丁 超，宋莉紅，卜春亞

(北京農(nóng)學(xué)院生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 102206)

朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)別名紅蜘蛛，俗稱“紅蛐”，屬于蜱螨目葉螨科，為多食性害螨，主要寄主是瓜類、豆類等植物，廣泛分布于中國各地[1]。因其具有較強的繁殖能力且近親交配、生存領(lǐng)域小、世代周期短、對環(huán)境適應(yīng)性強、且時常接觸殺蟲劑，導(dǎo)致其產(chǎn)生抗藥性比其他農(nóng)作物害蟲更為嚴重[2]。目前全球市面上最主流的防治方法是依靠化學(xué)農(nóng)藥進行化學(xué)防治，其具有見效快、成本低、面積廣等優(yōu)點，常用的有炔螨特、阿維菌素、氟蟲脲、噠螨靈、吡蟲啉等[1]；該方法有一定的缺點，如易殘留、毒性大，對人體產(chǎn)生危害，噴灑的同時對周圍環(huán)境產(chǎn)生破壞。同時由于朱砂葉螨等害蟲具有易產(chǎn)生抗藥性的特點，極易造成后期難以殺死，需要加大農(nóng)藥的劑量，從而造成惡性循環(huán)。

幾丁質(zhì)脫乙酰基酶(CDA)是參與昆蟲幾丁質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶類，其主要作用是將幾丁質(zhì)脫乙?；纬蓺ぞ厶?，這種修飾可能有助于增強多種蛋白與幾丁質(zhì)特異性結(jié)合的親和力[3]。幾丁質(zhì)是昆蟲生長發(fā)育過程中不可或缺的多糖，對昆蟲的外骨骼、表皮、圍食膜的形成起到重要作用。幾丁質(zhì)脫乙?；冈诶ハx的蛻皮和圍食膜的形成過程中起到關(guān)鍵作用[4-6]。

自1984年初次在魯氏毛霉(Mucorroxianus)的提取物中發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)脫乙酰基酶以來，人們又陸續(xù)在昆蟲、真菌、細菌中發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)脫乙酰基酶的存在[7-10]。Guo等[11]在2005年首次在昆蟲粉紋夜蛾的中腸中發(fā)現(xiàn)并鑒定其幾丁質(zhì)脫乙酰基酶，發(fā)現(xiàn)其在沒有幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域的情況下有很強的幾丁質(zhì)結(jié)合活性并與圍食膜的特性相關(guān)。后來，Arakane等[12]在赤擬谷盜中發(fā)現(xiàn)多種幾丁質(zhì)脫乙?；?，通過對其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)劃分出詳細的幾丁質(zhì)脫乙?；讣易?GroupⅠ-GroupⅤ)，GroupⅠ、GroupⅡ有3個保守區(qū)，GroupⅢ、GroupⅣ有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和乙?；呋Y(jié)構(gòu)域，GroupⅤ只具有乙?；呋Y(jié)構(gòu)域[13]。并通過RNAi的手段驗證部分幾丁質(zhì)脫乙酰基酶對昆蟲生長發(fā)育的影響。

目前研究表明哺乳動物和高等植物中并沒有幾丁質(zhì)脫乙?；?，故而可以利用幾丁質(zhì)代謝相關(guān)生物防治藥物去調(diào)控昆蟲的生長發(fā)育和繁殖，從而達到防治害螨的目的，且對環(huán)境和人類的副作用小，符合綠色農(nóng)業(yè)的理念。該研究旨在克隆朱砂葉螨TecCDA3基因并分析其表達特征，為闡明朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；讣易宓於▓詫嵒A(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試用昆蟲與試劑

供試用昆蟲為北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室培養(yǎng)的敏感品系朱砂葉螨，通過人工種植的白花蕓豆進行飼養(yǎng)，未經(jīng)任何特殊處理，溫度26 ℃±1 ℃，相對濕度50%±10%，光照/黑暗為16 h/8 h，此為朱砂葉螨的最適生長環(huán)境。EasyPure?RNA Kit、TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；X5 High-Fidelity DNA Polymerase PCR Mix、M5 HiPer pTOPO-Blunt Cloning Kit、M5 HiPer Top10 Competent Cell購自北京聚合美生物科技有限公司；FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、FastPure Plasmid Mini Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司；TB Green?Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)購自大連寶生物(Takara)公司。

