梁曉靜 朱昌叁 李開祥 安家成 王鵬良

摘 要：? 為了解香樟基因密碼子偏好性，該文以NCBI網(wǎng)站中香樟轉錄組數(shù)據(jù)為材料，利用生物信息學手段評價轉錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量，選取高質(zhì)量數(shù)據(jù)的轉錄組，去除低質(zhì)量序列，組裝轉錄組，預測基因結構，再利用自編perl腳本提取以AUG開頭的基因序列37 Mb序列34 931個基因，進一步利用CodonW分析基因密碼子偏好性。結果表明：GC含量的變化范圍為0.273～0.742，均值為0.452;ENC的范圍為26.29～61.00，均值為52.76;CAI的范圍為0.064～0.401，均值為0.199;RSCU值大于1的密碼子數(shù)目為27個，其中以U或A結尾的有22個;中性分析表明，小部分基因在對角線上，大多數(shù)基因偏離對角線;ENC-plot分析表明小部分基因在標準曲線上，大多數(shù)基因偏離標準曲線。上述研究結果表明，香樟基因的密碼子偏好性比較弱，密碼子常以A/U結尾;突變和選擇兩者都在密碼子偏好中起作用，而選擇作用更大;最終確定了GUU、CAG、GAA、UCU、GCU、GGU為最優(yōu)密碼子，通過對目標基因密碼子的校正，提高表達效率，從而為利用基因工程技術改良香樟重要性狀奠定了基礎。

關鍵詞： 香樟， 轉錄組， 基因， 密碼子， 偏好性

中圖分類號：? Q945.4

文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2021）12-2077-07

收稿日期：? 2020-07-22

基金項目：? 自治區(qū)主席科技資金項目（1517-06）;第八批廣西特聘專家專項;廣西林科院基本科研業(yè)務費項目（林科201806號）;廣西重點實驗室開放課題（19-B-04-01）? [Supported by the Scientific Program of Chairman in Guangxi （1517-06）; the Eighth Batch Guangxi Special Expert Program; Basic Research Fund of Guangxi Forestry Research Institute （LinKe 201806）; Open Project of Guangxi Key Laboratory （19-B-04-01）]。

作者簡介： 梁曉靜（1983-），碩士，高級工程師，主要從事經(jīng)濟林栽培育種研究，（E-mail）liangxj2013@126.com。

通信作者：? 王鵬良，博士，教授，碩士研究生導師，主要從事植物遺傳育種研究，（Email）pengliang_wang@163.com。

Codon bias of transcriptomic genes? in Cinnamomum camphora

LIANG Xiaojing1， ZHU Changsan1， LI Kaixiang1， AN Jiacheng1， WANG Pengliang2*

（ 1. Guangxi Forestry Research Institute， Guangxi Key Laboratory for Cultivation and Utilization of Special Non-Timber Forest Crops， Engineering and Technology Research Center for Anise and Cinnamon of State Forestry Administration， Guangxi Engineering and Technology Research Center for Woody Spices， Nanning 530002， China; 2. Beibu Gulf University， Qinzhou 535011， Guangxi， China ）

Abstract：? In order to understand the genes codon bias of transcriptome in Cinnamomum camphora， all transcriptome data of C. camphora were downloaded， screened against their quality. The screened data were assembled and annotated in gene structure after low-quality reads were deleted. Then 37 Mb gene sequences initiated with AUG were extracted by perl script with 34 931 genes. The codon bias was analyzed using CodonW software. The results were as follows： GC content ranged from 0.273 to 0.742 with the average of 0.452; ENC ranged from 26.29 to 61.00 with the average of 52.76; CAI ranged from 0.064 to 0.401 with the average of 0.199; There were 27 genes whose RSCU were greater than 1， of which 22 genes ended with U or A; Neutral plot analysis indicated that a great many genes were not on the line and ENC-plot showed the similar results. The above results elucidate that the gene codon bias of transcriptome was weak， and most ended with U or A; Selection played more important role than mutation in codon bias; Finally， GUU， CAG， GAA， UCU， GCU and GGU were taken as the optimal codons. This will provide a solid foundation for improving traits of C. camphora via the codon revision of the targeted genes.

