王俊朋 ， 張立攀 ， 王春杰 ， 李 冰 ， 趙夢瑤 ， 關(guān)炳峰 ， 胡桂芳

(河南省商業(yè)科學研究所有限責任公司 ， 河南 鄭州 450000)

杜仲是杜仲科植物，屬于我國特有品種，是一種珍貴的中藥材。杜仲在中國已有2 000多年的歷史，我國的杜仲種植面積廣泛，資源豐富。杜仲全身是寶，研究表明杜仲的種、皮、根、籽、葉等都具有很高的功能活性。杜仲皮和杜仲膠目前已經(jīng)被廣泛開發(fā)應(yīng)用，而杜仲葉的利用率卻很低。杜仲葉活性成分復雜，包括環(huán)烯醚萜類化合物、木脂素類化合物、黃酮類化合物、杜仲膠、苯丙素類化合物、酚類化合物、氨基酸、多糖類物質(zhì)、維生素、脂肪酸，具有抗氧化、抗疲勞、降血脂等功效。中醫(yī)很多古籍有載杜仲入肝、腎，有補中益氣、堅筋骨、強志、安胎之功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)杜仲有降壓、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老、抗突變、抗癌、抑制細菌、抗病毒、抗真菌、增強免疫力、利尿、減肥作用，以及有利于骨骼健康的作用[1-5]。

然而，目前針對杜仲的資源開發(fā)應(yīng)用比較狹隘，主要局限于杜仲皮和杜仲膠，杜仲自古以來將杜仲皮入藥使用。杜仲膠作為一種天然高分子材料，和合成橡膠成分類似，常用于航空、航天、國防、化工等領(lǐng)域，因其具有獨特的結(jié)構(gòu)和性能。而資源更為豐富的杜仲葉卻尚未被深度開發(fā)利用，因缺乏有效的加工方式，造成資源的浪費[6]。研究表明杜仲葉(Eucommia Folium)與杜仲皮活性功能成分和藥理作用一致。目前已知的經(jīng)過分離純化并鑒定出來的杜仲有機化合物約有70種以上，礦物質(zhì)達15種以上。杜仲屬于可再生利用資源，主要分布于我國河南、陜西、甘肅、湖北等地，種植面積廣泛，產(chǎn)量巨大。杜仲葉中含有豐富的活性成分，如黃酮、綠原酸等，近年來總黃酮的研究一直都備受關(guān)注。研究表明，杜仲不同部位的總黃酮含量差別很大，以老葉中總黃酮含量最高。如果能夠?qū)S酮類化合物的藥用價值進行充分開發(fā)利用，將杜仲的天然成分應(yīng)用到各行業(yè)領(lǐng)域，那么對整個食品行業(yè)會具有積極的助推作用[7-9]。

本文對杜仲葉的化學成分、黃酮類化合物的提取方法、黃酮類化合物的分離純化、功能活性研究等進行綜述，期望對杜仲葉中黃酮類化合物的綜合開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 杜仲化學成分分析

杜仲各部位的主要成分基本相似，經(jīng)實驗檢測分析從杜仲皮、葉中分離得到的化學成分如下：木脂素及其苷類、環(huán)烯醚萜類成分、杜仲膠、甾萜類化合物、酚類化合物、脂肪酸、維生素、氨基酸及微量元素、黃酮類化合物等。其中黃酮類化合物主要包括槲皮素、莰菲醇、山奈酚、紫云英苷、陸地錦苷以及3-O-[β-D-吡喃葡糖-(1-2)-β-D-吡喃木糖]-槲皮素黃酮苷等[10]。

2 杜仲葉黃酮類化合物的提取

目前杜仲葉中總黃酮的提取方法主要有水提法、溶劑法、超聲波提取法、微波提取法、超臨界CO2萃取法、酶解法和半仿生提取法[11]。

2.1 水提法

水提法是利用水蒸氣和被蒸餾組分不相容的原理，使被分離物質(zhì)能在比原沸點低的情況下隨著水蒸氣一起逸出。將杜仲葉粉碎后，按一定的料液比浸入水中，在適宜的溫度下浸提一定時間，從而得到含有杜仲葉有效成分的浸提液。水提法以水為溶劑，利用黃酮類化合物易溶于水的原理進行提取。水提法提取液黏度大，過濾濃縮困難，提取物容易發(fā)生霉變。張亦琳等[12]利用雙水相分離純化杜仲黃酮類化合物，經(jīng)過條件優(yōu)化得在50%的乙醇濃度，20%質(zhì)量分數(shù)的KH2PO4情況下，杜仲葉總黃酮的萃取率達77.94%。何德飛等[13]利用水提法提取杜仲葉中總黃酮，發(fā)現(xiàn)料液比1∶16，萃取時間24 h，杜仲葉有效成分溶出最多。

