于泓洋 宋遠航 趙 亮 劉天琦 鮑秀琦

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154000)

酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是長期過量飲酒引起的慢性肝病。在全世界范圍內(nèi)，酒精性肝病即病毒性肝炎之后，成為肝臟損害的第二大主要病因[1]。在2011年世界衛(wèi)生組織的報告中顯示,長期飲酒每年導(dǎo)致約260萬人死亡,大多與ALD相關(guān)[2]。

ALD包括輕癥酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化等類型。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷、氧化應(yīng)激損傷、硝化反應(yīng)和調(diào)脂因子共同參與ALD發(fā)病。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在酒精性肝病發(fā)病機制有舉足輕重的位置。攝入乙醇的九成在肝臟中代謝，肝臟代謝乙醇主要方法是通過胞漿中的乙醇脫氫酶，乙醛通過乙醛脫氫酶(ALDH)進行代謝。乙醛蛋白加合物和DNA加合物使酶失活，從而導(dǎo)致DNA修復(fù)蛋白功能障礙，蛋白功能受損，脂質(zhì)過氧化和線粒體損傷，這些會使肝細胞死亡或者凋亡[3]。長時間過量飲酒會導(dǎo)致機體內(nèi)促氧化劑的增多和抗氧化劑的減少,肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激(ROS)，最終導(dǎo)致肝細胞的死亡或凋亡。乙醇會增加肝細胞中的ROS，從而消耗大量抗氧化劑并加劇肝臟損害。 ROS對蛋白質(zhì)的氧化修飾會降低其活性，引起結(jié)構(gòu)變化，例如蛋白質(zhì)的部分展開和疏水基團的暴露，最終導(dǎo)致蛋白水解和誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[4]。

1 ER與ERS

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是重要的細胞器，它的功能包括蛋白質(zhì)合成與折疊、組裝與運輸，同時它也是儲存鈣的主要場所，細胞內(nèi)脂類代謝和類固醇激素的合成也在此地。然而，當(dāng)折疊錯誤蛋白或未折疊蛋白(UPR)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)大量積累，或鈣在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中流失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能就會受損，這種情況被定義為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無法恢復(fù)其功能時，那么細胞死亡途徑就會被激活，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。酒精代謝可導(dǎo)致多種蛋白質(zhì)加合物的形成，以及損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊，導(dǎo)致錯誤折疊蛋白堆積和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6]。細胞可以通過激活UPR來適應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。一方面，UPR通過降低蛋白翻譯和增加蛋白折疊能力(通過促進伴侶蛋白的表達)減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。另一方面，UPR還通過蛋白酶體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(ERAD)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的代償性自噬促進錯誤折疊蛋白的降解。然而，長期飲酒可抑制肝臟蛋白酶體活性，使折疊錯誤的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)積累，形成不溶性蛋白聚集體，抵抗蛋白酶體的降解[7]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活三種跨膜蛋白——活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)、肌醇需求酶1(IRE1)和R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)——它們共同誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，涉及基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控，有助于擴大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的處理能力并使細胞器恢復(fù)體內(nèi)平衡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中常見的分子伴侶有葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)，GRP94和HSP40，三者當(dāng)中屬BIP/GRP78含量最多。在非應(yīng)激狀態(tài)下時，GPR78這種分子伴侶蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受蛋白結(jié)合為復(fù)合物，處于無活性狀態(tài)。應(yīng)激狀態(tài)下時，累積下來的非折疊蛋白將跟IRE1、PERK、ATF6競爭GRP78的結(jié)合，使得IRE1、PERK、ATF6解離并激活從而促進蛋白的水解。PERK被認為是UPR信號中最先被激活的分子，緊接著為ATF6， IRE1被認為是最后激活的分子[8]。除了3條基本通路，在實體瘤中誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的通路可以激活A(yù)TF6和PERK信號級聯(lián)反應(yīng)，IRE1α也可以被激活的RAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(AKT)激活。

1.1 R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)介導(dǎo)的生存信號途徑

PERK將真核細胞翻譯起始因子2α(eIF-2α)51位絲氨酸磷酸化，其作用是阻止蛋白翻譯，減輕ER的負荷。為了緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)超負荷，磷酸化的eIF2α通過阻止80 s核糖體組裝來阻止mRNA翻譯，同時反常地增加在其他區(qū)域具有上游開放閱讀框的幾種mRNA的翻譯，如ATF4[9]。然而，激活的eIF-2α對活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)mRNA的翻譯產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，從而激活其下游分子C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)的表達，ATF4上調(diào)CHOP基因的表達，參與到細胞凋亡、細胞應(yīng)激、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和代謝異常等病理過程中。在哺乳動物細胞中，CHOP處于普遍表達的狀態(tài)，是ERS介導(dǎo)細胞凋亡的主要信號分子[10]。

