-PCR擴(kuò)增、實(shí)驗(yàn)廢棄物處理及清場(chǎng)。

4 生物安全風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)

4.1 實(shí)驗(yàn)活動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)包括2項(xiàng)：(1)在收集標(biāo)本和運(yùn)送過(guò)程中，存在標(biāo)本管破碎、運(yùn)送箱被污染的可能；(2)標(biāo)本震蕩、離心、提取核酸時(shí)發(fā)生試管破裂、甩出、管帽脫落、彈開、跌落等情況，感染性物質(zhì)濺出，產(chǎn)生氣溶膠。

4.2 實(shí)驗(yàn)室圍護(hù)結(jié)構(gòu)和設(shè)備風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)包括3項(xiàng)：(1)標(biāo)本制備間負(fù)壓異?；蛐纬烧龎涸斐扇藛T或氣溶膠外溢，緩沖間互鎖裝置失靈，造成人員被困；(2)生物安全柜故障，如出現(xiàn)斷電、高效過(guò)濾器損壞導(dǎo)致的生物安全柜出現(xiàn)正壓、氣流紊亂、氣溶膠泄露；(3)高壓蒸汽滅菌器壓力、溫度出現(xiàn)偏差，造成實(shí)驗(yàn)室廢棄物、患者標(biāo)本消毒不徹底，壓力過(guò)高發(fā)生爆炸，未充分冷卻取物造成燙傷。

4.3 實(shí)驗(yàn)人員風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)包括4項(xiàng)：(1)技術(shù)操作程序不熟悉，出現(xiàn)加錯(cuò)試劑或標(biāo)本、標(biāo)本在生物安全柜內(nèi)或外發(fā)生溢灑等；(2)生物安全意識(shí)不足，缺乏生物安全相關(guān)知識(shí)，無(wú)實(shí)驗(yàn)室良好實(shí)驗(yàn)行為；(3)身體狀況欠佳，有基礎(chǔ)疾病，具有發(fā)熱、干咳、乏力等癥狀，可能發(fā)生實(shí)驗(yàn)室感染；(4)心理素質(zhì)不佳，不適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)時(shí)間的密閉環(huán)境操作。

4.4 臨時(shí)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室人員風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)包括1項(xiàng)：外來(lái)人員(如儀器設(shè)備維修維護(hù)人員、單位管理人員、輔助人員等)生物安全意識(shí)缺乏、未經(jīng)過(guò)系統(tǒng)培訓(xùn)以及實(shí)驗(yàn)室基本技能欠缺。

4.5 個(gè)人防護(hù)裝備風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)包括4項(xiàng)：(1)口罩類型不符合醫(yī)用標(biāo)準(zhǔn)，密合性檢測(cè)不合格，超過(guò)有效期，長(zhǎng)時(shí)間佩戴，受到體液或其他液體噴濺；(2)防護(hù)服不符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，防護(hù)服破損、撕裂，防護(hù)服受到感染性物質(zhì)噴濺，穿脫防護(hù)服順序錯(cuò)誤；(3)乳膠手套佩戴錯(cuò)誤；(4)護(hù)目鏡使用錯(cuò)誤。

4.6 清場(chǎng)及消毒風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)包括2項(xiàng)：(1)消毒劑種類不正確，消毒方式不規(guī)范；(2)實(shí)驗(yàn)耗材及實(shí)驗(yàn)固廢、廢液處理不規(guī)范。

4.7 意外事件及處理風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)包括2項(xiàng)：(1)利器刺破皮膚；(2)實(shí)驗(yàn)室水、電、燃?xì)馐褂弥兴l(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