2.2 溶劑法

溶劑法是一種傳統(tǒng)的提取方法，根據(jù)原料中被提取成分的理化性質(zhì)及極性特征，利用相似相容的原理將其中的有效成分從固體組織中轉(zhuǎn)移到液體或氣體中。杜仲葉中黃酮不僅易溶于水，通過水提方法分離，還易溶于乙醇、甲醇、乙醚等有機溶劑。劉軍海等[14]用丙酮-水為溶劑提取杜仲葉中黃酮，在料液比1∶16，提取溫度65 ℃，提取時間2 h時最佳，最佳提取率達1.86%，總黃酮含量10.96%。杜仲中的活性成分多數(shù)是溶于極性物質(zhì)的，乙醇是使用最普遍的一種有機溶劑，但是由于提取過程雜質(zhì)較多，對后期的純化不利。趙文紅[15]通過醇提杜仲葉中黃酮類化合物，得出最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度50%，80 ℃下回流60 min，黃酮得率為3.18%。

2.3 超聲提取法

超聲提取法原理是利用超聲波輻射產(chǎn)生的空化、震蕩、乳化、擴散等多級效應(yīng)，使物料的細胞壁加速破裂，增大穿透力，使溶劑進入細胞內(nèi)，達到提取的目的。黃酮類化合物屬于胞內(nèi)物，傳統(tǒng)的水提和醇提工藝提取率較低，因此需要破壞細胞壁才可以增加其溶出率。王柏強等[16]通過單因素和正交試驗優(yōu)化超聲波輔助提取杜仲葉黃酮的工藝，分別選擇纖維素酶用量為30 mg，料液比1 g∶30 mL，酶解pH值5.0，酶解溫度45 ℃作為影響因素，然后在溫度50 ℃下超聲15 min。此工藝條件下，總黃酮提取率為3.08%。與傳統(tǒng)提取方法比起來具有提取條件溫和，溶劑用量少，有效成分提取率高，減少環(huán)境污染等優(yōu)點。袁英髦等[17]通過超聲輔助提取杜仲皮中的黃酮，發(fā)現(xiàn)超聲頻率控制在40 kHz時，隨著功率的升高、時間的延長提取率呈增長趨勢。超聲輔助提取法振蕩頻率增加會加速有效成分在溶劑中的擴散和溶出，能夠大幅度的縮短溶劑提取時間，降低提取溫度，提高黃酮的提取率[18]。超聲波還適用于對熱敏感的成分提取。超聲波提取法的特性有：①超聲波在氣液固三種介質(zhì)中均可以有效的傳播，應(yīng)用范圍廣泛。②超聲波通過傳播高能量達到破壞細胞壁的目的。③超聲波會產(chǎn)生一些反射、疊加和共振等現(xiàn)象，在傳播介質(zhì)中會產(chǎn)生沖擊或空化，加速傳播速度。

2.4 微波提取法

微波提取法的原理是利用微波輻射穿透溶劑到達細胞內(nèi)，產(chǎn)生的磁場能加速被萃取成分快速從固體向固液界面轉(zhuǎn)移，微波的振動頻率和分子的振動頻率相關(guān)聯(lián)，迅速產(chǎn)生熱能加速被提取物質(zhì)分子的熱運動，使細胞壁快速破壞，從而提高有效成分的溶出率和提取率。劉桂萍等[19]以杜仲葉粉為原料，通過單因素和正交實驗確定微波輔助提取黃酮的工藝條件，當料液比1∶25，功率320 W，提取時間2.5 min時提取率可達8.7%。該方法作為一種新型提取工藝，其最大的特點就是能促使極性分子加速溶出，加熱迅速、節(jié)能、環(huán)保、方便操作控制，能縮短提取時間，非常適合應(yīng)用于杜仲葉黃酮工業(yè)化提取，但是該方法不適用于非極性物質(zhì)的提取。