PERK信號級聯(lián)包括幾種主要蛋白組分，如eIF2α、轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(β)樣2(TBL2)、核因子紅系衍生2樣2(Nrf2)、ATF4、CHOP和瘢痕樣ECH相關(guān)蛋白1(KEAP1)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進程中，PERK還可以將NF-KB激活，NF-KB可以將抗凋亡蛋白Bcl-2正向調(diào)節(jié)，達到激活細胞途徑的目的[11]。

1.2 肌醇需求酶1(IRE1)介導(dǎo)的生存信號途徑

IRE1是一種具有兩個功能的膜轉(zhuǎn)運蛋白，它不僅具有蛋白激酶活性，還具有核酸內(nèi)切酶活性，也是UPR中最保守的蛋白。最開始，IRE1基因是在篩選釀酒酵母遺傳突變體時分離得到的[12]。之后發(fā)現(xiàn)兩個哺乳動物基因IRE1α和 IRE1β，在C末端具有控制激酶和內(nèi)切核糖核酸酶活性的胞漿效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域，在N末端存在差異，N端具有管腔感受器結(jié)構(gòu)域、單向膜轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域[13]。

當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的狀態(tài)下，IRE1α反式磷酸化從BiP結(jié)合解離后，并激活核糖核酸內(nèi)切酶(RNase)，活化的IRE1α還聚集腫瘤壞死因子受體(TNFR)相關(guān)因子-2(TRAF2)和凋亡信號激酶1(ASK1)介導(dǎo)應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK)的活化和核因子κB的活化[14]。激活后的 IRE1α催化X-盒結(jié)合蛋白1(Xbox-binding protein 1，XBP1)的mRNA的切割，IRE1α/XBP1的主要功能是通過上調(diào)XBP1的轉(zhuǎn)錄因子活性和IRE1α的RNase活性，上調(diào)編碼蛋白折疊、質(zhì)量控制和ERAD相關(guān)蛋白的基因，促進細胞存活[15]。

1.3 活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的生存信號途徑

ATF6是Ⅱ型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白，具有三個結(jié)構(gòu)域：管腔的C末端結(jié)構(gòu)域，膜轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)的N末端結(jié)構(gòu)域[16]。其中細胞質(zhì)的N末端在其結(jié)構(gòu)中包含亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)域，它可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上是因為和伴侶GRP78/BiP和鈣網(wǎng)蛋白相互結(jié)合。 在ERS中，ATF6從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)遷移到高爾基體，并通過位點1蛋白酶(S1P)和位點2蛋白酶(S2P)調(diào)節(jié)膜內(nèi)蛋白水解[17]，釋放ATF6的N-末端部分，N-末端蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位至細胞核，通過與ATF(激活轉(zhuǎn)錄因子)/cAMP反應(yīng)元件(CRE)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)元件(ERSE)結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄，增加XBP1-、BiP/GRP78-、CHOP-、PDI-和ERAD相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄[18]。

2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝細胞凋亡

酒精性肝病凋亡的病理學(xué)金標準是肝細胞中嗜酸性粒細胞的形成，嗜酸性粒細胞和Mallory體在同一細胞內(nèi)。 目前存在三種主要類型的細胞凋亡：外源途徑(受體介導(dǎo))、內(nèi)源途徑(線粒體介導(dǎo))和ERS介導(dǎo)的途徑[19]。ERS導(dǎo)致細胞凋亡的途徑包括: (1)誘導(dǎo)PERK/eIF2α依賴的促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP激活; (2)IRE1介導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)激活, 其刺激凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)激酶級聯(lián);(3)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase-12)通路的激活[20]。