1.2 朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；窽ecCDA3基因克隆

1.2.1 朱砂葉螨的培養(yǎng) 朱砂葉螨有4個生長時期，分別為卵時期、幼螨時期、若螨時期、成螨時期。用細毛刷挑取約1 000頭生長狀況良好的朱砂葉螨雌成螨到一盆新白蕓豆葉上，將其放回養(yǎng)螨室進行為期24 h的產(chǎn)卵，使用體式顯微鏡觀察產(chǎn)卵數(shù)量，若產(chǎn)卵數(shù)量較多且密集則將葉片上的雌成螨盡數(shù)挑下，使之只剩卵于其葉上，繼續(xù)觀察，約3 d朱砂葉螨由卵發(fā)育至幼螨，約5 d發(fā)育至若螨，約9～10 d發(fā)育至成螨。不同時期的螨均通過自然發(fā)育得到。將同一時間段所有螨均用細毛刷挑至0.02%的吐溫20溶液中進行細分，卵與幼螨使用0.175 mm篩子篩得幼螨，幼螨與若螨使用0.225 mm篩子篩得若螨，若螨與成螨使用0.3 mm篩子篩得成螨。過篩后用清水輕輕沖凈螨身上的吐溫溶液，將篩子倒扣于干燥的干凈吸水紙上吸干水分，通風(fēng)干燥約2 min，待螨可以活動后用細毛刷收集最少10 mg同一時期的螨至1.5 mL離心管中，4個時期共計4個離心管。

1.2.2 朱砂葉螨總RNA提取 將1.2.1中的4個離心管快速置于液氮中，急速降溫約30 s，用電動研磨器將組織研磨成粉末，參照EasyPure?RNA Kit說明書對朱砂葉螨進行總RNA提取。

1.2.3 第一鏈cDNA合成 參照TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明書對朱砂葉螨總RNA進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。

1.2.4 引物設(shè)計 根據(jù)前期獲得的朱砂葉螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過NCBI的Blast找到高同源性物種二斑葉螨，以其幾丁質(zhì)脫乙?；富驗閰⒄眨O(shè)計5′引物和3′引物進行同源克隆，TecCDA3-F為5′-AATCACCACTGAATTTAGCCAAT-3′，TecCDA3-R為5′-TTGGTCAAAAGTGAGATTACTTG-3′。

1.2.5 基因擴增 以朱砂葉螨cDNA為模板進行PCR擴增(50 μL)，體系參照X5 High-Fidelity DNA Polymerase PCR Mix說明書。PCR擴增程序為預(yù)變性95 ℃，3 min；變性95 ℃，10 s；退火54 ℃，15 s；延伸72 ℃，1 min；34個循環(huán)；大延伸72 ℃，5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢驗，對符合大小的產(chǎn)物進行純化，純化后連接至TOPO載體上，轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細胞中，菌液PCR進行驗證，對陽性克隆進行質(zhì)粒提取并送交上海生工生物公司進行測序。

1.3 朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；窽ecCDA3基因特征分析

通過NCBI的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/home/analyze)進行基因開放閱讀框的推導(dǎo)；將朱砂葉螨CDA的CDS區(qū)域翻譯成氨基酸序列后，通過NCBI的Blast工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)軟件進行氨基酸序列同源性比對，使用MEGA7.0系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，使用ML法進行發(fā)育樹構(gòu)建，使用Bootstrap=200的方法進行結(jié)果數(shù)據(jù)的計算；通過SMART(https://smart.embl-heidelberg.de)進行蛋白功能域的預(yù)測；使用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale)進行蛋白疏水區(qū)的分析。

1.4 朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；窽ecCDA3在不同生長時期的表達規(guī)律