2.5 超臨界CO2萃取法

傳統(tǒng)的溶劑法具有高提取率的優(yōu)點，但是也有需要回收溶劑的缺點，而且對提取溫度要求比較高。超臨界CO2利用是指處于超臨界狀態(tài)的CO2作為溶劑應(yīng)用于對物料進行分離提取的一種技術(shù)，優(yōu)點是萃取時間短、節(jié)能費用、環(huán)保。超臨界萃取是通過溫度和壓力調(diào)節(jié)控制其溶解性的。王華芳等[20]以杜仲葉為原料，通過研究超臨界CO2萃取黃酮的工藝條件得到萃取溫度50 ℃，萃取壓力30 MPa，萃取時間120 min時，提取率達10.55%。

此方法具有諸多優(yōu)點：①萃取速度高于液體萃取，比較適合提取固體物料中的有效成分。②能耗低，適合應(yīng)用于熱敏性、易氧化物質(zhì)的提取。③溫度容易控制，熱量傳播速度快。④針對一些易揮發(fā)性成分也能達到分離的目的[21]。

2.6 酶解法

中草藥成分復雜，包括蛋白質(zhì)、果膠、植物纖維等多種非必需成分，植物細胞壁和這些成分會阻礙一些被提取有效成分的溶出，利用酶反應(yīng)去除一些特定結(jié)構(gòu)可用于提高有效成分的釋放速度。酶解法提取是通過合適的酶來處理杜仲葉，使組成杜仲葉細胞的纖維素、果膠等成分遭到破壞，從而提高胞內(nèi)有效成分的溶出速率。陳曉娟等[22]通過酶法提取杜仲葉中黃酮，分別考察果膠酶用量、酶解時間、料液比、pH值等因素，并通過正交試驗得出最佳工藝參數(shù)，在果膠酶用量1.5 mL，80 ℃下酶解2 h時，黃酮得率為0.043%。酶解法提取具有專一性強、反應(yīng)條件溫和、提取效率高、節(jié)能等特點，能夠使有效成分快速溶解，在成分復雜的中藥材提取方面具有重大的應(yīng)用意義[23-24]。

2.7 半仿生提取法

半仿生提取法(簡稱SBE法)，主用用于中藥制劑。半仿生法是將藥料使用酸水和堿水順序提取，繼而將提取液分別過濾、濃縮，制成制劑，利用模擬口服給藥及藥物經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運的原理，為經(jīng)消化道給藥的中藥試劑提供的一種提取工藝。以杜仲葉為原料，以磷酸氫二鈉-檸檬酸的緩沖溶液作為提取液，通過正交試驗優(yōu)化半仿生法提取黃酮工藝，當杜仲葉∶提取液=1∶20時，最終黃酮的得率為0.044%[25]。半仿生提取法的特點：①提取過程符合中醫(yī)配伍、臨床用藥特點、口服藥物在胃腸道的轉(zhuǎn)運特點；②最大限度地保留有效成分，并且活性成分損失較少；③不僅能使混合物充分發(fā)揮其綜合作用，又能利用單體成分控制質(zhì)量。因此，該方法在中藥的有效成分提取和配方研究中有良好優(yōu)勢和廣泛的應(yīng)用前景[26]。

3 杜仲中黃酮類化合物的分離純化

3.1 薄層層析色譜法

馬柏林等[27]以十二烷基硫酸鈉-正丁醇-正庚烷-水微乳液作為展開劑，通過聚酰胺薄層色譜對杜仲葉黃酮進行簡單分離，效果良好。

3.2 大孔吸附樹脂

大孔吸附樹脂是一類不含交換基團的有機高分子聚合物，是柱色譜常用的一種吸附劑，因其處理量大、分離效果好而被廣泛應(yīng)用于黃酮類物質(zhì)的分離純化。付桂明等[28]通過大孔樹脂對杜仲葉黃酮物質(zhì)進行富集純化，發(fā)現(xiàn)AB-8樹脂的吸附率和解吸率最高，黃酮質(zhì)量分數(shù)從10.2%升到42.6%。潘瑩[29]篩選D101-1大孔樹脂吸附純化杜仲黃酮，分離純化效果顯著，使純度升為54.43%。張玲等[30]對杜仲葉黃酮類化合物進行分離純化，從9種樹脂中篩選純NKA-Ⅱ，分離效果良好，最終得到4種組分，分別為綠原酸、金絲桃苷或陸地錦苷、槲皮素-乙酰糖苷和槲皮素。