Key words： Cinnamomum camphora， transcriptome， genes， codon， bias

香樟（Cinnamomum camphora）是樟科樟屬的一種常綠大喬木，為我國國家二級保護植物，廣泛分布于我國南方及西南各省（中國科學院中國植物志編輯委員會，1982）。香樟的木材是良好的建筑用材，其根、枝葉、木材和種子均可提取樟腦和樟油，用途十分廣泛，具有很高的應用價值。

香樟群體及個體間均存在較大遺傳變異。根據(jù)樟油化學成分差異，香樟可分為本樟、芳樟和油樟（中國科學院中國植物志編輯委員會，1982）;從外部表型上看，材用和油用樟樹木材構造存在差異（王軍鋒等，2019），不同化學型油用樟樹葉片解剖結構和抗旱性也存在差異（王坤等，2019），從內(nèi)部遺傳物質(zhì)上看，等位基因也存在較大差異（劉爽，2019）。豐富的遺傳變異為香樟的定向遺傳改良提供了良好的資源。遺傳改良通常利用雜交等傳統(tǒng)的方法開展，然而這些方法存在周期長、成本高、盲目性大等不足。而分子育種能有效克服這些缺點成為現(xiàn)代育種的重要手段。

盡管香樟的分子研究起步較遲，但已有一些報道。Liu et al. （2015）利用同源克隆的方法克隆了香樟CcBBM，并進行了轉化驗證;Chen et al. （2018）利用轉錄組對香樟萜類生物合成基因開展了鑒定分析;另外，研究人員對香樟不同化學成分合作途徑的關鍵基因CcHMGRs（鄭漢等，2020a）、CcPMK（鄭漢等，2020b）及NBS-LRR類抗病基因家族開展克隆和部分功能分析的工作（鄭永杰等，2018）;同時施雪萍（2009）和陳甘明（2014）先后建立了香樟體細胞再生體系并成功將Barnase、PaFT、CBF3和DREB1等基因轉入香樟，為香樟不同成分的合成、抗逆機理探索和遺傳改良奠定基礎?；蚬こ逃N是分子育種的重要方法之一，具有周期短、效率高、目標明確等優(yōu)點（王關林和方宏筠，2014）。密碼子指導氨基酸的合成（Krebs et al.， 2018）。不同的密碼子對基因的表達和功能產(chǎn)生較大影響（Hershberg & Petrov， 2008; Zhou et al.， 2016）。不同物種密碼子偏好性存在較大差異（陸育生等，2018），了解香樟基因的密碼子偏好性，對利用基因工程技術培育香樟新品種具有十分重要的作用。因此，本文分析香樟轉錄組基因密碼子偏好性，確定最優(yōu)密碼子，從而為利用基因工程改良香樟奠定堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI網(wǎng)站中下載6個SRR6436155、SRR6436156、SRR8316438、SRR6436010、SRR6436011、SRR6374671香樟轉錄組測序的結果。本文利用FastQC檢測轉錄組的序列質(zhì)量，篩選數(shù)據(jù)質(zhì)量較高的轉錄組為材料，再利用Trimmomatic修剪去除低質(zhì)量的序列和接頭。在此基礎上利用Trinity對轉錄組進行組裝，利用TransDecoder預測基因結構。提取以AUG開頭的基因用于本文的后續(xù)分析。

1.2 數(shù)據(jù)分析

1.2.1 密碼子偏好參數(shù)估計 以所選的編碼蛋白基因為研究對象，采用CodonW 1.4.2軟件分析密碼子偏好性的參數(shù)：有效密碼子數(shù)目（ENC）、密碼子適應指數(shù)（CAI）、密碼子偏好性指數(shù)（CBI）、最優(yōu)密碼子使用頻率（Fop）、基因表達的蛋白質(zhì)疏水性（Gravy）和芳香族氨基酸的頻率（Aromo）及密碼子不同位置堿基的比例（GC1、GC2和GC3分別代表第一位、第二位和第三位密碼子的GC含量，GC3s表示第三位同義密碼子的GC含量）。

1.2.2 中性繪圖分析 為了初步摸索對密碼子偏好性的影響因素，中性繪圖根據(jù)GC1和GC2均值記為GC12，其作為縱坐標，GC3作為橫坐標，用基因散點圖的方式進行作圖。根據(jù)基因所在位置與對角線的關系從而判斷影響基因密碼子偏好性的因素。

1.2.3 ENC-plot繪圖 為進一步了解造成密碼子偏好的原因，本文以ENC為縱坐標，以GC3s為橫坐標建立坐標系，根據(jù)基因坐落的位置作散點圖。再利用方程添加其理論標準曲線ENCexp=2+GC3s+29GC3s2+（1-GC3s）2 ，并計算ENCRatio=ENCexp-ENCobsENCexp。根據(jù)散點圖及ENC比值的結果推斷造成密碼子偏好的原因。

1.2.4 最佳密碼子確定 為了確定最優(yōu)密碼子，本文以CAI密碼子偏好性參數(shù)為標準對參試基因進行排序，分別從高低兩端取總數(shù)的1%建立高表達庫和低表達庫，并以高表達庫的RSCU與低表達庫的對應的RSCU的差值為ΔRSCU，以ΔRSCU大于0.08且RSCU大于1的密碼子為最優(yōu)密碼子。