1.4.1 不同生長時期朱砂葉螨的RNA提取和cDNA合成 使用全式金EasyPure?RNA Kit試劑盒分別對各個時期的朱砂葉螨進行RNA提取，然后通過全式金TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒以提取的RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4.2 實時熒光定量PCR 用Beacon Designer 7軟件設(shè)計TecCDA3基因的RT-qPCR引物，同時設(shè)計一對β-actin基因為內(nèi)參，引物見表1。

表1 TecCDA3熒光定量引物設(shè)計Tab.1 Design of RT-qPCR primers for TecCDA3

分別以朱砂葉螨4個時期的cDNA為模板，參照Takara公司的TB Green?Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)說明書對熒光定量體系進行配置，PCR反應(yīng)條件為二步法PCR。95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。單次試驗中每個樣本設(shè)置3次重復(fù)，同時設(shè)置陰性對照，陰性對照重復(fù)2次。程序設(shè)置使用相對定量△△Ct法，CT值使用2-△△Ct法計算其相對表達量，設(shè)定EGG時期為參照，相對表達量為1，使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行顯著差異性分析，采用單因素方差分析(ANOVA)并采用Tukey's HSD算法進行分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；窽ecCDA3基因克隆

以朱砂葉螨cDNA為模板擴增得到與預(yù)期大小相一致的基因，大小約為1.6 kb。通過NCBI的ORF Finder工具分析TecCDA3的開放閱讀框，見圖1。TecCDA3包含一個長度為1 611 bp的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，共編碼536個氨基酸，以5′端的起始密碼子ATG開始編碼蛋白，TAA為其終止密碼子，蛋白分子量為62.07 kD。命名為TecCDA3(Genbank：MK779705)。

2.2 TecCDA3氨基酸序列同源比對分析

使用NCBI的Blast工具進行篩選，得到多組高同源性物種的氨基酸序列，用MEGA7.0軟件對二斑葉螨(Tetranychusurticae)、赤擬谷盜(Pseudostellacrassipes)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)的CDA3氨基酸序列與朱砂葉螨TecCDA3進行同源比較，得到圖2。比對結(jié)果顯示朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；概c二斑葉螨具有最高的同源性；使用SMART在線工具對朱砂葉螨TecCDA3的氨基酸序列進行蛋白結(jié)構(gòu)域分析，TecCDA3含有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ChBD)，低密度脂蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LDLa)和多糖多乙?；呋Y(jié)構(gòu)域(Polysaccharide deacetylase)。Group Ⅱ型幾丁質(zhì)脫乙?；妇羞@3種催化結(jié)構(gòu)域，并且呈現(xiàn)高度的保守性。TecCDA3蛋白從第12個氨基酸到第31個氨基酸之間有明顯跨膜結(jié)構(gòu)，共計20個氨基酸，表明其為跨膜蛋白，但是其并不含有信號肽位點。

2.3 TecCDA3的疏水性分析

通過ProtScale在線軟件在線對朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；傅氖杷赃M行分析預(yù)測，結(jié)果如圖3。當(dāng)Score>0的得分時表示該區(qū)域為疏水性，當(dāng)Score<0的得分時表示該區(qū)域為親水性，得分絕對值越高表明相對的親疏水性越高。TecCDA3的氨基酸序列中均含有親水區(qū)域和疏水區(qū)域，且分布總體上來說較為均勻，但是可以明顯看出處于Score<0的得分區(qū)域要多于Score>0的得分區(qū)域，故而總體上來說屬于親水蛋白，計算平均疏水性為-0.403，與預(yù)測的結(jié)果一致，為親水性蛋白。

2.4 分子進化樹構(gòu)建

發(fā)育樹主要選取包括朱砂葉螨在內(nèi)的多種物種的幾丁質(zhì)脫乙酰基酶，如圖4。通過發(fā)育樹的構(gòu)建可以看出，TecCDA3與同屬蜱螨目的二斑葉螨的幾丁質(zhì)脫乙?；赣H緣性最高，由于高度的序列相似性，其遺傳距離十分相近。命名為TecCDA3，除此之外可以看出朱砂葉螨的幾丁質(zhì)脫乙?；概c蜱螨目的物種親緣關(guān)系最近，如柑橘全爪螨(Panonychuscitri)、二斑葉螨(Tetranychusurticae)，它們處于同一條分支上；與黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)等相對遺傳距離較近；與家蠶(Bombyxmori)、中華稻蝗(Oxyachinensis)等相對遺傳距離較遠。通過構(gòu)建的發(fā)育樹可以明顯看出幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基因家族的分布，為GroupⅠ至GroupⅤ，其中TecCDA3屬于Group Ⅱ。