5 降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)的措施

5.1 規(guī)范實(shí)驗(yàn)活動(dòng)操作嚴(yán)格使用有效氯消毒液對(duì)樣本容器進(jìn)行消毒，轉(zhuǎn)移試管時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕柔，用試管架或方盒盛裝，移至生物安全柜內(nèi)進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作。在生物安全柜內(nèi)使用小型振蕩器，震蕩前擰緊管帽，固定好試管。使用帶密封蓋的生物安全型離心機(jī)，發(fā)生意外后，不打開離心轉(zhuǎn)頭蓋，將轉(zhuǎn)頭整體卸下，移至生物安全柜中打開轉(zhuǎn)頭蓋。標(biāo)本開蓋時(shí)工作臺(tái)面應(yīng)放置1塊浸有消毒液的布或吸有消毒液的紙。

5.2 加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室圍護(hù)結(jié)構(gòu)和設(shè)備的維護(hù)及狀態(tài)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)甲型H1N1流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)特點(diǎn)建立圍護(hù)結(jié)構(gòu)狀態(tài)確認(rèn)程序和涉及生物安全重要設(shè)施設(shè)備的維護(hù)方案及操作規(guī)程，明確緊急狀態(tài)下意外事件的處置原則。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室壓力控制系統(tǒng)要定期進(jìn)行維護(hù)，每次開啟系統(tǒng)均需檢查氣壓，要確保實(shí)驗(yàn)室緩沖間和工作區(qū)維持正常梯度壓力。生物安全柜安裝位置應(yīng)符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，定期由有資質(zhì)的第三方進(jìn)行維護(hù)性檢驗(yàn)[8]，每次開機(jī)用絲線法初步檢查安全柜壓力正常后，方可開展實(shí)驗(yàn)活動(dòng)。每次離心時(shí)應(yīng)檢查離心機(jī)密封狀態(tài)，應(yīng)建立離心意外事件處置程序。加強(qiáng)高壓蒸汽滅菌器狀態(tài)核查[9]，制定高壓蒸汽滅菌器標(biāo)準(zhǔn)操作程序，進(jìn)行滅菌效果監(jiān)測(cè)，并規(guī)范使用記錄。

5.3 進(jìn)一步促進(jìn)實(shí)驗(yàn)人員生物安全意識(shí)和相關(guān)能力提升提升實(shí)驗(yàn)室操作人員的生物安全意識(shí)和操作技能是實(shí)驗(yàn)室生物安全管理的一項(xiàng)重要內(nèi)容，應(yīng)加強(qiáng)甲型H1N1流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室操作的基本技能、檢測(cè)規(guī)程和流程、儀器設(shè)備使用等方面的培訓(xùn)[10]，并對(duì)培訓(xùn)效果進(jìn)行考核和驗(yàn)證。掌握發(fā)生溢灑等突發(fā)生物安全事件的應(yīng)急處理方法。實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)身體健康，無(wú)基礎(chǔ)性疾病，心理素質(zhì)穩(wěn)定，能耐受在密閉環(huán)境下長(zhǎng)時(shí)間工作。此外，實(shí)驗(yàn)人員需建立身體健康檔案，預(yù)留本底血清，建立實(shí)驗(yàn)人員身體異常發(fā)現(xiàn)和報(bào)告制度。

5.4 嚴(yán)格管控臨時(shí)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室人員實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定全面的管理程序，嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室人員準(zhǔn)入制度。臨時(shí)人員進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須有實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)，進(jìn)入人員需經(jīng)過(guò)生物安全培訓(xùn)，并告知進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室可能出現(xiàn)的危害，簽署知情同意書。同時(shí)需有2名工作人員陪同進(jìn)入并及時(shí)提醒注意事項(xiàng)。臨時(shí)進(jìn)入人員進(jìn)入時(shí)需與實(shí)驗(yàn)室工作人員按照同等防護(hù)水平穿戴防護(hù)裝備。進(jìn)入前要測(cè)量體溫。臨時(shí)人員工作完成后，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)詳細(xì)記錄其進(jìn)入時(shí)間及其聯(lián)系方式，并告知其在1個(gè)最長(zhǎng)潛伏期內(nèi)(14 d)密切關(guān)注自己是否出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀，如出現(xiàn)相應(yīng)癥狀應(yīng)立即報(bào)告相關(guān)部門，及時(shí)就醫(yī)。