2 結果與分析

2.1 香樟轉錄組選取

為了準確分析香樟密碼子偏好性，本文從NCBI中下載了6個香樟轉錄組測序的結果。但由于許多轉錄組沒有明確注明轉錄組的組織，或者對轉錄測序質(zhì)量比較差的結果進行剔除，最后只剩下SRR6436155一個轉錄組用作本文的實驗數(shù)據(jù)。該轉錄組數(shù)據(jù)量為9.7 G。利用Trinity組裝轉錄組后得到305 Mb序列，利用cd-hit-est命令以默認參數(shù)進一步延伸得到229 Mb。在此基礎上，利用TransDecoder將轉錄組序列與Swissprot和pfam-A數(shù)據(jù)庫同源比對后得到54 Mb數(shù)據(jù)。利用自編perl腳本提取以AUG開頭的37 Mb基因序列用于后續(xù)分析。

2.2 密碼子偏好性參數(shù)

本文利用CodonW軟件（https：//sourceforge.net/projects/codonw/）計算所有參試基因密碼子偏好性參數(shù)。由表1可知，密碼子不同位置堿基的GC含量差異較大，第一位、第二位和第三位密碼子GC含量的變化范圍分別為0.245～0.913、0.179～0.858和0.108～0.939，均值分別為0.511、0.408和0.434;總GC含量的變化范圍為0.273～0.742，均值為0.452; CAI的范圍為0.064～0.401，均值為0.199;CBI的范圍為-0.513～0.364，均值為-0.056;Fop的范圍為0.153～0.634，均值為0.384;Gravy的范圍為-2.747～1.436，均值為-0.259;其氨基酸長度變化范圍86～476 5，均值為366;Aromo的變化范圍為0.000～0.324，均值為0.085。ENC的范圍為26.29～61.00，均值為52.76，在34 931基因中，有80個基因的ENC小于35（Jiang et al.， 2008），其余基因的ENC均大于35，這說明香樟轉錄組中只有極少數(shù)基因偏好性較強，絕大多數(shù)基因的偏好性較弱，甚至有些基因沒有密碼子偏好性。

密碼子偏好性參數(shù)相關性分析結果（表2）表明，GC1、GC2、GC3s與其余參數(shù)都呈極顯著相關;GC3除與Gravy不相關外，與其他參數(shù)均顯著相關。上述說明基因的堿基組成對密碼子偏好性參數(shù)存在一定影響?；蜷L度（N）與基因不同位置的堿基含量極顯著相關，GC1、GC2及GC3的相關系數(shù)從0.145到-0.103，說明基因越長，GC1越高，GC3越低?；蜷L度與CAI無顯著相關;盡管基因長度與密碼子偏好性參數(shù)CBI、Fop、ENC為極顯著相關，但其相關系數(shù)極低，說明基因長度對密碼子偏好影響不大。

RSCU分析結果（表3）表明，RSCU值大于1的密碼子數(shù)目為27個，其中以U結尾的有14個，以A結尾的有8個，以G結尾的有5個;以A或U結尾的密碼子占81.48%。

2.3 中性繪圖

香樟葉片轉錄組基因中性繪圖結果（圖1）表明，GC12的變化范圍為0.271～0.759，GC3變化范圍為0.108～0.939。圖1中代表基因的點有一些落在對角線上，有更多的點偏離對角線，GC12與GC3的相關性不顯著。上述結果綜合表明香樟轉錄組基因密碼子偏好性同時受到突變和選擇的作用。

2.4 ENC-plot繪圖

以ENC作為y軸，以GC3s作為x軸，開展ENC-plot繪圖。將參試基因都布置于該坐標系，GC3s分布于0.077～0.937之間，代表基因的點有的著落在標準曲線的上方，有的著落在標準曲線的下方及另外一部分在標準曲線上（圖2）。為了進一步分析基因分布的具體情況，本文分析了ENC比值的頻率分布（表4），32%的基因分布于-0.05～0.05之間，54.99%的基因分布于0.05～0.15之間，1.66%分布于-0.15～-0.05之間，9.62%分布于0.15～0.25之間，1.67%分布于0.25～0.5之間。說明突變在香樟葉片轉錄組基因偏好性形成過程中起重要作用，而選擇的作用更大。