4 杜仲中黃酮類化合物的生物活性

黃酮類化合物廣泛分布在植物中，因其結(jié)構(gòu)的多樣性以及不同的類型，所表現(xiàn)出生物活性和功能也不相同，具體如下。

4.1 抗氧化活性

黃酮類化合物屬于多酚類物質(zhì)，抗氧化活性強，基本無毒副作用。黃酮類化合物的抗氧化機制主要表現(xiàn)在以下兩方面：①鏈的中斷機制，黃烷和原花青素等黃酮類化合物在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中能切斷自由基鏈，以達到抗氧化的目的。②促使產(chǎn)生自由基的催化劑失活，對體內(nèi)酶的作用，黃酮類化合物分子中富含酚羥基，與酶蛋白分子結(jié)合，抑制相關(guān)酶的活性。對金屬離子的作用，黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)中的羰基或相鄰的羥基可以與金屬離子形成五元或六元的配合物，從而清除引發(fā)活性自由基產(chǎn)生鏈反應(yīng)的催化劑。羅飛華等[31]對杜仲葉黃酮提取物進行抗氧化活性分析，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有較強的還原能力，具有顯著的超氧陰離子清除能力。

4.2 抗疲勞活性

楊津等[32]通過動物實驗研究杜仲葉中黃酮類化合物對小鼠抗疲勞作用的影響，通過觀察對照組和黃酮苷給藥組，發(fā)現(xiàn)黃酮苷給藥組負重游泳時間延長，小鼠血清中超氧化物歧化酶含量升高，說明杜仲葉黃酮苷具有顯著的抗疲勞作用。

4.3 降血糖活性

沈伊濛等[33]通過正交試驗研究杜仲葉黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶活性的影響，并對杜仲葉黃酮含量進行分析測定，含量達18.12%。邢冬杰等[34]探討杜仲葉黃酮對高血糖火鼠血糖的控制，建立糖尿病大鼠模型，設(shè)定實驗組和對照組，每日給藥連續(xù)28 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)杜仲葉黃酮能明顯降低糖尿病大鼠中胰腺組織的丙二醛水平，升高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶水平。

4.4 降血脂活性

杜仲葉黃酮的降血脂作用，通過建立動物模型，并進行分組給藥按照大中小三種劑量的黃酮水平分別對實驗組灌胃操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥組的血漿總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇含量等顯著降低，高密度脂蛋白膽固醇、過氧化氫酶等有所上升，證明黃酮對降血脂具有顯著效果。雷燕妮等[35]探索杜仲葉黃酮降血脂作用，通過建立高血脂動物模型，分析對照組和高血脂模型組的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)杜仲葉總黃酮能顯著降低高血脂小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇的含量，高密度脂蛋白膽固醇的含量有升高趨勢，說明其具有顯著的降血脂作用。

4.5 降血壓活性

雷燕妮等[36]采用微波輔助法提取杜仲葉黃酮類化合物，并建立高血壓小鼠動物模型，通過對照組和給藥組結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物能顯著降低給藥組的血壓水平。目前杜仲中已知的降血壓成分為脂素類、苯丙素類、環(huán)烯醚萜類和黃酮類[37]。

5 展望

杜仲是我國獨有的經(jīng)濟物種，資源豐富，杜仲的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用主要在生態(tài)園林綠化、醫(yī)療保健和食品開發(fā)、橡膠的應(yīng)用等，杜仲在食品領(lǐng)域的應(yīng)用主要是功能食品開發(fā)。杜仲皮、杜仲膠目前已經(jīng)達到了很高的產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用，但是資源豐富的杜仲葉并未被全面開發(fā)應(yīng)用，長期以來，杜仲葉被用于動物飼料，造成資源極度浪費[38]。杜仲葉化學成分復雜，很多被研究證明具有藥理活性，如抗氧化、抗疲勞、降血壓、降血脂等[39]。但是其在臨床試驗中使用范圍較窄，導致杜仲中成藥品種較少。目前很多的活性功能機理研究還不夠透徹，本文以杜仲葉中黃酮類化合物為例，對其提取工藝、分離純化方法、功能活性等進行匯總。研究證明杜仲葉黃酮類化合物具有很多功能活性，但是目前機理尚不明晰，需要進一步的研究充分證明。筆者認為，杜仲葉的應(yīng)用方向主要為：①將杜仲葉的活性成分進行分離純化鑒定，如杜仲葉黃酮類化合物的純化鑒定及功能活性分析；②開發(fā)出更多的杜仲葉功能性食品，如杜仲茶、杜仲飲料、杜仲酒等。21世紀大健康食品和營養(yǎng)食品發(fā)展空間巨大，目前人們對純天然的植物產(chǎn)品備受青睞，這給杜仲葉產(chǎn)品的開發(fā)帶來很大的機遇和挑戰(zhàn)，對大健康產(chǎn)業(yè)也具有很大的助推作用。