5.5 積極落實(shí)個(gè)人防護(hù)要求實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)不同生物安全危害要求建立不同等級(jí)的個(gè)人防護(hù)裝備使用和監(jiān)督檢查規(guī)范，由單位統(tǒng)一采購(gòu)具有國(guó)家醫(yī)療器械注冊(cè)證符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的個(gè)人防護(hù)用品。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)務(wù)人員應(yīng)每周檢查實(shí)驗(yàn)室內(nèi)備存的個(gè)人防護(hù)用品的有效期，檢查存貨效期并對(duì)檢查結(jié)果負(fù)責(zé)。一次性醫(yī)用外科口罩只用于聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)實(shí)驗(yàn)室試劑準(zhǔn)備間和結(jié)果分析間，人員進(jìn)入標(biāo)本制備間應(yīng)按照二級(jí)個(gè)人防護(hù)要求佩戴醫(yī)用口罩。實(shí)驗(yàn)室工作人員佩戴口罩一般不超過(guò)4 h，如遇液體噴濺，需及時(shí)用安全的方式進(jìn)行更換。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)備有一次性吸水材料和有效消毒劑，以備應(yīng)急處理[11]。必要時(shí)應(yīng)規(guī)范佩戴護(hù)目鏡。

5.6 規(guī)范實(shí)驗(yàn)室清場(chǎng)及消毒實(shí)驗(yàn)室配備充足的空氣消毒機(jī)或紫外線燈，實(shí)驗(yàn)前后常規(guī)消毒(空氣消毒機(jī)每次使用1 h，紫外線燈每次使用30 min)；實(shí)驗(yàn)前后使用500 mg·L-1有效氯的消毒液(84消毒液稀釋100倍)進(jìn)行桌面、臺(tái)面及地面消毒；所用門把手等公共設(shè)施每天使用500 mg·L-1有效氯的消毒液消毒3次；實(shí)驗(yàn)前后用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精對(duì)生物安全柜進(jìn)行擦拭；轉(zhuǎn)運(yùn)及存放標(biāo)本的容器使用前后用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精進(jìn)行擦拭或噴灑消毒。所有標(biāo)本需放置在專用密閉容器中轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理后方可離開實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如使用銳器(包括針頭、小刀、金屬和玻片等)要直接棄置于銳器盒內(nèi)，高壓蒸汽滅菌前對(duì)于固態(tài)廢物可適當(dāng)松開包裝袋口以加強(qiáng)滅菌效果[12]。高壓滅菌后固體廢物用專用密閉容器進(jìn)行包裝、密封、貼標(biāo)簽，送到醫(yī)療廢物暫存地，由有資質(zhì)的醫(yī)療廢物處置機(jī)構(gòu)統(tǒng)一處理，液體廢物高壓滅菌調(diào)節(jié)液體pH值為中性后方可排出[10,13]。

5.7 制定預(yù)案，妥善處置生物安全風(fēng)險(xiǎn)在操作甲型H1N1流感病毒毒株或其他潛在感染性材料時(shí)要嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程，加強(qiáng)個(gè)人防護(hù)，選擇心理素質(zhì)好、健康狀態(tài)佳的人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，避免發(fā)生針刺事件。在實(shí)驗(yàn)室發(fā)生水、電、燃?xì)夤收希赡軐?dǎo)致生物安全重大風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，要制定緊急處置預(yù)案。對(duì)已發(fā)生的污染事件要立即采取消毒措施，污染生物安全柜的操作臺(tái)造成局限感染時(shí)使用有效氯消毒液對(duì)工作臺(tái)面進(jìn)行消毒。含病毒的培養(yǎng)皿碎裂或傾覆造成實(shí)驗(yàn)室污染時(shí)，應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)室空間密閉，使用浸有有效氯消毒液的毛巾覆蓋污染區(qū)進(jìn)行消毒處理，大量溢灑時(shí)可用有效消毒劑采用熏蒸或氣溶膠噴霧法對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行整體消毒。