2.5 TecCDA3基因在朱砂葉螨不同生長時期的表達規(guī)律

將得到的數(shù)據(jù)通過2-△△Ct法計算朱砂葉螨在4個生長時期相對表達量，結(jié)果通過Origin軟件進行作圖，見圖5。朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；冈?個生長時期(卵時期、幼螨時期、若螨時期、成螨時期)的mRNA豐度的相對差異，該試驗使用的內(nèi)參基因為β-actin，其作為看家基因在細胞中的表達量較為穩(wěn)定。TecCDA3在朱砂葉螨各個生長時期均有表達，但是表達量之間具有顯著差異，TecCDA3在成螨時期表達量達到最高，在幼螨時期表達量最低，在卵時期的表達量要高于若螨時期，整體呈現(xiàn)出一種先下降后上升的表達趨勢。

3 討 論

目前在中華稻蝗(O.sinensis)、赤擬谷盜(T.castaneum)、意大利蜂(I.bee)、黑腹果蠅(D.melanogaster)、岡比亞瘧蚊(A.gambiae)、柑橘全爪螨(C.citris)、家蠶(B.mori)、云山卷葉蛾(S.budworm)、褐飛虱(Nilaparvatalugens)、柑橘木虱(D.citri)等多種昆蟲中均發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)脫乙酰基酶。其中赤擬谷盜最高的含有9種亞型基因，但并不是所有昆蟲都具備全部的9種亞型基因。這9種亞型被分為5個家族，這5個家族中目前研究最多的是Group Ⅰ，該家族基因被證實具有參與昆蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)代謝的作用，影響昆蟲胚胎表皮的形成和氣管幾丁質(zhì)的排列[14]。對其余的4個家族目前研究較少。

幾丁質(zhì)脫乙酰基酶TecCDA3為親水性蛋白，具有一個跨膜結(jié)構(gòu)，無信號肽。由于不具備信號肽可能造成無法引導(dǎo)蛋白到達細胞含不同膜結(jié)構(gòu)的亞細胞器內(nèi)，導(dǎo)致其無法加工。發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列中含有3種不同的結(jié)構(gòu)域，分別為幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ChBD)、多糖多乙酰基催化結(jié)構(gòu)域(Polysaccharide deacetylase)和低密度脂蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LDLa)，且具有高度的保守性。分子進化樹分析可知，朱砂葉螨與二斑葉螨的親緣性最高。根據(jù)幾丁質(zhì)脫乙?；妇邆涞?個保守區(qū)域數(shù)目以及同源比對結(jié)果將TecCDA3歸類為Group Ⅱ家族。目前的研究表明赤擬谷盜TcCDA3在成蟲的胸肌中特異性表達[13]。NlCDA3為褐飛虱的腸道特異性幾丁質(zhì)脫乙?；?，在褐飛虱的各個生長發(fā)育階段均有較高的表達[15]。柑橘木虱DcCDA3在其外表皮和3日齡若蟲中含量最高，且表達水平與20-hydroxyecdysone的催化有關(guān)[16]。該研究的TecCDA3與北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室先前研究的與控制蛻皮有關(guān)的TecCDA1和TecCDA2之間的表達量存在著顯著差異，TecCDA1和TecCDA2均在卵時期有最高或較高的表達量，而TecCDA3則在卵時期相對表達量較低，在成螨時期表達量最高，這可能暗示其功能上的差異，其對朱砂葉螨是否具有影響蛻皮功能還有待進一步探究。該試驗結(jié)果豐富朱砂葉螨幾丁質(zhì)脫乙?；富蚣易?，為基于靶向殺蟲基因的篩選提供理論和實踐依據(jù)。