2.1 CHOP與細胞凋亡

當(dāng)ERS后PERK-eIF2α-ATF4使之大量活化，ATF4激活CHOP基因轉(zhuǎn)錄，CHOP基因包含與未折疊蛋白相關(guān)的結(jié)合位點(如ATF4，ATF6和XBP1)，并且可以通過在未折疊蛋白過程中調(diào)節(jié)編碼來促進細胞凋亡[21]。CHOP可能誘導(dǎo)細胞凋亡的途徑: (1)CHOP誘導(dǎo)凋亡可能是通過誘導(dǎo)BCL-2家族抗凋亡蛋白的表達下調(diào)，使兩個凋亡蛋白BCL-2和Bax不平衡，進而增加Bax的表達量，增多的游離Bax轉(zhuǎn)運至線粒體，誘導(dǎo)線粒體途徑凋亡[22]。(2)CHOP轉(zhuǎn)錄增強GADD34的表達，激活了elF2α的蛋白質(zhì)去磷酸化逆向翻譯抑制[23]。使蛋白質(zhì)量產(chǎn)變多產(chǎn)生ROS，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)過多導(dǎo)致細胞凋亡。(3)CHOP以ER氧化酶1α(ERO1a)依賴性方式介導(dǎo)細胞凋亡，導(dǎo)致Ca2+從ER釋放，隨后Ca2+進入線粒體，在線粒體內(nèi)發(fā)生去極化進而產(chǎn)生多余的ROS，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)氧化應(yīng)激同時使線粒體失去功能，導(dǎo)致細胞凋亡(內(nèi)源途徑)[24]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白錯誤折疊與ROS產(chǎn)生之間存在密切關(guān)系。

2.2 Caspase-12與細胞凋亡

在正常狀態(tài)下，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因2(TRAF2)與Caspase-12前體形成結(jié)合成復(fù)合物，持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時Caspase-12前體與TRAF2分離，從而激活Caspase-12[25]。ERS作用下，然后Caspase-7在Asp94和Asp31處切割Caspase-12前體，使它活化。活化的Caspase-12激活Caspase-9進而激活Caspase-3,最終誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生[26]。此外，Ca2+濃度的升高刺激需鈣蛋白酶(calpain)，也會促使Caspase12向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，進而使其活化。

2.3 JNK與細胞凋亡

IRE1a激活TRAF2，隨后激活細胞凋亡信號激酶1(ASK1)和JNK。JNK磷酸化誘導(dǎo)的促凋亡Bim活化和抗凋亡Bcl2蛋白失活， 介導(dǎo)的細胞凋亡[27]。JNK過度表達會讓內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜受到損傷，Ca2+外流，通過分解酶激活Caspase12，進而使細胞進入凋亡狀態(tài)。此外，JNK還會上調(diào)p53凋亡基因表達，同時編碼許多因子，例如c-Jun，c-Fos和EIK-1并誘導(dǎo)配體的表達，例如腫瘤壞死因子和Fas-L[28]。

3 酒精性肝病與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

許多研究證明同型半胱氨酸(Hcy)代謝、氧化應(yīng)激、乙醛加合物等途徑誘導(dǎo)ERS。血液中Hcy升高，這種被稱為高同型半胱氨酸血癥(HHcy)。胃內(nèi)酒精喂養(yǎng)顯示小鼠血漿Hcy增加5倍以上，HHcy是包括心血管疾病、糖尿病和酒精性肝病在內(nèi)的幾種疾病的組成部分[29]。HHcy增強NF-kB、IL-1b、IL-6和IL-8的產(chǎn)生，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這可以解釋Hcy-促進細胞損傷的許多過程，如細胞凋亡，脂肪堆積和炎癥，這些基因的表達與蛋白質(zhì)折疊不良以及細胞凋亡和脂質(zhì)合成相關(guān)，Hcy 可以激活GRP78、CHOP、IRE1α、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)和JNK等通路[30]。乙醇攝入過多會形成加合物，如丙二醛-乙醛雜化物和α-羥乙基蛋白加合物。研究表明丙二醛-乙醛加合物增加了IRE1、eIF-2α、GRP78和CHOP的誘導(dǎo)。此外，在急性乙醇中毒的小鼠模型中，對抗利尿激素的抑制作用可能導(dǎo)致葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 mRNA水平的下調(diào)[31]。 這表明肝臟代謝乙醇ERS之間存在因果關(guān)系。據(jù)報道，通過灌胃輸注乙醇4周后，我們觀察脂肪性肝炎、肝臟S-腺苷甲硫氨酸(SAM)降低、S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)升高和SAM/SAH比值降低，GRP78、ATF4、CHOP、SREBP-1c上調(diào)，并與酒精誘導(dǎo)的SAM/SAH比值呈負相關(guān)[32]。動物長期灌胃輸注酒精，肝細胞內(nèi)細胞色素CYP2E1過表達可增加超氧化物歧化酶(SOD)的表達，激活核因子紅系2相關(guān)因子2(Nrf2)，Nrf2是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)因子。

4 結(jié)語

ALD發(fā)病機制有很多， ERS在ALD中起重要作用。雖然酒精誘導(dǎo)的ERS機制的認識有了進步，但是還有待進一步探索。這樣才能研制出療效更好的藥品，也將有助于做好ALD的防治工作。