2.5 最優(yōu)密碼子

按照基因密碼子偏好性參數(shù)CAI數(shù)值大小進行排序，從兩端分別取1%的基因分別建立高表達庫和低表達庫，再分別計算兩個庫的RSCU，進一步計算ΔRSCU。64個密碼子中，有25個密碼子的ΔRSCU大于0.08，其中以G結尾的有3個，以C結尾的有15個，以A結尾的有2個，以U結尾的有5個。結合表3中RSCU大于1的高頻密碼子與表5中標星號的高表達密碼子，從而確定最優(yōu)密碼子。最終確定香樟葉片轉錄組基因中有6個最優(yōu)密碼子分別為GUU、CAG、GAA、UCU、GCU、GGU，其中5個密碼子以A或U結尾，另外1個以G結尾。

3 討論與結論

本文以測序質(zhì)量較高轉錄組數(shù)據(jù)為材料研究香樟密碼子偏好性。在轉錄組數(shù)據(jù)組裝、 延伸去除冗余序列的基礎上，利用TrasnsDecoder結合Swissprot數(shù)據(jù)庫和pfam-A數(shù)據(jù)庫的同源搜索大大提高了捕捉功能開放閱讀框（opening reading framework， ORF）的敏感性和準確性，同時確實也可能存在一些操縱子和嵌合體。然而在目前沒有香樟基因組的情況下，轉錄組基因密碼子分析仍然可以提供重要參考。

64種密碼子編碼20種氨基酸，其中3種終止密碼子，另有AUG和UGG分別只單獨編碼甲硫氨酸和色氨酸，其余59種密碼子編碼18種氨基酸（朱圣庚和徐長發(fā)，2016;Krebs et al.，2018）。18種氨基酸中每種氨基酸至少有2種密碼子編碼，最多的有6種密碼子編碼（Nelson & Cox，2017），由于不同物種或同一物種不同基因組利用不同密碼子編碼同一氨基酸（王鵬良等，2018，2019;賴瑞聯(lián)等，2019），因此產(chǎn)生密碼子使用的偏好性。

香樟葉綠體基因組密碼子偏好性報道表明其密碼子偏好性較弱（秦政等，2018），本文中密碼子偏好性參數(shù)ENC均值為52.76，大于葉綠體基因組的ENC，表明香樟轉錄組基因密碼子偏好性比葉綠體更弱，也就是說在同一密碼子中選擇任意密碼子對翻譯效率和蛋白功能影響較小。RSCU分析表明，香樟轉錄組基因密碼子仍然偏向以A或U結尾。這與橄欖轉錄組密碼子偏好性相似（賴瑞聯(lián)等，2019）。

密碼子偏好受堿基組成、選擇、突變、tRNA豐度、蛋白質(zhì)長度、疏水性和脂肪族氨基酸含量的影響。ENC幾乎與所有的密碼子參數(shù)極顯著相關，相關系數(shù)均低于0.1，與GC2呈極顯著相關，相關系數(shù)為-0.45;而另一密碼子偏好性參數(shù)CAI與不同位置GC含量相關，與氨基酸長度相關性較小，均說明密碼子偏好性與堿基組成有關，氨基酸長度相關性小。CAI與CBI及Fop的緊密相關表明基因選擇高表達的密碼子。中性分析和ENC-plot分析表明突變在密碼子偏好形成中起作用，而選擇在這個過程中起更大作用。本文篩選出6個香樟基因最優(yōu)密碼子分別為GUU、CAG、GAA、UCU、GCU、GGU。最優(yōu)密碼子的確定為利用基因工程技術改良香樟奠定了堅實基礎。

目前，香樟的轉錄組研究、重要基因分子克隆正在迅猛開展。香樟的遺傳轉化體系正逐步完善。施雪萍（2009）將GFP基因轉入香樟體細胞胚中，通過綠色熒光檢測、PCR檢測和Southern blotting檢測證實了GFP基因成功導入香樟基因組中，建立了相對完善的遺傳轉化體系;施雪萍（2009）將Barnase和PaFT基因分別轉入香樟基因組， 然而未對基因轉化的表型效應進行鑒定;王長憲（2009）將沙冬青抗寒基因AmEBP1和AmGS轉入香樟基因組，并通過抗寒能力測定表明，轉基因植株的抗寒能力有所提高。然而施雪萍（2009）和王長憲（2009）都沒有對目的基因的密碼子按照物種最優(yōu)密碼子進行調(diào)整。Young & Purton （2016）報道了不適合的遺傳密碼子在一定程度上降低或阻止轉化目的基因的表達。按照密碼子偏好性結果對轉化目的基因進行密碼子的修飾能夠大大促進基因表達，提高目的基因的應用效果。本研究的成果對利用基因工程技術改良香樟具有重要的指導意義。

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（責任編輯 李 莉）